Virus hepatitidy A

Virová hepatitida A je infekční onemocnění lidí, charakterizované především poškozením jater a klinicky se projevující intoxikací a žloutenkou. Virus hepatitidy A byl objeven v roce 1973 S. Feinstonem (et al.) metodou imunitní elektronové mikroskopie a infikováním opic - šimpanzů a kosmanů. Podstata metody imunitní elektronové mikroskopie spočívá v tom, že do filtrátu stolice pacienta s hepatitidou A se přidají specifické protilátky (rekonvalescentní sérum) a sediment se podrobí elektronové mikroskopii. V důsledku interakce virů se specifickými protilátkami dochází ke specifické agregaci. V tomto případě jsou snadněji detekovatelné a agregace pod vlivem protilátek potvrzuje specifičnost patogenu. Objev S. Feinstona byl potvrzen v experimentech na dobrovolnících.

Virus hepatitidy A je sférický, průměr virionu je 27 nm. Genom je reprezentován jednovláknovou pozitivní RNA s mm 2,6 MD. Neexistuje superkapsida. Typ symetrie je kubický - ikosaedr. Kapsida má 32 kapsomer, je tvořena čtyřmi polypeptidy (VP1-VP4). Podle svých vlastností patří virus hepatitidy A do rodu Heparnovirus, čeledi Picornaviridae. Z hlediska antigenů je virus hepatitidy A (HAV - hepatitis A virus) homogenní. HAV se dobře množí v těle šimpanzů, paviánů, paviánů hamadryí a kosmanů. Dlouhou dobu nebylo možné virus kultivovat. Teprve v 80. letech 20. století se podařilo získat buněčné kultury, ve kterých se HAV množí. Zpočátku se k těmto účelům používaly kontinuální buněčné linie ledvin embrya makaka rhesus (kultura FRhK-4) a nyní se používá kontinuální buněčná linie buněk ledvin opic zelených (kultura 4647).

Dle doporučení expertů WHO byla přijata následující nomenklatura markerů viru hepatitidy A: virus hepatitidy A - protilátky proti HAV viru hepatitidy A: anti-HAV IgM a anti-HAV IgG.

HAV je malá částice o průměru 27-30 nm, která má ikosaedrickou symetrii a je homogenní. Elektrogram získaný metodou imunitní agregace odhaluje elektronově husté částice s povrchově umístěnými symetricky uspořádanými kapsomery. Při negativním kontrastu jsou v preparátech detekovány jak plné, tak prázdné částice. Nukleokapsida HAV, na rozdíl od chřipky, nemá povrchové výčnělky a membránu. Důležité je také, že virion HAV nemá srdčitou strukturu.

Na základě svých fyzikálně-chemických vlastností je virus hepatitidy A klasifikován jako virus patřící do čeledi pikornavirů, rodu enterovirů s pořadovým číslem 72. Tato taxonomie se však ukázala jako příliš neobvyklá a WHO považovala za možné zachovat terminologii „virus hepatitidy A“.

Stejně jako všechny viry z čeledi Picornaviridae obsahuje virus hepatitidy A ribonukleovou kyselinu. Některé laboratoře prokázaly možnost klonování genomu viru hepatitidy A, což otevírá vyhlídky na získání vakcín.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Rezistence viru hepatitidy A

Virus je relativně odolný vůči vysokým teplotám, kyselinám, tukovým rozpouštědlům (neobsahuje lipidy), dezinfekčním prostředkům a dobře snáší nízké teploty. To vše přispívá k jeho dlouhodobému uchování ve vnějším prostředí. Při pokojové teplotě přežívá několik týdnů, při 60 °C částečně ztrácí svou infekčnost po 4–12 hodinách a zcela – po několika minutách při 85 °C. Je vysoce odolný vůči chloru, díky čemuž je schopen pronikat do vody z vodovodu přes bariéry úpraven vody.

Shrneme-li všechna data, můžeme virus hepatitidy A charakterizovat následovně:

• přirozeným hostitelem je člověk;
• pokusná zvířata - kosmani, šimpanzi;
• zdrojem infekce jsou výkaly;
• nemoc je epidemická a endemická;
• cesta přenosu: fekálně-orální;
• inkubační doba - 14-40 dní;
• přechod na chronickou hepatitidu - nebyl pozorován.

Imunologické vlastnosti HAV jsou následující:

• Prototypové kmeny - Ms-1, CR-326, GВG. Všechny jsou imunologicky podobné nebo identické;
• Protilátky - IgM a IgG, se produkují v reakci na zavedení strukturních proteinů viru a mají ochranné účinky;
• I. Ochranný účinek lidského sérového gamaglobulinu - zabraňuje nebo zmírňuje onemocnění, pokud je podán před infekcí nebo během inkubační doby.

