Konfokální mikroskopie rohovky s dobou života

Konfokální mikroskopie rohovky je jednou z moderních výzkumných metod, umožňuje intravitální monitorování rohovky s vizualizací tkání na buněčné a mikrostrukturální úrovni.

Tato metoda, díky originální konstrukci mikroskopu a jeho vysoké rozlišovací schopnosti, umožňuje vizualizaci živé rohovkové tkáně, měření tloušťky každé z jejích vrstev a posouzení stupně morfologických poruch.

Účel konfokální mikroskopie rohovky

Charakterizovat morfologické změny rohovky, ke kterým dochází u různých zánětlivých a dystrofických onemocnění, jakož i v důsledku chirurgických zákroků a vystavení CL.

Data morfologického vyšetření jsou nezbytná k posouzení závažnosti patologického procesu, účinnosti léčby a k určení taktiky léčby pacienta.

Indikace postupu

• Zánětlivá onemocnění rohovky ( keratitida ).
• Dystrofická onemocnění rohovky ( keratokonus, Fuchsova dystrofie atd.).
• Syndrom suchého oka.
• Stavy po chirurgických zákrocích na rohovce (penetrující transplantace rohovky, keratorefrakční operace).
• Stavy spojené s nošením kontaktních čoček.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Příprava

Toto vyšetření lze provést bez použití anestetik. Na objektiv konfokálního mikroskopu se umístí kapka imerzní kapaliny. Tím se eliminuje přímý kontakt čočky s rohovkou a minimalizuje se riziko poškození epitelu.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Technika konfokální mikroskopie rohovky

Studie se provádí pomocí konfokálního mikroskopu ConfoScan 4 (Nider) s 500násobným zvětšením. Přístroj umožňuje vyšetření rohovky v celé její tloušťce.

Velikost vyšetřované oblasti je 440×330 μm, tloušťka skenovací vrstvy je 5 μm. Čočka s kapkou gelu se přiblíží k rohovce až do kontaktu a je instalována tak, aby tloušťka vrstvy imerzní kapaliny byla 2 mm. Konstrukce zařízení umožňuje vyšetření rohovky v centrální zóně a jejích paracentrálních oblastech.

Kontraindikace k postupu

Relativní kontraindikací je silné podráždění očí v důsledku akutního zánětlivého procesu.

[ 10 ], [ 11 ]

Normální výkon

Normální morfologický obraz rohovky

Přední epitel se skládá z 5-6 vrstev buněk. Průměrná tloušťka celého epitelu je přibližně 50 µm. Podle morfologické struktury se rozlišují (od vnitřku ven) tyto vrstvy: bazální, šílovité buňky a povrchová.

• Nejvnitřnější (bazální) vrstva je reprezentována malými, hustými, válcovitými buňkami bez viditelného jádra. Hranice bazálních buněk jsou jasné a světlé.
• Střední vrstva se skládá ze 2–3 vrstev ostnatých (křídlých) buněk s hlubokými záhyby, do kterých jsou vnořeny výrůstky sousedních buněk. Mikroskopicky jsou hranice buněk poměrně jasně rozlišitelné a jádra nemusí být definována nebo mohou být nejasná.
• Povrchová vrstva epitelu je reprezentována jednou nebo dvěma vrstvami polygonálních buněk s jasnými hranicemi a homogenní hustotou. Jádra jsou obvykle jasnější než cytoplazma, ve které lze rozlišit i tmavý perinukleární kruh.

Mezi buňkami povrchové vrstvy se rozlišují tmavé a světlé buňky. Zvýšená odrazivost epiteliálních buněk naznačuje snížení jejich metabolické rychlosti a začínající deskvamaci.

Bowmanova membrána je průhledná struktura, která neodráží světlo, takže ji obvykle nelze vizualizovat konfokální mikroskopií.

Subbazální nervový plexus se nachází pod Bowmanovou membránou. Normálně se nervová vlákna jeví jako světlé pruhy probíhající rovnoběžně na tmavém pozadí a vzájemně se dotýkající. Odrazivost (reflexe) může být podél vlákna nerovnoměrná.

Stroma rohovky zaujímá 80 až 90 % tloušťky rohovky a skládá se z buněčných a extracelulárních složek. Hlavními buněčnými prvky stromatu jsou keratocyty; tvoří přibližně 5 % objemu.

Typický mikroskopický obraz stromatu zahrnuje několik jasných nepravidelných oválných tělísek (jádra keratocytů), která leží v tloušťce průhledné tmavě šedé nebo černé matrix. Za normálních okolností je vizualizace extracelulárních struktur kvůli jejich průhlednosti nemožná. Stroma lze podmíněně rozdělit na podvrstvy: přední (umístěnou přímo pod Bowmanovou membránou a tvořící 10 % tloušťky stromatu), přední-střední, střední a zadní.

Průměrná hustota keratocytů je vyšší v předním stromatu a směrem k zadním vrstvám postupně klesá. Hustota buněk předního stromatu je téměř dvakrát vyšší než hustota buněk zadního stromatu (pokud je hustota buněk předního stromatu považována za 100 %, pak bude hustota buněk zadního stromatu přibližně 53,7 %). V předním stromatu mají jádra keratocytů zaoblený fazolovitý tvar, zatímco v zadním stromatu jsou oválná a protáhlejší.

Jas keratocytových jader se může lišit. Různá schopnost odrážet světlo závisí na jejich metabolickém stavu. Jasnější buňky jsou považovány za aktivované keratocyty („stresové“ buňky), jejichž aktivita je zaměřena na udržení vnitřní homeostázy rohovky. V normě a zorném poli se nacházejí jednotlivé aktivované buňky.

Nervová vlákna v předním stromatu rohovky jsou vizualizována jako jasné homogenní pásy, často tvořící bifurkace.

Descemetova membrána je normálně průhledná a není viditelná konfokální mikroskopií.

Zadní epitel je monovrstva hexagonálních nebo polygonálních plochých buněk s rovnoměrně světlým povrchem na pozadí jasných tmavých mezibuněčných hranic.

Zařízení má schopnost ručně nebo automaticky vypočítat hustotu buněk, jejich plochu a koeficient variability.

Patologické změny ve struktuře rohovky

Keratokonus je charakterizován významnými změnami v předním epitelu a stromatu rohovky.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ]