Imunologické studie v urologii

Předepsání imunogramu urologickému pacientovi znamená, že ošetřující lékař má podezření na přítomnost poruch imunitního systému. Opakující se bakteriální, virové, plísňové infekce, alergické projevy, systémová onemocnění mohou být příznaky těchto poruch, které se vyznačují řadou syndromů (infekční, onkologický, alergický, autoimunitní, lymfoproliferativní). Jeden pacient může mít několik syndromů. Například chronická infekční onemocnění (infekční syndrom) mohou způsobit imunodeficienci a imunodeficience se může projevit jako predispozice k infekčním a onkologickým onemocněním (onkologický syndrom). Predispozice k infekcím se může objevit na pozadí sekundární imunodeficience, která se vyvinula v důsledku lymfoproliferativního onemocnění, jako je leukémie. Existují tři hlavní skupiny patologických změn imunitního systému:

• kvantitativní nebo funkční nedostatek jedné nebo druhé vazby imunitního systému, který vede k rozvoji stavu imunodeficience;
• porucha rozpoznávání antigenů imunitním systémem, vedoucí k rozvoji autoimunitních procesů;
• hyperreaktivní nebo „zvrácená“ imunitní odpověď, projevující se rozvojem alergických onemocnění.

Existují screeningové (testy úrovně 1) a objasňující (testy úrovně 2) metody imunodiagnostiky. První existují k zaznamenání poruch imunitního systému, druhé k stanovení mechanismů zapojených do jejich realizace za účelem další imunokorekce.

B-buněčná imunita

Screeningové metody

• Stanovení relativního a absolutního počtu B-lymfocytů pomocí imunofluorescence nebo průtokové cytofluorometrie s monoklonálními protilátkami proti antigenům B-lymfocytů (CD19, CD20, kde CD jsou shluky diferenciace). Normální obsah B-lymfocytů u dospělých je 8-19 % z celkového počtu leukocytů neboli 190-380 buněk/μl. Zvýšení obsahu B-lymfocytů se vyskytuje u akutních a chronických bakteriálních a plísňových infekcí, chronických onemocnění jater, systémových onemocnění pojivové tkáně, chronické lymfocytární leukémie a myelomu.
• Stanovení koncentrace nespecifických imunoglobulinů (F, M, G, E) jednoduchou radiální imunodifuzí, nefelometrií nebo turbometrií, radioimunoanalýzou nebo enzymovým imunotestem (ELISA). Normy pro dospělé: imunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Ke zvýšení koncentrace imunoglobulinů dochází za stejných patologických stavů, za kterých dochází ke zvýšení obsahu B-lymfocytů. Ke snížení koncentrace imunoglobulinů dochází při vrozené hypogamaglobulinémii, novotvarech imunitního systému, odstranění sleziny, ztrátě bílkovin, onemocněních ledvin nebo střev, léčbě cytostatiky a imunosupresivy.

Metody vyjasňování

• Stanovení cirkulujících imunitních komplexů v krvi selektivní precipitací v polyethylenglykolu s následným spektrofotometrickým stanovením hustoty (normálně 80-20 U). Zvýšení cirkulujících imunitních komplexů je typické pro akutní bakteriální, plísňové, virové infekce, autoimunitní onemocnění, imunokomplexní onemocnění, sérovou nemoc, alergické reakce typu 3;
• Stanovení specifických imunoglobulinů v krvi ve vztahu k bakteriálním a virovým antigenům, deoxyribonukleové kyselině (DNA) u autoimunitních onemocnění, detekce antispermových (autoimunitní neplodnost) a antirenálních protilátek (pyelonefritida a glomerulonefritida) radiální imunodifuzí nebo metodou ELISA.
• Stanovení antispermových protilátek ve spermiích [MAR test (smíšená antiglobulinová reakce)], normální - negativní výsledek.
• Stanovení koncentrace imunoglobulinů v moči pro účely diferenciální diagnostiky mezi pyelonefritidou a glomerulonefritidou (selektivita proteinurie).
• Stanovení obsahu IgE v prostatické šťávě za účelem diagnostiky alergické prostatitidy pomocí metody radiální imunodifuze nebo ELISA.
• Studie odpovědi v reakci blastické transformace B-lymfocytů na mitogen B-lymfocytů (mitogen líčidla líčidla pro stimulaci reakce blastické transformace B-lymfocytů za přítomnosti T-lymfocytů), jehož normativní hodnota je 95-100 %.

T-buněčná vazba imunity

Screeningové metody

• Stanovení relativního a absolutního počtu zralých CD3 T-lymfocytů imunofluorescenční reakcí nebo průtokovou cytofluorometrií s použitím monoklonálních protilátek proti CD3. Norma pro dospělé je 58-76 % nebo 1100-1700 buněk/μl. Pokles počtu T-lymfocytů je indikátorem nedostatečnosti buněčné imunity. To je typické pro některé sekundární a primární imunodeficience (chronické bakteriální a virové infekce: tuberkulóza, syndrom získané imunodeficience, maligní nádory, chronické selhání ledvin, traumata, stres, stárnutí, podvýživa, léčba cytostatiky, vystavení ionizujícímu záření). Zvýšení počtu T-lymfocytů nastává na pozadí imunitní hyperaktivity nebo u lymfoproliferativních onemocnění. Při zánětu se počet T-lymfocytů nejprve zvyšuje a poté klesá. Absence poklesu T-lymfocytů naznačuje chronický zánětlivý proces.
• Vyhodnocení subpopulací lymfocytů.
  • Stanovení počtu T-helperů (protilátky proti CD4). Normálně 36-55 % nebo 400-1100 buněk/mcl. Zvýšení počtu těchto buněk se vyskytuje u autoimunitních onemocnění, Waldenstromovy choroby, aktivace protitransplantační imunity; snížení počtu T-helperů se vyskytuje u chronických bakteriálních, virových, protozoálních infekcí, tuberkulózy, syndromu získané imunodeficience, maligních nádorů, popálenin, úrazů, podvýživy, stárnutí, léčby cytostatiky, vystavení ionizujícímu záření.
  • Stanovení počtu T-supresorů (protilátek proti CD4). Normálně 17-37 % nebo 300-700 buněk/μl. Zvýšení počtu T-supresorů nastává za stejných podmínek, za kterých počet T-helperů klesá, a jejich snížení nastává za stejných podmínek, za kterých se obsah T-helperů zvyšuje.
  • Imunoregulační index CD4/CD8, normálně 1,5-2,5. Hyperaktivita s hodnotami nad 2,5 (alergická a autoimunitní onemocnění); hypoaktivita - méně než 1,0 (predispozice k chronickým infekcím). Na začátku zánětlivého procesu se imunoregulační index zvyšuje a po jeho ústupu se normalizuje.

Metody vyjasňování

• Stanovení počtu přirozených zabíječů (NK buněk) - protilátek proti CD16 a CD56. Norma pro CD 16 lymfocyty je 6-26 %, CD56 - 9-19 %. Zvýšení počtu NK buněk nastává během odmítnutí transplantátu, snížení - při virových infekcích, rakovině, primárních a sekundárních imunodeficiencích, popáleninách, úrazech a stresu, léčbě cytostatiky a vystavení ionizujícímu záření.
• Stanovení počtu T-lymfocytů s receptorem pro interleukin-2 (aktivační marker) - protilátky proti CD25. Norma je 10-15%. Zvýšení jejich počtu je pozorováno u alergických onemocnění, odmítnutí transplantátu, reakce na antigeny závislé na thymusu v akutním období primární infekce, snížení - u stejných onemocnění, u kterých dochází k poklesu počtu NK buněk.
• Studium exprese aktivačního markeru - molekuly histokompatibility třídy II HLA-DR. Zvýšená exprese se vyskytuje u zánětlivých procesů, u pacientů s hepatitidou C, celiakií, syfilisem, akutními respiračními onemocněními.
• Hodnocení apoptózy lymfocytů. Hrubou představu o připravenosti lymfocytů k apoptóze lze získat expresí receptoru Fas (CD95) na jejich povrchu a protoonkogenu bd-2 v mitochondriích. Apoptóza lymfocytů se hodnotí ošetřením dvěma fluorescenčními barvivy: propidium jodidem, který se váže na fragmenty DNA, a annexinem Y, který se váže na fosfatidylserin, který se objevuje na buněčné membráně na začátku apoptózy. Výsledky se vyhodnocují pomocí průtokového cytofluorometru. Výsledky se vypočítávají na základě poměru buněk obarvených různými barvivy. Neobarvené buňky jsou životaschopné, buňky vázané pouze na annexin Y jsou časnými projevy apoptózy, přičemž propidium jodid a annexin Y jsou pozdními projevy apoptózy, barvení pouze propidium jodidem indikuje nekrózu.
• Hodnocení proliferace T-lymfocytů in vitro.
  • Změny v buněčné blastogenezi - blastická transformační reakce lymfocytů. Leukocyty se inkubují s jakýmkoli mitogenem rostlinného původu (lektiny). Fytohemaglutinin se nejčastěji používá po dobu 72 hodin, poté se odebere nátěr, obarví se a spočítá se počet blastů! Stimulační index je poměr procenta transformovaných buněk v experimentu (kultura s fytohemaglutininem) k procentu transformovaných buněk v kontrole (kultura bez fytohemaglutininu). Blastickou transformační reakci lymfocytů lze posoudit přidáním radioaktivní značky (ZN-thymndinum) do kultivovaných buněk, protože syntéza DNA se během buněčného dělení zvyšuje. Poruchy proliferativní odpovědi se vyskytují jak u primárních, tak u sekundárních imunodeficiencí spojených s infekcemi, rakovinou, selháním ledvin a chirurgickými zákroky.
  • V těchto studiích je hodnocena exprese aktivačních markerů (CD25, transferinový receptor - CD71) a molekuly hlavního histokompatibilního komplexu třídy II HLA-DR, které na klidových T-lymfocytech prakticky chybí. T-lymfocyty jsou stimulovány fytohemaglutininem, po 3 dnech je exprese aktivačních markerů analyzována metodou přímé nebo nepřímé imunofluorescenční reakce, průtokovou cytofluorometrií, za použití monoklonálních protilátek proti izolovaným receptorům.
  • Měření množství mediátorů syntetizovaných aktivovanými T-lymfocyty [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon atd.] pomocí radioimunoanalýzy nebo ELISA. Zvláštní význam má stanovení koncentrace γ-interferonu a IL-4 jako markerů Th1 a Th2 v supernatantu aktivovaných kultur a uvnitř buňky. Pokud je to možné, je užitečné stanovit genovou expresi pro odpovídající cytokin podle hladiny matrixové ribonukleové kyseliny v produkční buňce a intenzity exprese receptorů pro odpovídající cytokiny.
    
