Mikroskopická analýza sputa

Mikroskopické vyšetření nativních a fixovaných barvených preparátů sputa umožňuje detailní studium jeho buněčného složení a do jisté míry odráží povahu patologického procesu v plicích a průduškách, jeho aktivitu, identifikovat různé vláknité a krystalické útvary, které mají také důležitou diagnostickou hodnotu, a nakonec zhruba posoudit stav mikrobiální flóry dýchacích cest (bakterioskopie).

Mikroskopie využívá nativní a barvené preparáty sputa. Pro studium mikrobiální flóry (bakterioskopie) se stěry sputa obvykle barví podle Romanovského-Giemsy, podle Grama a pro identifikaci Mycobacterium tuberculosis podle Ziehla-Neelsena.

Buněčné elementy a elastická vlákna

Z buněčných elementů, které lze detekovat ve sputu pacientů s pneumonií, mají diagnostickou hodnotu epiteliální buňky, alveolární makrofágy, leukocyty a erytrocyty.

Epitelové buňky. Dlaždicový epitel z ústní dutiny, nosohltanu, hlasivek a epiglottis nemá diagnostickou hodnotu, i když detekce velkého počtu dlaždicových epiteliálních buněk zpravidla naznačuje nízkou kvalitu vzorku sputa dodaného do laboratoře a obsahujícího významnou příměs slin.

U pacientů s pneumonií se sputum považuje za vhodné k vyšetření, pokud při mikroskopii s nízkým zvětšením počet epiteliálních buněk v zorném poli nepřesahuje 10. Větší počet epiteliálních buněk naznačuje nepřijatelnou převahu orofaryngeálního obsahu v biologickém vzorku.

Alveolární makrofágy, které lze v malém množství nalézt i v jakémkoli sputu, jsou velké buňky retikulohistiocytárního původu s excentricky umístěným velkým jádrem a hojnými inkluzemi v cytoplazmě. Tyto inkluze mohou sestávat z drobných prachových částic (prachových buněk) absorbovaných makrofágy, leukocyty atd. Počet alveolárních makrofágů se zvyšuje během zánětlivých procesů v plicním parenchymu a dýchacích cestách, včetně pneumonie.

Buňky sloupcového řasinkového epitelu vystýlají sliznici hrtanu, průdušnice a průdušek. Vypadají jako protáhlé buňky, rozšířené na jednom konci, kde se nachází jádro a řasinky. Buňky sloupcového řasinkového epitelu se nacházejí v jakémkoli sputu, ale jejich zvětšení naznačuje poškození sliznice průdušek a průdušnice (akutní a chronická bronchitida, bronchiektázie, tracheitida, laryngitida).

Leukocyty se v malém množství (2-5 v zorném poli) nacházejí v jakémkoli sputu. V případě zánětu plicní tkáně nebo sliznice průdušek a průdušnice, zejména v případě hnisavých procesů (gangréna, plicní absces, bronchiektázie), se jejich množství výrazně zvyšuje.

Při barvení preparátů sputa podle Romanovského-Giemsy je možné rozlišit jednotlivé leukocyty, což má někdy důležitou diagnostickou hodnotu. Při výrazném zánětu plicní tkáně nebo bronchiální sliznice se tedy zvyšuje jak celkový počet neutrofilních leukocytů, tak i počet jejich degenerativních forem s fragmentací jader a destrukcí cytoplazmy.

Zvýšení počtu degenerativních forem leukocytů je nejdůležitějším znakem aktivity zánětlivého procesu a závažnějšího průběhu onemocnění.

Erytrocyty. Jednotlivé erytrocyty lze nalézt téměř v jakémkoli sputu. Jejich významné zvýšení je pozorováno v případech zhoršené vaskulární propustnosti u pacientů s pneumonií, v případech destrukce plicní nebo bronchiální tkáně, kongesce v plicním oběhu, plicního infarktu atd. Erytrocyty se ve velkém množství nacházejí ve sputu v případech hemoptýzy jakéhokoli původu.

Elastická vlákna. Za zmínku stojí i další prvek sputa - plastická vlákna, která se ve sputu objevují při destrukci plicní tkáně (plicní absces, tuberkulóza, rozpadající se rakovina plic atd.). Elastická vlákna se ve sputu vyskytují ve formě tenkých, dvojitě konturovaných, zkroucených nití s dichotomickým dělením na koncích. Výskyt elastických vláken ve sputu u pacientů s těžkou pneumonií naznačuje výskyt jedné z komplikací onemocnění - abscesu plicní tkáně. V některých případech, kdy se vytvoří plicní absces, lze elastická vlákna ve sputu detekovat i o něco dříve než odpovídající radiografické změny.

V případech lobární pneumonie, tuberkulózy, aktinomykózy a fibrinózní bronchitidy lze v preparátech sputa často nalézt tenká fibrinová vlákna.

Příznaky aktivního zánětlivého procesu v plicích jsou:

1. povaha sputa (mukopurulentní nebo hnisavý);
2. zvýšení počtu neutrofilů ve sputu, včetně jejich degenerativních forem;
3. zvýšení počtu alveolárních makrofágů (z jednotlivých shluků několika buněk v zorném poli a více);

Výskyt elastických vláken ve sputu naznačuje destrukci plicní tkáně a vznik plicního abscesu.

Konečné závěry o přítomnosti a stupni aktivity zánětu a destrukce plicní tkáně se tvoří pouze tehdy, když se porovnají s klinickým obrazem onemocnění a výsledky dalších laboratorních a instrumentálních výzkumných metod.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Mikrobiální flóra

Mikroskopie nátěrů sputa barvených podle Grama a studium mikrobiální flóry (bakterioskopie) u některých pacientů s pneumonií umožňuje přibližně určit nejpravděpodobnějšího původce plicní infekce. Tato jednoduchá metoda expresní diagnostiky původce není dostatečně přesná a měla by být používána pouze v kombinaci s jinými (mikrobiologickými, imunologickými) metodami vyšetření sputa. Imerzní mikroskopie barvených nátěrů sputa je někdy velmi užitečná pro urgentní výběr a předepsání adekvátní antibakteriální terapie. Je však třeba mít na paměti možnost intoxikace bronchiálního obsahu mikroflórou horních cest dýchacích a ústní dutiny, zejména pokud je sputum odebráno nesprávně.

Sputum se proto považuje za vhodné k dalšímu vyšetření (bakterioskopii a mikrobiologické vyšetření) pouze tehdy, pokud splňuje následující podmínky:

• Gramovo barvení odhaluje velký počet neutrofilů ve sputu (více než 25 v zorném poli při malém zvětšení mikroskopu);
• počet epiteliálních buněk, charakterističtějších pro obsah orofaryngu, nepřesahuje 10;
• Přípravek obsahuje převahu mikroorganismů jednoho morfologického typu.

Při barvení sputa podle Grama je někdy možné poměrně dobře identifikovat grampozitivní pneumokoky, streptokoky, stafylokoky a skupinu gramnegativních bakterií - Klebsiella, Pfeifferův bacil, Escherichia coli atd. V tomto případě grampozitivní bakterie získají modrou barvu a gramnegativní bakterie - červenou.

Bakteriální patogeny pneumonie

Grampozitivní	Gramnegativní
Pneumokoky Streptococcus pneumoniae. Streptokoky Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans. Stafylokoky: Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus.	Klebsiella pneumoniae Haemophilus influenzae (Pfeifferův bacil) Haemophilius influenzae Pseudomonas aeruginosa Legionelózní pneumofilie Escherichia coli

Předběžná bakterioskopie sputa je nejjednodušší metodou ověření původce pneumonie a má určitý význam pro volbu optimální antibiotické terapie. Například pokud jsou v Gramově barvených nátěrech detekovány grampozitivní diplokoky (pneumokoky) nebo stafylokoky, může být místo širokospektrých antibiotik, která zvyšují riziko selekce a šíření mikroorganismů rezistentních na antibiotika, předepsána cílená terapie účinná proti pneumokokům nebo stafylokokům. V jiných případech může detekce gramnegativní flóry převládající v nátěrech naznačovat, že původcem pneumonie jsou gramnegativní enterobakterie (Klebsiella, Escherichia coli atd.), což vyžaduje určení vhodné cílené terapie.

Pravda, hrubý závěr o pravděpodobném původci plicní infekce lze mikroskopicky učinit pouze na základě významného zvýšení bakterií ve sputu, a to při koncentraci 10 ⁶ - 10 ⁷ mc/ml a více (LL Višňakova). Nízké koncentrace mikroorganismů (3 mc/ml) jsou charakteristické pro doprovodnou mikroflóru. Pokud koncentrace mikrobiálních tělísek kolísá od 10 ⁴ do 10 ⁶ mc/ml, nevylučuje to etiologickou roli tohoto mikroorganismu ve vzniku plicní infekce, ale ani to nedokazuje.

