Laboratorní diagnostika osteoartrózy

Ve většině případů se u pacientů s osteoartrózou neprojevují změny v krevních a močových testech, s výjimkou případů synovitidy s významným výpotkem, kdy se může objevit zvýšení sedimentace erytrocytů (ESR), hypergamaglobulinemie, zvýšení hladiny ukazatelů akutní fáze - CRP, fibrinogenu atd. Při vyšetření synoviální tekutiny se nezjistí žádné významné rozdíly od normálních ukazatelů.

V posledních letech probíhá intenzivní hledání možných biologických markerů (BM) degradace a reparace kloubních tkání (zejména chrupavky a kosti). BM by měly tyto dynamické změny odrážet, sloužit jako prediktory prognózy osteoartrózy a markery účinnosti patogenetické léčby. Objev nových a hlubší studium známých biologických markerů umožní lépe porozumět mechanismům patogeneze osteoartrózy. Hlavním úkolem využití biologických markerů metabolismu chrupavky je však posouzení chondroprotektivních vlastností léků a monitorování léčby léky patřícími do skupiny DMO AD – „modifikující onemocnění“.

U osteoartrózy dochází k patologickým změnám především v kloubní chrupavce, dále v subchondrální kosti, synoviální membráně a dalších měkkých tkáních kloubu. Vzhledem k tomu, že naše schopnost přímo vyšetřit tyto struktury je omezená, nejdůležitějšími zdroji pro sběr biologických markerů jsou krev, moč a synoviální tekutina.

Nejvhodnější je vyšetření moči, protože nezahrnuje žádné invazivní zákroky. Podle našeho názoru je ideálním materiálem pro vyšetření denní moč. Vhodnější by byla analýza ranní porce moči, ale možnost jejího použití je založena pouze na skutečnosti, že tento typ analýzy se používá ke stanovení biologických markerů kostního metabolismu u osteoporózy: je známo, že biologické markery podléhají cirkadiánním rytmům a vrchol koncentrace biologických markerů kostního metabolismu nastává v noci. V současné době v literatuře nejsou žádné informace o cirkadiánních rytmech biologických markerů měkkých tkání a chrupavek, takže konečné rozhodnutí o volbě adekvátního testu moči bude učiněno po provedení příslušných studií.

Krevní testy jsou rutinní klinické testy. Některé biologické markery se v krvi již stanovují, například indexy akutní fáze, zatímco jiné by mohly být v blízké budoucnosti zařazeny do standardního seznamu biochemických testů. U každého biologického markeru je nutné specifikovat, ve které složce krve má být stanoven - v plazmě nebo v séru. Výsledky výzkumu naznačují, že koncentrace biologických markerů v krevní plazmě se významně liší od koncentrace v séru. Biologické markery se obvykle stanovují v krevním séru. Podle V. Rayana a kol. (1998) se koncentrace biologických markerů v krvi odebrané z žíly v blízkosti postiženého kloubu a ze vzdálenější žíly liší. Tato data naznačují potřebu standardizace odběrů krve pro studium biologických markerů.

Podle LJ Attencia et al. (1989) tvoří chrupavka synoviálních kloubů dospělého jedince pouze 10 % celkové hmotnosti hyalinní chrupavky v těle, včetně meziobratlových plotének. Stanovení biologických markerů v krvi a moči tedy odráží spíše systémový metabolismus než lokální změny v kloubu postiženém osteoartrózou. Synoviální tekutina je u osteoartrózy nejblíže patologickému ložisku a pravděpodobně nejpřesněji odráží procesy probíhající v postiženém kloubu. Koncentrace biologických markerů v synoviální tekutině může být výrazně vyšší než v krvi, což znamená, že je snazší ji stanovit. Mezi příklady patří epitop 846 agrekanu - v synoviální tekutině je ho 40krát více než v krevním séru, proteiny oligomerní matrix chrupavky (COMP) - 10krát více než v krevním séru. Produkty degradace v synoviální tekutině přesněji odrážejí katabolické procesy v kloubní chrupavce. Odtok molekul ze synoviální tekutiny lokálním lymfatickým systémem může vést ke zmenšení jejich velikosti a dokonce k jejich destrukci.