• Reakce inhibice migrace lymfocytů. Senzibilizované T-lymfocyty v reakci s antigenem vylučují lymfokiny, včetně faktorů inhibujících migraci lymfocytů. Inhibiční jev je pozorován po zavedení mitogenů do buněčné kultury. Vyhodnocení stupně inhibice nám umožňuje posoudit schopnost lymfocytů vylučovat cytokiny. Frekvence migrace je obvykle v závislosti na specifickém mitogenu 20–80 %.
• Hodnocení cytotoxicity NK buněk. Stanovuje se schopnost přirozených zabíječských buněk zabíjet cílové buňky erytromyeloidní linie K-562. Pokud se hodnotí cytotoxicita závislá na protilátkách, používají se cílové buňky potažené protilátkami IgG. Cílové buňky se znače 3H-uridinem a inkubují se s efektorovými buňkami. Smrt cílových buněk se hodnotí uvolněním radioaktivní značky do roztoku. K poklesu cytotoxicity dochází u maligních novotvarů. V některých případech, kdy je nutné předpovědět účinnost léčby interleukiny, se cytotoxicita NK buněk hodnotí během inkubace s určitými cytokiny.

Studium funkce fagocytů

Screeningové metody

Studium intenzity absorpce mikrobiálních buněk fagocyty (fagocytóza latexových částic, testovací kultura stafylokoků, E. coli nebo mikroorganismů izolovaných od pacienta). Centrifugací heparinizované krve se izoluje suspenze leukocytů, pro opsonizaci se přidá sérum IV. krevní skupiny (opsoniny jsou proteiny, které zvyšují fagocytózu). Mikrobiální suspenze se zředí, smíchá s leukocyty a inkubuje se 120 minut, vzorky k analýze se odeberou 30,90,120 minut po zahájení inkubace. Z odebrané suspenze leukocytů se odeberou nátěry. Stanoví se následující ukazatele fagocytózy:

• fagocytární index - procento buněk, které vstoupily do fagocytózy během 30 minut a 120 minut inkubace; standardní hodnota fagocytárního indexu (30) je 94 %, fagocytární index (120) je 92 %;
• fagocytární číslo - průměrný počet bakterií umístěných intracelulárně; standardní hodnota fagocytárního čísla (30) je 11 %, fagocytární číslo (120) je 9,8 %;
• koeficient fagocytárního počtu - poměr fagocytárního počtu (30) k fagocytárnímu počtu (120); normálně 1,16;
• Baktericidní index neutrofilů - poměr počtu mikrobů usmrcených uvnitř fagocytů k celkovému počtu absorbovaných mikrobů; obvykle 66 %.