Je také třeba si uvědomit, že „atypické“ intracelulární patogeny (mykoplazma, legionella, chlamydie, rickettsie) se nebarví podle Grama. V těchto případech může vzniknout podezření na přítomnost „atypické“ infekce, pokud je v nátěrech sputa detekována disociace mezi velkým počtem neutrofilů a extrémně malým počtem mikrobiálních buněk.

Metoda bakterioskopie má bohužel obecně poměrně nízkou senzitivitu a specificitu. Neprediktivní hodnota i u dobře vizualizovaných pneumokoků sotva dosahuje 50 %. To znamená, že v polovině případů metoda dává falešně pozitivní výsledky. To je dáno několika důvody, jedním z nich je, že asi 1/3 pacientů již před hospitalizací dostala antibiotika, což výrazně snižuje účinnost bakterioskopie sputa. Navíc i v případě pozitivních výsledků testů naznačujících poměrně vysokou koncentraci „typických“ bakteriálních patogenů v nátěru (např. pneumokoky) nelze zcela vyloučit přítomnost koinfekce s „atypickými“ intracelulárními patogeny (mykoplazma, chlamydie, legionella).

Metoda bakterioskopie nátěrů sputa barvených Gramem v některých případech pomáhá ověřit původce pneumonie, ačkoli obecně má velmi nízkou prediktivní hodnotu. „Atypické“ intracelulární patogeny (mykoplazma, legionella, chlamydie, rickettsie) se bakterioskopií vůbec neověřují, protože se Gramem nebarví.

Za zmínku stojí možnost mikroskopické diagnostiky u pacientů s pneumonií způsobenou mykotickou plicní infekcí. Pro pacienty dlouhodobě léčené širokospektrými antibiotiky je nejrelevantnější detekce Candida albicans ve formě kvasinkovitých buněk a rozvětveného mycelia během mikroskopie nativních nebo barvených preparátů sputa. Ty naznačují změnu mikroflóry tracheobronchiálního obsahu, ke které dochází pod vlivem antibiotické léčby, což vyžaduje významnou korekci terapie.

V některých případech je u pacientů s pneumonií nutné odlišit stávající poškození plic od tuberkulózy. K tomuto účelu se používá barvení sputa podle Ziehl-Neelsena, které v některých případech umožňuje identifikovat mykobakterie tuberkulózy, i když negativní výsledek takové studie neznamená, že pacient tuberkulózu nemá. Při barvení sputa podle Ziehl-Neelsena se mykobakterie tuberkulózy barví červeně a všechny ostatní prvky sputa se barví modře. Mykobakterie tuberkulózy mají vzhled tenkých, rovných nebo mírně zakřivených tyčinek různé délky s jednotlivými ztluštěními. V preparátu se nacházejí ve skupinách nebo jednotlivě. Detekce i jednotlivých mykobakterií tuberkulózy v preparátu má diagnostickou hodnotu.

Pro zvýšení účinnosti mikroskopické detekce mykobakterií tuberkulózy se používá řada dalších metod. Nejběžnější z nich je tzv. flotační metoda, při které se homogenizované sputum třepe s toluenem, xylenem nebo benzínem, jejichž kapky, vznášející se vzhůru, zachycují mykobakterie. Po usazení sputa se horní vrstva nanese pipetou na podložní sklíčko. Preparát se poté fixuje a obarví podle Ziehl-Neelsena. Existují i další metody akumulace (elektroforéza) a mikroskopie bakterií tuberkulózy (luminiscenční mikroskopie).

Mikroskopické vyšetření (analýza) sputa umožňuje detekci hlenu, buněčných elementů, vláknitých a krystalických útvarů, hub, bakterií a parazitů.

