Imunologický výzkum v urologii

Přiřazení imunogramu urologickému pacientovi znamená, že ošetřující lékař předpokládá přítomnost poruch v imunitním systému. Duplicitní bakteriální, virové, plísňové infekce, alergické reakce, systémová onemocnění mohou být příznaky těchto poruch, které se vyznačují řadou syndromy (infekce, rakoviny, alergických, autoimunitních, lymfoproliferativní). Jeden pacient může mít několik syndromů. Například, chronické infekční choroby (infekční syndrom) může způsobit selhání imunity a imunity se může projevit predispozice k infekčních chorob a rakoviny (Cancer syndrom). Předispozice k infekcím může nastat na pozadí sekundární imunodeficience, která se vyvinula jako důsledek lymfoproliferativního onemocnění, například leukémie. Existují tři hlavní skupiny patologických změn v imunitním systému:

• kvantitativní nebo funkční nedostatečnost jednoho nebo jiného spojení imunity, která vede k rozvoji stavu imunodeficience;
• porušení v rozpoznání antigenu imunitním systémem, což vede k rozvoji autoimunitních procesů;
• hyperreaktivní nebo "zvrácenou" imunitní odpověď, projevovanou vývojem alergických onemocnění.

K dispozici jsou screening (testy úrovně 1) a kvalifikační (testy dvoustupňové) metod imunodiagnostiky. První existují k opravě porušení v imunitním systému, druhý - k vytvoření mechanismů, které se podílejí na jejich realizaci za účelem další imunokorce.

B-Buněčné spojení imunity

Metody screeningu

• Stanovení relativní a absolutní počtu B-lymfocytů pomocí imunofluorescence nebo průtoková cytometrie s použitím monoklonálních protilátek k B-buněčné antigeny (CD19, CD20, vyznačující se tím, CD - shluk diferenciace). Obsah B-lymfocytů je u dospělých normální: 8-19% z celkového počtu leukocytů nebo 190-380 buněk / μl. Zvýšení obsahu B lymfocytů se vyskytuje v akutní a chronické bakteriální a plísňové infekce, chronické onemocnění jater, systémová onemocnění pojivové tkáně, chronická lymfocytární leukémie, mnohočetný myelom.
• Stanovení koncentrace imunoglobulinů nespespetsificheskih (F, M, G, E) jednoduchou radiální imunodifuze nebo turbometrii nefelometrie, radioimunotestu nebo enzymovým imunotestem (EIA). Normy pro dospělé: imunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g / l. IgM 03-3,7 g / l. IgG 8,0 až 17 g / l. Zvýšení koncentrace imunoglobulinů nastává při stejných patologických stavech, při nichž dochází ke zvýšení obsahu B lymfocytů. Snížení koncentrace imunoglobulinů je vrozené hypogamaglobulinémie, nádory imunitního systému, odstranění sleziny, ztráty bílkovin, při onemocnění ledvin nebo střev, léčbu cytostatiky a immunodepreesantami.

Určení metod

• Stanovení cirkulujících imunitních komplexů v krvi selektivní srážením v polysilylglykolu s následným spektrofotometrickým testováním hustoty (normální 80-20 UE). Zvýšená cirkulujících imunokomplexů je charakteristický pro akutní bakteriální, mykotické, virové infekce, autoimunní, imunokomplexy onemocnění, sérové nemoci, alergické reakce typu 3;
• Stanovení specifických imunoglobulinů v krvi ve vztahu k bakteriální a virové antigeny, deoxyribonukleová kyselina (DNA) v autoimunitních onemocnění, identifikaci spermií (autoimunitní neplodnosti) a protivopochechnyh protilátek (pyelonefritidy a glomerulonefritida) radiální imunodifúzí nebo ELISA.
• Stanovení antispermových protilátek v spermatu [MAR-test (směsná antiglobulinová reakce)], norma je negativní.
• Stanovení koncentrace imunoglobulinů v moči za účelem diferenciální diagnózy mezi pyelonefritidou a glomerulonefritidou (selektivita proteinurie).
• Stanovení IgE v prostatické šťávě pro diagnostiku alergické prostatitidy radiální imunodifuzí nebo ELISA. 
• Výzkum reakce blasttransformation reakci B lymfocytů na B-buňky mitogenem (pokeweed mitogenem pro stimulaci blasttransformation reakci B lymfocytu v přítomnosti T-lymfocytů), přičemž standardní hodnota 95-100%.