Fyzikálně-chemické vlastnosti NAU jsou následující:

• Morfologie: bezskořápková kulovitá částice s kubickou symetrií, kapsida se skládá z 32 kapsomer;
• Průměr - 27-30 nm;
• Hustota v CsCl (g/cm3) - 1,38-1,46 (otevřené částice), 1,33-1,34 (zralý virion), 1,29-1,31 (nezralé viriony, prázdné částice);
• Sedimentační koeficient - 156-160 zralých virionů;
• Nukleová kyselina je jednovláknová lineární RNA;
• Relativní molekulová hmotnost - 2,25 × 10⁶ - 2,8 × 10⁶ KD;
• Počet nukleotidů je 6 500–8 100.

Stabilita HAV za fyzikálních a chemických vlivů je následující:

• Chloroform, éter - stabilní;
• Chlor, 0,5–1,5 mg/l, 5 °C, 15 min – částečná inaktivace;
• Chloramin, 1 g/l, 20 °C, 15 min - úplná inaktivace;
• Formalín, 1:4000, 35–37 °C, 72 h – úplná inaktivace, 1:350, 20 °C, 60 min – částečná inaktivace.

Teplota:

• 20–70 °C – stabilní;
• 56 °C, 30 min - stabilní;
• 60 °C, 12 h - částečná inaktivace;
• 85 °C, 1 minuta - úplná inaktivace;
• Autoklávování, 120 °C. 20 min - úplná inaktivace;
• Suché teplo, 180 °C, 1 hodina - úplná inaktivace;
• UFO, 1,1 W, 1 minuta - úplná inaktivace.

Prezentovaná data ukazují, že svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi se virus hepatitidy A nejvíce blíží enterovirům. Stejně jako ostatní enteroviry je i HAV rezistentní vůči mnoha dezinfekčním roztokům a je zcela inaktivován během několika minut při 85 °C a autoklávování.

Bylo prokázáno, že virus hepatitidy A se může reprodukovat v primárních a kontinuálních monovrstvých liniích lidských a opičích buněčných kultur. Obzvláště aktivní reprodukce viru hepatitidy A v kulturách in vitro je pozorována při použití jaterních extraktů z nemocných opic jako výchozího materiálu. Je však třeba poznamenat, že ve všech experimentech s reprodukcí viru hepatitidy A na kulturách in vitro se pozornost upozorňuje na dlouhou inkubační dobu během primárních pasáží (až 4-10 týdnů), následně se zvyšuje akumulace virového genetického materiálu, ale absolutní hodnoty zůstávají velmi nevýznamné, což dává mnoha výzkumníkům důvod hovořit o neúplné replikaci viru hepatitidy A v tkáňových kulturách.

Shrneme-li literární údaje o reprodukci viru hepatitidy A v extratkáňových kulturách, lze říci, že skutečnost dlouhodobého přežití HAV in vitro je nepochybná. Optimální podmínky pro stabilní vysokou úroveň replikace viru nebyly dosud definitivně identifikovány, což brání studiu jeho biologických vlastností, získání zdroje činidel pro výrobu diagnostických přípravků a návrh vakcín.

Zároveň lze v literatuře nalézt optimističtější názory na tento problém. Řešení všech otázek souvisejících s kultivací viru hepatitidy A je otázkou blízké budoucnosti. Při studiu optimálních podmínek pro reprodukci HAV v kultuře embryonálních ledvinových buněk makaka rhesus byly identifikovány dvě fáze: fáze produkce infekčního viru (až 6-8 dní na úrovni 5. pasáže) a fáze intenzivní akumulace virového antigenu. Bylo také prokázáno, že k nejvýznamnější akumulaci virového antigenu dochází za podmínek tzv. válcové kultivace (rotující baňky). Tato metoda otevírá široké možnosti pro získávání kulturního antigenu ve velkém množství, a v důsledku toho se objeví výchozí materiál pro přípravu diagnostických systémů a výrobu vakcín.