Metody vyjasňování

• Studium baktericidní schopnosti fagocytů v testu s nitromodrou tetrazoliovou (NBT) - NBT test. K leukocytům se přidá žluté barvivo nitromodrá tetrazoliová. Když neutrofil absorbuje barvivo, dochází k redukčnímu procesu vlivem volných kyslíkových radikálů, což vede k modrému zbarvení. Reakce se provádí na 96jamkové destičce s plochým dnem. Do prvních tří jamek se směsí NBT a leukocytů se přidá Hanksův roztok (spontánní NBT) a do druhé se přidají latexové částice; směs se inkubuje při 37 °C po dobu 25 minut. Výsledky se odečtou při 540 nm na čtečce a vyjádří se v libovolných jednotkách. Vypočítá se stimulační koeficient (K _st ), který se rovná poměru optické hustoty ve stimulovaných jamkách k průměrné optické hustotě v jamkách bez stimulace. U zdravých lidí je NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78±0,36.
• Studie adhezních molekul. Průtoková cytofluorometrie se používá ke stanovení exprese povrchových antigenů CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunodeficience s poruchou adheze se projevují opakovanými infekcemi, pomalým hojením ran a absencí hnisu v ložiskách infekce.

Studium systému komplementu

Screeningové metody

Stanovení hemolytické aktivity komplementu je studium klasické dráhy aktivace komplementu. Různá ředění séra od nemocného a zdravého člověka se přidají k erytrocytům potaženým protilátkami. Jednotkou hemolytické aktivity je převrácená hodnota ředění séra, při kterém je zničeno 50 % erytrocytů. Stupeň hemolýzy se odhaduje fotometricky uvolněním hemoglobinu do roztoku. Snížení hemolytické aktivity komplementu je pozorováno u systémového lupus erythematodes s poškozením ledvin, akutní glomerulonefritidy, kombinovaných imunodeficiencí, myasthenie, virové hepatitidy, lymfomů, zvýšení - u obstrukční žloutenky, Hashimotovy tyreoiditidy, revmatismu, revmatoidní artritidy, nodulární periarteritidy, dermatomyozitidy, infarktu myokardu, ulcerózní kolitidy, Reiterova syndromu a dny.

Metody vyjasňování

• Stanovení složek komplementu. Kvantitativní stanovení se provádí radiální imunodifuzí a nefelometrií.
  Studie není informativní, pokud se nezmění antigenní vlastnosti složek komplementu.
• Bylo zjištěno, že složka komplementu Clq zvyšuje fagocytózu a zprostředkovává buněčnou cytotoxicitu. K jejímu snížení dochází u imunokomplexních onemocnění, systémového lupus erythematodes, hnisavých infekcí a nádorů.
• Složka C3 se podílí na aktivaci klasických a alternativních drah komplementu. Snížení její koncentrace je spojeno s chronickými bakteriálními a plísňovými infekcemi, přítomností cirkulujících nebo tkáňových imunitních komplexů.
• Složka C4 se podílí na aktivaci klasické dráhy. Pokles její koncentrace je spojen s prodlouženou aktivací komplementu imunitními komplexy a se snížením koncentrace inhibitoru C1, který řídí aktivaci klasické dráhy komplementu. Deficit C4 se vyskytuje u systémového lupus erythematodes, zvýšení C4 se vyskytuje u onemocnění ledvin, odmítnutí transplantátu, akutního zánětu a gastrointestinálních onemocnění.
• C5a je malý fragment molekuly C5, který se od ní odštěpuje v důsledku aktivace komplementového systému. Jeho koncentrace se zvyšuje během zánětu, sepse, atopických a alergických onemocnění.
• Cl-inhibitor je multifunkční faktor. Řídí aktivaci složky komplementu C1, inhibuje aktivitu kalikreinu, plazminu a aktivovaného Hagemanova faktoru, Cl5 a Or proteáz. Nedostatek C1-inhibitoru vede k angioedému.
• funkční studie komplementu. Testované sérum se přidá ke standardnímu séru, které neobsahuje žádnou složku komplementu, a stanoví se hemolytická aktivita komplementu. Pokud se hemolytická aktivita neobnoví na normál, aktivita této složky komplementu v testovaném séru se považuje za sníženou.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]