Navzdory invazivnosti techniky odběru synoviální tekutiny, spojené s řadou možných komplikací, je hodnota stanovení biologických markerů v ní zřejmá. Aby se předešlo problémům s tzv. suchým kloubem, lze bezprostředně před odběrem tekutiny do kloubu injekčně aplikovat 20 ml izotonického roztoku NaCl. Bezprostředně po injekci izotonického roztoku by měl pacient 10krát ohnout a natáhnout končetinu v kloubu a poté rychle odsát zředěnou synoviální tekutinu. Podle EM-JA Thonara (2000) takové zředění synoviální tekutiny ovlivňuje metabolismus v kloubní chrupavce. Výsledky studie FC Robiona a kol. (2001) však naznačují, že opakovaná laváž kolenních kloubů koní nezpůsobuje významné změny v metabolismu chrupavky. Tato data jistě vyžadují potvrzení. Proto musí být u každého biologického markeru ve fázi preklinických studií na zvířatech stanoven vliv laváže kloubu na změny jeho koncentrace.

Dalším důležitým bodem je stanovení poločasu rozpadu v synoviální tekutině a krvi pro každý biologický marker. Bez těchto údajů bude interpretace výsledků testů obtížná. Poločas rozpadu biologicky aktivních látek v krvi je obvykle kratší než v jiných kapalných médiích kvůli efektivnímu vylučování játry a ledvinami. Proto je pro každý biologický marker nutné také určit eliminační cestu. N-propeptid kolagenu typu III je tedy vylučován játry endocytózou zprostředkovanou receptory a neglykosylované fragmenty kolagenu se vylučují hlavně močí, stejně jako osteokalcin. Na endotelových buňkách sinusů jaterních lalůčků jsou receptory pro glykosaminoglykany, takže kyselina hyaluronová a proteoglykany jsou eliminovány játry. Poločas rozpadu kyseliny hyaluronové v krvi je 2–5 minut. Přítomnost synovitidy může urychlit vylučování biologických markerů z kloubů, ačkoli studie na králících nezjistila žádné významné rozdíly v clearance proteoglykanů se synovitidou nebo bez ní. Proto je třeba zkoumat vliv zánětu na změny koncentrace biologických markerů v tělních tekutinách.

Ledviny selektivně filtrují biologické markery. Glykosaminoglykany, které nesou velký negativní náboj, tedy nemusí proniknout bazální membránou ledvin, zatímco glykosaminoglykany, jako je chondroitin-6-sulfát a chondroitin-4-sulfát, jsou v moči detekovány.

Kromě patologie (zejména osteoartrózy) může koncentraci biologických markerů v tělních tekutinách ovlivnit řada faktorů:

1. Cirkadiánní rytmy byly studovány pouze u malého počtu biologických markerů. Byly studovány u markerů kostního metabolismu. Vrcholová koncentrace osteokalcinu se tedy vyskytuje v noci a kolagenových křížových vazeb ráno - v 8 hodin. U revmatoidní artritidy se vrcholová aktivita IL-6 vyskytuje také v noci (kolem 2 hodin) a dříve než u osteokalcinu. Tato data jsou do jisté míry zajímavá ve vztahu k účasti IL-6 na zánětu a fyziologii kostní tkáně. TNF-a naopak cirkadiánní rytmy nemá. Receptory tohoto cytokinu se jim však mohou řídit.
2. Peristaltika. Kyselina hyaluronová je syntetizována synoviálními buňkami (stejně jako mnoha dalšími buňkami) a je potenciálním markerem synovitidy u osteoartrózy a revmatoidní artritidy. Nejvyšší koncentrace hyaluronátu se však nachází ve střevním lymfatickém systému. Není divu, že koncentrace cirkulující kyseliny hyaluronové se může po jídle zvýšit. Proto by se odběr krve pro stanovení biologických markerů měl provádět nalačno nebo 3 hodiny po jídle. A vliv peristaltiky na hladinu biologických markerů v krvi vyžaduje další studium.
3. Fyzická aktivita ráno po spánku vede u zdravých jedinců ke zvýšení koncentrace kyseliny hyaluronové v krvi, MMP-3 a epitopu keratan sulfátu. Fyzická aktivita může změnit koncentraci některých markerů jak v synoviální tekutině, tak v krevním séru. Toto zvýšení je výraznější u pacientů s revmatoidní artritidou, navíc koncentrace biologických markerů koreluje s klinickým stavem těchto pacientů.
4. Onemocnění jater a ledvin. Jaterní cirhóza způsobuje významné zvýšení hladiny kyseliny hyaluronové v séru a pravděpodobně ovlivňuje eliminaci proteoglykanů. Je známo, že onemocnění ledvin ovlivňují koncentrace osteokalcinu. Tato problematika vyžaduje také hlubší studium.
5. Věk a pohlaví. Během růstu se zvyšuje aktivita buněk růstové ploténky, což je doprovázeno zvýšením koncentrace kosterních biologických markerů v krevním séru. Příkladem je zvýšení koncentrace fragmentů agrekanů a kolagenu typu II v periferní krvi a moči rostoucích zvířat. Interpretace analýz biologických markerů u dětí a dospívajících s muskuloskeletálními onemocněními je proto obtížná. U mnoha biologických markerů byl zjištěn nárůst koncentrace se stárnutím. U mužů koncentrace biologických markerů v chrupavčité a kostní tkáni významně převyšuje koncentraci u žen. U žen v menopauze a postmenopauze lze navíc očekávat změny v koncentraci biologických markerů metabolismu chrupavky, podobné těm, které jsou pozorovány v kostní tkáni.
6. Chirurgické zákroky mohou také ovlivnit hladiny biologických markerů a tento účinek může přetrvávat několik týdnů.