T-buněčné spojení imunity

Metody screeningu

• Stanovení relativní a absolutní počet zralých CD3 T lymfocytární reakci pomocí imunofluorescence nebo průtokovou cytofluorometrií použitím anti-SDZ monoklonální protilátky. Norma pro dospělé je 58-76% nebo 1100-1700 buněk / μl. Snížení počtu T-lymfocytů imunity indikátor selhání buněk. To je charakteristické pro několik sekundárních a primární imunodeficience (chronické bakteriální a virové infekce: tuberkulóza, syndrom získaného selhání imunity, rakovina, chronické selhání ledvin, trauma, stres, stárnutí, podvýživa, léčbu cytotoxickými léky, ionizující záření). Zvýšení počtu T-lymfocytů, je v kontextu imunitního hyperaktivitou nebo lymfoproliferativní onemocnění. Při zánětu počtu T-lymfocytů se nejprve zvýší a pak se spustí. Absence poklesu T-lymfocytů naznačuje chronickou léčbu zánětlivého procesu.
• Posouzení subpopulací lymfocytů.
  • Stanovení počtu T-pomocníků (anti-CD4 protilátka). Obvykle je 36-55% nebo 400-1100 buněk / μl. Zvýšení počtu těchto buněk dochází u autoimunitních onemocnění, Waldenstromovu onemocnění, imunitní aktivace antitransplantatsionnogo; snížení počtu T-pomocných buněk se vyskytuje v chronické bakteriální, virové, protozoální infekce, tuberkulóza, syndrom získané imunitní nedostatečnosti, malignit, popáleniny, poranění, podvýživa, stárnutí, léčbu cytostatiky, ionizující záření.
  • Stanovení počtu T-supresorů (protilátka proti CD4). Normálně je to 17-37% nebo 300-700 buněk / μl. Zvýšení počtu T-supresorů nastává za stejných podmínek, kdy počet T-pomocníků klesá a jejich pokles za stejných podmínek, kdy se zvyšuje obsah T-pomocníků.
  • Imunoregulační index CD4 / CD8, v normě 1,5-2,5. Hyperaktivita v dávkách vyšších než 2,5 (alergické a autoimunitní onemocnění); hypoaktivita - méně než 1,0 (predispozice k chronickým infekcím). Na počátku zánětlivého procesu vzrůstá imunoregulační index a po jeho poklesu se normalizuje.