Epidemiologie hepatitidy A

Virus hepatitidy A je pro člověka vysoce patogenní. Podle WHO (1987) stačí k vyvolání onemocnění infekce pouze jedním virionem. Praktická infekční dávka je však pravděpodobně mnohem vyšší. Jediným zdrojem infekce je nakažená osoba. Virus se vylučuje ve velkém množství stolicí 12–14 dní před nástupem žloutenky a během 3 týdnů ikterického období. Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly ve vylučování patogenu u pacientů s ikterickou, anikterickou a asymptomatickou formou hepatitidy A. Cesta infekce je fekálně-orální, převážně vodou, dále domácností a potravinami. Cesta infekce je fekálně-orální, převážně vodou, dále domácností a potravinami. Hlavní (primární) cestou přenosu viru je voda. Možná je i infekce kapénkami ve vzduchu. Náchylnost populace je univerzální. Postiženy jsou převážně děti do 14 let. Onemocnění má výraznou podzimní a zimní sezónnost.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Příznaky hepatitidy A

Inkubační doba se pohybuje od 15 do 50 dnů v závislosti na infekční dávce viru, ale v průměru je 28–30 dnů. Jakmile se virus hepatitidy A dostane do těla, množí se v regionálních lymfatických uzlinách, proniká do krve a poté do jaterních buněk a způsobuje akutní difuzní hepatitidu, která je doprovázena poškozením hepatocytů a retikuloendoteliálních elementů jater a snížením jejich detoxikační a bariérové funkce. K poškození hepatocytů nedochází v důsledku přímého působení viru, ale v důsledku imunopatologických mechanismů. Nejtypičtějším obrazem hepatitidy A je akutní ikterická cyklická forma: inkubační doba, prodromální (preikterické), ikterické období a rekonvalescence. V ohništích infekce je však detekován velký počet pacientů s anikterickými a asymptomatickými formami infekce, jejichž počet výrazně převažuje nad ikterickými („fenomén ledovce“).

Postinfekční imunita je silná a dlouhodobá, způsobená protilátkami neutralizujícími virus a paměťovými buňkami imunitního systému.

Mikrobiologická diagnostika hepatitidy A

Diagnostika hepatitidy A (s výjimkou infekce zvířat - šimpanzů, kosmanů, paviánů, které nemáme k dispozici) je založena na různých imunologických metodách: RSC, imunofluorescenční metoda, hemaglutinace imunitní adheze (komplex virový antigen + protilátka se za přítomnosti komplementu adsorbuje na erytrocyty a způsobuje jejich slepení). Možnosti použití těchto metod jsou však omezené kvůli nedostatku specifických virových antigenů a imunofluorescenční reakce vyžaduje biopsii jater, což je nežádoucí. Metoda imunitní elektronové mikroskopie je spolehlivá a specifická, ale je velmi pracná. Proto je zatím jedinou přijatelnou imunologickou reakcí metoda imunosorbentní analýzy pevné fáze ve formě IFM nebo RIM, zejména v modifikaci "zachycení" imunoglobulinů třídy M. V naší zemi byl pro tento účel navržen testovací systém - "DIAGN-A-HEP". Princip fungování tohoto testovacího systému je následující. Nejprve se na stěny polystyrenových jamek sorbují protilátky proti imunoglobulinům třídy M (antiimunoglobuliny M), poté se přidá testované sérum pacienta. Pokud obsahuje protilátky IgM, navážou se na protilátky třídy M, poté se přidá specifický virový antigen (virus hepatitidy A), který se získá pěstováním v buněčné kultuře. Systém se promyje a přidají se k němu antivirové protilátky značené křenovou peroxidázou. Pokud všechny čtyři složky systému interagují, vznikne čtyřvrstvý „sendvič“:

• antiimunoglobuliny M,
• imunoglobuliny M (proti viru hepatitidy A - v séru studovaného pacienta),
• virový antigen,
• enzymaticky značené antivirové protilátky.

Pro detekci tohoto komplexu se do jamek přidá substrát pro enzym. Pod vlivem enzymu se rozloží a vytvoří se barevný produkt. Intenzitu barvy lze kvantitativně měřit pomocí spektrofotometru nebo fotokolorimetru.

Výhodou metody „zachycení“ IgM je, že protilátky této třídy imunoglobulinů se objevují během primární imunitní odpovědi a indikují aktivní stádium infekce, po prodělaném onemocnění mizí. Antivirové protilátky patřící do třídy IgG naopak přetrvávají dlouho po prodělaném onemocnění a zajišťují získanou imunitu. Pro detekci viru hepatitidy A byla navržena metoda DNA sondy: jako sonda se používá komplementární vRNA DNA.

Léčba hepatitidy A

Vzhledem k tomu, že virová hepatitida narušuje produkci interferonu, je léčba hepatitidy A založena na použití interferonu a induktoru jeho endogenní syntézy, amixinu.

Specifická prevence hepatitidy A

Dříve široce používaná séroprofylaxe hepatitidy A gamaglobulinem se neospravedlnila, proto byl hlavní důraz kladen na provádění očkovací profylaxe, provádí se očkování proti hepatitidě A. Za tímto účelem se vyvíjejí a již používají různé typy vakcín. V Rusku byla účinná vakcína proti hepatitidě A získána již v roce 1995 a nyní se úspěšně používá.