Buňky

• Alveolární makrofágy jsou buňky retikulohistiocytárního původu. Velké množství makrofágů ve sputu je detekováno u chronických procesů a ve fázi řešení akutních procesů v bronchopulmonálním systému. Alveolární makrofágy obsahující hemosiderin („buňky srdeční vady“) jsou detekovány při plicním infarktu, krvácení a kongesci v plicním oběhu. Makrofágy s lipidovými kapkami jsou známkou obstrukčního procesu v průduškách a bronchiolech.
• Xantomatózní buňky (tukové makrofágy) se nacházejí v abscesech, aktinomykóze a echinokokóze plic.
• Sloupcové řasinkové epitelové buňky jsou buňky sliznice hrtanu, průdušnice a průdušek; vyskytují se při bronchitidě, tracheitidě, bronchiálním astmatu a maligních novotvarech plic.
• Plochý epitel se detekuje, když sliny vstoupí do sputa a nemá žádnou diagnostickou hodnotu.
• Leukocyty jsou přítomny v jakémkoli sputu v různém množství. Velké množství neutrofilů se nachází v hlenohnisavém a hnisavém sputu. Sputum je bohaté na eosinofily v případech bronchiálního astmatu, eosinofilní pneumonie, helmintických plicních lézí a plicního infarktu. Eosinofily se mohou ve sputu objevit v případech tuberkulózy a rakoviny plic. Lymfocyty se ve velkém množství nacházejí v případech černého kašle a méně často u tuberkulózy.
• Červené krvinky. Detekce jednotlivých červených krvinek ve sputu nemá diagnostickou hodnotu. Pokud je ve sputu přítomna čerstvá krev, detekují se nezměněné červené krvinky, ale pokud se se sputem uvolní krev, která se v dýchacích cestách nacházela delší dobu, detekují se vyplavené červené krvinky.
• Zhoubné nádorové buňky se nacházejí v maligních novotvarech.

Vlákna

• Elastická vlákna se objevují během rozpadu plicní tkáně, který je doprovázen destrukcí epiteliální vrstvy a uvolněním elastických vláken; nacházejí se u tuberkulózy, abscesu, echinokokózy a novotvarů v plicích.
• Korálovitá vlákna se nacházejí u chronických plicních onemocnění, jako je kavernózní tuberkulóza.
• Kalcifikovaná elastická vlákna jsou elastická vlákna impregnovaná vápenatými solemi. Jejich detekce ve sputu je charakteristická pro rozpad tuberkulózní petrifikace.

Spirály, krystaly

• Kurshmanovy spirály se tvoří v případě spastické poruchy průdušek a přítomnosti hlenu v nich. Během kašlání se viskózní hlen vrhá do lumen většího průdušku a stočí se do spirály. Kurshmanovy spirály se objevují u bronchiálního astmatu, bronchitidy, plicních nádorů, které stlačují průdušky.
• Charcotovy-Leydenovy krystaly jsou produkty rozpadu eosinofilů. Obvykle se objevují ve sputu obsahujícím eosinofily; jsou charakteristické pro bronchiální astma, alergické stavy, eosinofilní infiltráty v plicích a plicní motolici.
• Krystaly cholesterolu se objevují v abscesech, plicní echinokokóze a novotvarech v plicích.
• Krystaly hematoidinu jsou charakteristické pro plicní absces a gangrénu.
• Drúzy aktinomycet se nacházejí u plicní aktinomykózy.
• Prvky echinokoka se objevují v plicní echinokokóze.
• Dietrichovy zátky jsou žlutošedé bulky s nepříjemným zápachem. Skládají se z detritu, bakterií, mastných kyselin a tukových kapiček. Jsou charakteristické pro plicní absces a bronchiektázii.
• Ehrlichova tetraeda se skládá ze čtyř prvků: kalcifikovaného detritu, kalcifikovaných elastických vláken, krystalů cholesterolu a mykobakterií tuberkulózy. Objevuje se během rozpadu kalcifikovaného primárního tuberkulózního ložiska.

Mycelium a pučící houbové buňky se objevují během houbových infekcí bronchopulmonálního systému.

Bakterie Pneumocystis se objevují u pneumocystické pneumonie.

Plísňové sférule jsou detekovány u kokcidioidomykózy plic.

Larvy škrkavky jsou detekovány u askariózy.

Larvy úhořů se nacházejí u strongyloidózy.

Vajíčka plicní motolice jsou detekována během paragonimiázy.

Prvky nalezené ve sputu u bronchiálního astmatu. U bronchiálního astmatu se obvykle vylučuje malé množství hlenovité, viskózní sputa. Makroskopicky lze vidět Curschmannovy spirály. Mikroskopické vyšetření typicky odhaluje eosinofily, válcový epitel a Charcotovy-Leydenovy krystaly.