Určení metod

• Stanovení počtu přirozených zabijáků (NK buněk) - protilátek proti CD16 a anti-CD56. Norma pro CD 16-lymfocyty je 6-26%, CD56 - 9-19%. Zvýšení počtu NK-buněk se vyskytuje v odmítnutí štěpu, snížit - u virových infekcí, rakoviny, primární a sekundární imunodeficience, popálenin, poranění a stresu, léčbu cytostatiky a ionizujícího záření. 
• Stanovení počtu T-lymfocytů s receptorem pro interleukin-2 (aktivační marker) - anti-CD25 protilátky. Norma je 10-15%. Zvýšení jejich počtu je pozorováno při alergických onemocněních, odmítnutí transplantátu, reakce na antigeny závislé na thymusu v akutním období primární infekce, snížení stejných onemocnění, při nichž počet NK buněk klesá.
• Zkouška exprese aktivačního markeru - histokompatibilní molekula třídy II HLA-DR. Zvýšená exprese nastává u zánětlivých procesů u pacientů s hepatitidou C, celiakií, syfilisem, akutními respiračními infekcemi.
• Vyhodnocení apoptózy lymfocytů. Údaj o připravenosti lymfocytů apoptózy mohou být identifikovány pomocí jejich exprese povrchových Fas-receptoru (CD95) v mitochondriích a BD-2 protoonkogenu. Apoptóza byla hodnocena zpracování lymfocytů dvěma fluorescenčními barvivy: propidium jodidem, který se váže na fragmenty DNA a annexinu Y, vazba k fosfatidylserinu na buněčné membráně se objeví na začátku apoptózy. Vyhodnocení výsledků se provádí na průtokovém cytofluorimetru. Vykazování výsledků na základě podílu buněk obarvených s různými barvivy. Unstained buňky jsou životaschopné buňky, spojené pouze s annexinu Y, - první známky apoptózy, s propidium jodidem a annexin I - pozdní projevy apoptózy, barvení pouze propidiumjodidu označuje nekrózu.
• Vyhodnocení proliferace T-lymfocytů in vitro.
  • Změna buněčné blastogeneze je reakcí blast-transformace lymfocytů. Leukocyty se inkubují s jakýmkoliv mitogenem rostlinného původu (lektiny). Více běžně používaný phytohemaglutinin po dobu 72 hodin, pak uděláte rozmazanou barvu, zbarvíte ji a počítáte počet výbuchů! Stimulační index je poměr procentuálních zastoupení transformovaných buněk v experimentu (kultura s fytohemaglutininem) na procentu transformovaných buněk v kontrolním vzorku (kultura bez fytohemaglutininu). Reakce blast-transformace lymfocytů může být hodnocena začleněním radioaktivní značky (ZN-thymdin) do kultivovaných buněk, protože při rozdělení buněk vzrůstá syntéza DNA. Poruchy proliferační odpovědi se vyskytují jak u primárních, tak u sekundárních imunodeficiencí spojených s infekcemi, onkologickými onemocněními, renální insuficiencí a chirurgickými zákroky.
  • Vyhodnocení těchto studiích exprese aktivačních markerů (CD25, receptoru transferinu na - CD71) molekul a MHC třídy II, HLA-DR, které jsou v podstatě nepřítomné na klidových T-lymfocyty. T lymfocyty stimulované fytohemaglutininem po 3 dnech exprese aktivačních markerů byly analyzovány přímou nebo nepřímou imunofluorescencí, průtoková cytometrie s použitím monoklonálních protilátek vylučovaných receptory.
  • Měření množství mediátorů syntetizované aktivovanými T lymfocyty [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, gama-interferon, atd.], Radioimunoanalýzou nebo testem ELISA. Zvláště důležité je vyhodnocení koncentrace y-interferonu a IL-4 jako markerů TH a Th2 v supernatantu aktivovaných kultur a uvnitř buňky. Pokud je to možné, je vhodné pro stanovení exprese genu pro příslušnou cytokinu úrovni mediátorové ribonukleové kyseliny v threoninu produkujících buněk a exprese receptoru intenzit pro příslušné cytokiny.
    
• Reakce inhibice migrace lymfocytů. Citlivé T-lymfocyty v reakci s lymfokiny uvolňujícími antigen, včetně faktorů. Inhibuje migraci lymfocytů. Fenomén inhibice je pozorován, když jsou mitogeny zavedeny do kultury buněk. Vyhodnocení stupně inhibice umožňuje posoudit schopnost lymfocytů uvolňovat cytokiny. Obvykle je frekvence migrace v závislosti na specifickém mitogenu 20-80%.
• Vyhodnocení cytotoxicity NK buněk. Stanovte schopnost přirozených zabijáckých buněk zabíjet cílové buňky erythromyeloidní linie K-562. Pokud se vyhodnotí cytotoxicita závislá na protilátce, použijí se cílové buňky potažené protilátkami IgG. Cílové buňky jsou značeny 3H-uridinem a inkubovány s efektorovými buňkami. Smrt cílových buněk se odhaduje z uvolnění radioaktivní značky do roztoku. Snížení cytotoxicity nastává u maligních novotvarů. V některých případech, pokud je požadována prognóza účinnosti léčby interleukiny, je cytotoxicita NK buněk vyhodnocována, když jsou inkubovány s některými cytokiny.

Vyšetření funkce fagocytů

Metody screeningu

Absorpční intenzita fagocyty Studie mikrobiálních buněk (fagocytóza latexových částic, testovací kultura aureus, Escherichia coli, nebo mikroorganismů izolovaných z pacienta). Centrifugací heparinizované krve se izoluje suspenze leukocytů, pro opsonizaci se přidá sérum IV krevních skupin (opsoniny jsou proteiny, které zvyšují fagocytózu). Mikrobiální suspenze se zředí, smísí s leukocyty a inkubuje se 120 min., Odebere se vzorek pro analýzu po 30.90.120 min po zahájení inkubace. Z vybraných suspenzí leukocytů se provádí rozetření. Určete následující indikátory fagocytózy:

• fagocytový index - procento buněk, které vstoupily do fagocytózy za 30 minut a 120 minut inkubace; normální hodnota fagocytového indexu (30) 94% fagocytového indexu (120) - 92%;
• fagocytové číslo - průměrný počet bakterií, které jsou intracelulární; normativní hodnota fagocytového čísla (30) 11%, fagocytového čísla (120) - 9,8%;  
• koeficient fagocytového čísla - poměr fagocytového čísla (30) k fagocytovému číslu (120); normální 1,16;
• baktericidní index neutrofilů je poměr počtu mikrobů usmrcených uvnitř fagocytů k celkovému počtu odebraných mikroorganismů; v normě 66%.