Koncept biologických markerů osteoartrózy je založen na předpokladu, že odrážejí určité aspekty metabolických procesů v kloubních tkáních. Vztah mezi koncentracemi biologických markerů v tělesných tekutinách a metabolismem chrupavky, synoviální a dalších tkání se však ukázal jako velmi složitý.

Například koncentrace markerů degradace ECM kloubní chrupavky v synoviální tekutině může záviset nejen na stupni degradace samotné matrix, ale také na dalších faktorech, jako je stupeň eliminace molekulárních fragmentů ze synovie, který byl již zmíněn výše, a také na množství chrupavčité tkáně zbývající v kloubu.

Navzdory výše uvedeným skutečnostem koncentrace biologických markerů v synoviální tekutině obecně koreluje s metabolismem molekul ECM kloubní chrupavky. Například změny v koncentraci fragmentů agrekanu, epitopu 846, COMB a C-propeptidu kolagenu II v synoviální tekutině po poranění kloubu a během rozvoje osteoartrózy jsou v souladu se změnami v intenzitě metabolismu agrekanu, COMB a kolagenu II v experimentálních modelech osteoartrózy u zvířat/a in vivo a v kloubní chrupavce pacientů s osteoartrózou/a in vitro.

Identifikace specifických zdrojů molekulárních fragmentů je složitý proces. Zvýšené uvolňování molekulárních fragmentů může nastat jak v důsledku obecného zvýšení degradačních procesů, které nejsou kompenzovány syntetickými procesy, tak v důsledku zvýšené degradace se současným zvýšením intenzity syntézy stejných molekul ECM; v druhém případě se koncentrace molekul ECM nemění. Je proto nutné hledat markery specifické pro degradaci a syntézu. Příkladem prvního jsou fragmenty agrekanu a druhého C-propeptid kolagenu 11.

I když je biologický marker asociován se specifickým aspektem metabolismu, je nutné vzít v úvahu specifické rysy tohoto procesu. Identifikované fragmenty mohou například vzniknout v důsledku degradace de novo syntetizované molekuly, která se dosud neintegrovala do funkčního ECM, molekuly, která se do ECM právě integrovala, a nakonec permanentní molekuly ECM, která je důležitou funkční součástí zralé matrix. Dalším problémem je definice specifické zóny matrix (pericelulární, teritoriální a interteritoriální matrix), která sloužila jako zdroj biologických markerů detekovaných v synoviální tekutině, krvi nebo moči. Studie in vitro naznačují, že intenzita metabolismu v jednotlivých zónách ECM kloubní chrupavky se může lišit. Studium určitých epitopů asociovaných se sulfatací chondroitin sulfátu může pomoci identifikovat populaci de novo syntetizovaných molekul agrekanů.

Lze předpokládat, že výskyt fragmentů molekul normálně přítomných v extracelulární matrici chrupavky (ECM) v synoviální tekutině souvisí s metabolismem chrupavčité matrix. Není tomu však vždy tak, protože to závisí na řadě faktorů, zejména na tom, o kolik koncentrace dané molekuly v kloubní chrupavce převyšuje koncentraci v jiných kloubních tkáních a o kolik intenzita jejího metabolismu v chrupavce převyšuje intenzitu v jiných kloubních tkáních. Celková hmotnost agrekanu v kloubní chrupavce tedy výrazně převyšuje hmotnost například v menisku kolenního kloubu, zatímco celková hmotnost COMB v menisku se prakticky neliší od hmotnosti v kloubní chrupavce. Stromelysin-1 produkují jak chondrocyty, tak synovocyty, ale celkový počet buněk v synoviální membráně převyšuje počet buněk v chrupavce, takže významná část stromelysinu-1 nalezeného v synoviální tekutině je s největší pravděpodobností synoviálního původu. Identifikace specifického zdroje biologických markerů je tedy extrémně obtížná a často nemožná.