Určení metod

• Vyšetření baktericidní aktivity fagocytů při testu nitrozin tetrazoliem (NST) je test NST. Do leukocytů se přidává tetrazolium oxidu dusného ve žluté barvě. Když je barvivo absorbováno neutrofilem, proces redukce probíhá za působení volných radikálů kyslíku, což vede k modrému barvení. Reakce se provádí na 96-jamkové desce s plochým dnem. V prvních třech jamkách se směsí HCT a leukocytů se přidá Hanksův roztok (spontánní HCT), ve druhé - latexové částice; inkubovat při 37 ° C po dobu 25 minut. Výsledky se čtou na čtecím zařízení při 540 nm a vyjádří se v konvenčních jednotkách. Vypočtěte stimulační faktor (K _st ), který se rovná poměru optické hustoty v stimulovaných jamkách k průměrné optické hustotě v jamkách bez stimulace. U zdravých lidí, _{HCT spont} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Vyšetřování adhezních molekul. Pomocí průtokové cytofluorimetrie se stanoví exprese povrchových antigenů CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Imunodeficience s narušením adheze se projevují recidivujícími infekcemi, pomalým hojení ran a nepřítomností hnisu v ložiskách infekce.

Vyšetřování systému komplementu

Metody screeningu

Stanovení hemolytické aktivity komplementu - studie klasické cesty aktivace komplementu. Různé ředění séra pacienta a zdravého člověka se přidávají do erytrocytů beranu pokrytého protilátkami. Jednotka hemolytické aktivity je považována za inverzní zředění séra, ve kterém je 50% erytrocytů zničeno. Stupeň hemolýzy se vyhodnocuje fotometricky výtěžkem hemoglobinu v roztoku. Snížení hemolytické aktivity komplementu je pozorováno při systémovém lupus erythematosus s renálním postižením, akutní glomerulonefritidou. Kombinované imunodeficience, myasthenia gravis, virové hepatitidy, lymfomy, zvýšení - s obstrukční žloutenkou, thyroiditidou Hashimoto. Revmatismus, revmatoidní artritida, nodulární periarteritida. Dermatomyositida, infarkt myokardu, ulcerózní kolitida, Reiterův syndrom, dna.

Určení metod

• Stanovení složek komplementu. Kvantitativní stanovení se provádí metodou radiální imunodifuze a nefelometrie.
  Studie není informativní, pokud se nemění antigenní vlastnosti složek komplementu.
• Bylo zjištěno, že Clq-složka komplementu zvyšuje fagocytózu a zprostředkovává buněčnou cytotoxicitu. Jeho pokles nastává u onemocnění imunitních komplexů, systémového lupus erythematosus, purulentních infekcí a nádorů.
• Komponenta C3 se podílí na aktivaci klasické a alternativní cesty komplementu. Snížení jeho koncentrace je spojeno s chronickými bakteriálními a houbovými infekcemi, přítomností cirkulačních nebo tkáňových imunitních komplexů.
• Komponent C4 se podílí na aktivaci klasické cesty. Snížení jeho koncentrace je spojeno s prodlouženou aktivací komplementu s imunitními komplexy a snížením koncentrace C1 inhibitoru, který řídí aktivaci klasické dráhy komplementu. Nedostatek C4 nastává při systémovém lupus erythematosus, zvýšení C4 nastává při onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu, akutního zánětu a onemocnění gastrointestinálního traktu.
• C5a je malý fragment molekuly C5, který se od ní oddělí v důsledku aktivace komplementového systému. Zvýšení koncentrace nastává při zánětu, sepse, atopických a alergických onemocněních.
• Cl-inhibitor je multifunkční faktor. Řídí aktivaci C1 složky komplementu, inhibuje aktivitu kalikreinu, plazminu a aktivovaného faktoru Hageman, proteázy Cls a Or. Nedostatek inhibitoru C1 vede k angioedému.
• doplňkové studie. Do standardního séra, které nemá komplementární složku, se přidá testovací sérum a stanoví se hemolytická aktivita komplementu. Pokud není hemolytická aktivita obnovena na normální hodnotu, předpokládá se, že aktivita této složky komplementu v testovaném séru je snížena.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]