Při studiu biologických markerů v krevním séru a moči vyvstává problém určení jejich možného extraartikulárního zdroje. Navíc v případě monoartikulárního poškození se biologické markery vylučované postiženým kloubem mohou mísit s markery vylučovanými intaktními klouby, včetně kontralaterálních. Kloubní chrupavka tvoří méně než 10 % celkové hmotnosti hyalinní chrupavky v těle. Stanovení biologických markerů v krvi a moči proto může být opodstatněné spíše u polyartikulárních neboli systémových onemocnění (ve vztahu k osteoartróze - u generalizované osteoartrózy).

Požadavky na biologické markery závisí na tom, zda se používají jako diagnostický, prognostický nebo hodnotící test. Například diagnostický test určuje rozdíly mezi zdravými jedinci a pacienty s osteoartrózou, což se vyjadřuje z hlediska citlivosti a specificity testu. Prognostický test identifikuje jedince v kohortě, u kterých je nejpravděpodobnější rychlá progrese onemocnění. A konečně, hodnotící test je založen na schopnosti markeru sledovat změny v čase u jednotlivého pacienta. Kromě toho lze biologické markery použít k určení citlivosti pacientů na konkrétní lék.

Zpočátku se předpokládalo, že biologické markery by mohly sloužit jako diagnostické testy, které by pomohly odlišit kloub postižený osteoartrózou od intaktního a také by mohly provádět diferenciální diagnostiku s jinými onemocněními kloubů. Stanovení koncentrace keratansulfátu v krevním séru bylo proto považováno za diagnostický test generalizované osteoartózy. Následné studie však ukázaly, že tento biologický marker může v určitých situacích odrážet degradaci chrupavčitých proteoglykanů. Ukázalo se, že koncentrace biologických markerů v krevním séru závisí na věku a pohlaví vyšetřované osoby.

Předpokládané biologické markery metabolismu kloubní tkáně v synoviální tekutině a krevním séru pacientů s osteoartritidou

Biologický marker	Proces	V synoviální tekutině (odkazy)	V krevním séru (odkazy)
1. Chrupavka
Aggrecan
Fragmenty jádrových proteinů	Degradace agrekanů	Lohmander LS. a kol., 1989; 1993	Thonar EJMA a kol., 1985; Campion GV a kol., 1989; MehrabanF. a kol., 1991; Spector TD a kol., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR a kol., 1994) t (Poole AR a kol., 1994)
Epitopy jádrových proteinů (neoepitopy specifické pro štěpnou zónu)	Degradace agrekanů	Sandy JD a kol., 1992; LohmanderLS. a kol., 1993; LarkM.W. a kol., 1997
Epitopy keratonických sulfátů	Degradace agrekanů	Campion GV a kol., 1989; Belcher C a kol., 1997
Epitopy chondroitin sulfátů (846, ЗВЗ, 7D4 a DR.)	Syntéza/degradace agrekanů	Poole AR a kol., 1994; HazellP.K. a kol., 1995; Slater RR Jr. a kol., 1995; Plaas AHK a kol., 1997; 1998; Lohmander LS. a kol., 1998
Poměr chondroitin-6 a chondroitin-4 sulfátů	Syntéza/degradace agrekanů	Shinme i. M. a kol. 1993
Malé proteoglykany	Degradace malých proteoglykanů	Witsch-Prehm, P. a kol., 1992
Matrixové proteiny chrupavky
HOMP	Degradace HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. a kol., 1994; Petersson IF a kol., 1997	Šaríf M. a kol., 1995
Chrupavčité kolageny
C-propeptid kolagenu typu II	Syntéza kolagenu II	ShinmeiM. a kol., 1993; YoshiharaY. a kol., 1995; LohmanderLS. a kol., 1996
Fragmenty alfa řetězce kolagenu typu II	Degradace kolagenu II	Hollander AP a kol., 1994; Billinghurst RC a kol., 1997; AtleyLM. a kol., 1998
MMP a jejich inhibitory	Syntéza a sekrece	Ze synoviální membrány nebo kloubní chrupavky?
II. Menisky
HOMP	Degradace HOMP	Z kloubní chrupavky, menisků nebo synoviální membrány?
Malé proteoglykany	Degradace malých proteoglykanů
III. Synoviální membrána
Kyselina hyaluronová	Syntéza kyseliny hyaluronové		Goldberg RL a kol., 1991; Hedin P.-J. a kol., 1991; Sharif M. a kol., 1995
MMP a jejich inhibitory
Stromelysin (MMP-3)	Syntéza a sekrece MMP-3	LohmanerLS a kol., 1993	ZuckerS. a kol., 1994; YoshiharaY. a kol., 1995
Intersticiální kolagenáza (MMP-1)	Syntéza a sekrece MMP-1	Clark IM a kol., 1993; Lohmander LS a kol., 1993	Manicourt DH a kol., 1994
TIMP	Syntéza a sekrece TIMP	Lohmander LS. a kol., 1993; Manicourt DH a kol., 1994	Yoshihara Y. a kol., 1995
N-propeptid kolagenu typu III	Syntéza/degradace kolagenu III	Šaríf M. a kol., 1996	Šaríf M. a kol., 1996

Řada studií prokázala rozdíly v koncentracích agrekanových fragmentů, HOMP a MMP a jejich inhibitorů v kloubní tekutině kolenních kloubů zdravých dobrovolníků, pacientů s revmatoidní artritidou, reaktivní artritidou nebo osteoartrózou. Navzdory skutečnosti, že autoři prokazují významné rozdíly v průměrných koncentracích biologických markerů, je interpretace dat obtížná, protože srovnávací analýza byla profilová a retrospektivní. Prognostické vlastnosti těchto testů je třeba potvrdit v prospektivních studiích.

Biologické markery lze použít k posouzení závažnosti onemocnění nebo stadia patologického procesu. V případě osteoartrózy se závažnost onemocnění a jeho stadia posuzují na základě výsledků rentgenových vyšetření, artroskopie, a také na základě závažnosti bolestivého syndromu, omezení funkce postižených kloubů a funkční kapacity pacienta. L. Dahlberg a kol. (1992) a T. Saxne a D. Heinegard (1992) navrhli použití některých molekulárních markerů metabolismu kloubní chrupavky pro další charakterizaci stadií osteoartrózy. Pro zavedení těchto biologických markerů do lékařské praxe je však nutný další výzkum v tomto směru.

Existují zprávy o možném využití biologických markerů jako prognostických testů. Například bylo prokázáno, že koncentrace kyseliny hyaluronové (ale nikoli keratansulfátu) v séru pacientů s osteoartrózou kolene na začátku studie indikuje progresi gonartrózy během 5 let pozorování. U stejné populace pacientů bylo prokázáno, že zvýšený obsah COMB v séru pacientů s gonartrózou během prvního roku po zahájení studie byl spojen s radiografickou progresí během 5 let pozorování. Studie biologických markerů u pacientů s revmatoidní artritidou ukázaly, že koncentrace COMB, epitopu 846, chondroitinsulfátu v séru je spojena s rychlejší progresí onemocnění. Tyto výsledky, získané u malých skupin pacientů, často neprokazují sílu vztahu mezi hladinou biologických markerů a progresí onemocnění, tj. jsou zapotřebí další studie, prospektivní a na větších kohortách pacientů.

TD Spector a kol. (1997) zjistili mírné zvýšení sérového CRP u pacientů s časnou osteoartrózou a uvedli, že CRP může být prediktorem progrese osteoartrózy. V tomto případě zvýšení CRP odráží procesy poškození kloubní tkáně a může být spojeno se zvýšením kyseliny hyaluronové, což také naznačuje progresi onemocnění. Je možné, že synoviální membrána je zodpovědná za většinu kyseliny hyaluronové stanovené v séru, což naznačuje přítomnost mírné synovitidy. Zvýšené koncentrace stromelysinu MMP v synoviální tekutině a séru pacientů s osteoartrózou a po poranění kloubu mohou být také spojeny s mírnou synovitidou.

Biologické markery lze konečně použít jako kritéria účinnosti v klinických studiích léků a také pro monitorování patogenetické léčby. Existují však dva vzájemně související problémy: nedostatek léků s prokázanými vlastnostmi „modifikujícími strukturu“ nebo „modifikujícími onemocnění“ je z velké části způsoben nedostatkem spolehlivých biologických markerů a naopak nedostatek specifických markerů metabolismu kloubní tkáně je z velké části způsoben nedostatkem kontrolovaných studií léků v těchto skupinách.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]