Omezení, nebezpečí a komplikace transplantace buněk

Plastové regenerační přípravek je založena na skutečnosti, na klinice a toti- vlastnosti pluripotentních kmenových a progenitorových buněk, což umožňuje in vitro a in vivo pro vytvoření předem stanovené buněčné linie repopulating poškozené tkáně a orgány lidského pacienta.

Skutečná možnost použití embryonálních kmenových buněk a kmenových buněk konečných tkání (tzv. Dospělé kmenové buňky) člověka pro terapeutické účely již není pochyb. Nicméně experti z Národních a Lékařských akademií Spojených států (USA) doporučují podrobnější studium vlastností kmenových buněk v experimentech na přiměřených biologických modelech a objektivně zhodnotit všechny důsledky transplantace a teprve pak použít kmeňové buňky v klinice.

Je zjištěno, že kmenové buňky jsou součástí tkáňových derivátů všech tří embryonálních letáků. Kmenové buňky se nacházejí v sítnici, rohovky, kůže, epidermis, kostní dřeně a periferní krve, v cévách, dřeň zubu, ledviny, epitel trávicího traktu, slinivky břišní a játra. S pomocí moderních metod je dokázáno, že kmenové nervové buňky jsou lokalizovány v dospělém mozku a míchu. Tyto senzační zjištění přitahují pozornost vědců i médií, jako neurony v mozku byly klasickým příkladem populace statické buňky, které nemohou být obnoveny. Oba časné a pozdní období ontogeneze kvůli nervových kmenových buněk v lidských a zvířecích mozku generovány neurony, astrocyty a oligodendrocyty (Kmenové buňky: vědecký pokrok a budoucí směry výzkumu Nat Inst, zdravotnictví USA ..).

Nicméně za normálních podmínek se plasticita kmenových buněk definitivních tkání nezobrazuje. Pro realizaci plastického potenciálu kmenových buněk definitivních tkání je nutno je izolovat a potom kultivovat v médiu cytokiny (LIF, EGF, FGF). Navíc deriváty kmenových buněk úspěšně přežívají pouze tehdy, když jsou transplantovány do těla zvířete s depresivním imunitním systémem (y-záření, cytostatika, busulfan atd.). K dnešnímu dni neexistují přesvědčivé důkazy plasticity kmenových buněk u zvířat, která nebyla ozařována nebo jinak vystavena hluboké imunosupresi.

Za takových okolností, nebezpečné potence PGC se projevují především v jejich ektopické transplantaci oblasti - podkožní injekce ESK imunodeficientních myší v místě vpichu vytvořené teratokarcinomu. Kromě toho, v průběhu lidských embryonálních frekvence vývoje abnormalit chromozómu než v embryogenezi u zvířat. Ve stadiu blastocysty pouze 20 až 25% z lidských embryí se skládají z buněk s normálním karyotypem, a v naprosté většině časných lidských embryí získaných po oplodnění in vitro, chromosomální mozaika detekován chaotické a velmi často numerické i strukturální aberace.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Příznivý účinek kmenových buněk

Předběžné výsledky klinických studií potvrzují příznivý účinek kmenových buněk na pacienta, zatím však neexistují žádné informace o dlouhodobých důsledcích transplantace buněk. V literatuře, zpočátku dominují zprávy o pozitivních výsledků transplantace fragmentů dřeně embryí u Parkinsonovy choroby, ale pak se začaly objevovat data popírá účinné terapeutické účinky embryonální nebo fetální nervové tkáně transplantované do mozku pacientů.

V polovině století XX obnova krvetvorby byl poprvé objeven v letálně ozářených zvířat po intravenózní transfuzi buněk kostní dřeně, a v roce 1969 americký výzkumník D. Thomas provedl první transplantaci kostní dřeně člověka. Nedostatek znalostí o mechanismu imunologického dárce neslučitelnost kostní dřeně a příjemce při způsobené vysokou úmrtností v důsledku častého neprizhivleniya štěpu a vývoj reakce „štěp versus hostitel“. Objev hlavního histokompatibilního komplexu, který se skládá z lidských leukocytů antigenu (HbA) a zlepšení způsobů psaní je možné výrazně zvýšit míru přežití po transplantaci kostní dřeně, což vedlo k rozsáhlému tohoto způsobu léčby v onkologii a hematologii. Po deseti letech byla provedena první transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSC) získaná z periferní krve pomocí leukaferézy. V roce 1988 ve Francii k léčbě dítěte s Fanconiho anemií jako zdroj HSC to bylo poprvé použito pupečníkovou krev, a do konce roku 2000 v tisku začaly objevovat o schopnosti HSC se diferencovat do buněk různých typů tkání, které potenciálně rozšiřuje rozsah jejich klinické použití. Ukázalo se však, že materiál pro transplantaci společně s GSK obsahuje významné množství nehemopoetických buněk, které mají různou povahu a vlastnosti. V souvislosti s tím se vyvíjejí metody čištění štěpů a kritéria pro stanovení jejich buněčné čistoty. Konkrétně se používá pozitivní imunoterapie CD34 + buněk, která umožňuje izolovat HSC pomocí monoklonálních protilátek.

[8], [9], [10], [11], [12]

Komplikace terapie kmenovými buňkami

Komplikace transplantace kostní dřeně jsou nejčastěji hematologické a jsou spojeny s prodlouženým obdobím iatrogenní pancytopenie. Mezi nejčastější infekce patří anémie, anémie a krvácení. V tomto ohledu je mimořádně důležité zvolit optimální způsob odběru, zpracování a skladování kostní dřeně pro maximální zachování kmenových buněk, což zajistí rychlé a stabilní obnovení hematopoézy. Při charakterizaci transplantace je v současné době akceptováno vyhodnocení následujících parametrů: počet mononukleárních a / nebo nukleovaných buněk, jednotek tvořících kolonie a obsah SB34-pozitivních buněk. Bohužel tyto indikátory poskytují pouze nepřímý odhad skutečné hematopoetické schopnosti populace transplantací kmenových buněk. K dnešnímu dni existují absolutně přesné parametry pro určení dostatečnosti transplantace pro dlouhodobé obnovení hemopoézy u pacientů dokonce i v autologní transplantaci kostní dřeně. Vývoj společných kritérií je extrémně obtížný z důvodu nedostatku pevných standardů zpracování, kryokonzervace a testování štěpu. Kromě toho je třeba vzít v úvahu celou řadu faktorů, které ovlivňují parametry úspěšné obnovy hematopoézy u každého konkrétního pacienta. V autologní transplantaci kostní dřeně Nejdůležitější z nich je počet předchozích léčebných režimech, zejména udržovací léčby pacienta, doba onemocnění, která se vyrábí v kostní dřeni systému sběru kolonie stimulující faktory aplikace v období po transplantaci. Kromě toho by nemělo být zapomenuto, že chemoterapie, která předchází fetální transplantace, může mít negativní vliv na kmenové buňky kostní dřeně.

Výskyt závažných toxických komplikací se významně zvyšuje při alogenní transplantaci kostní dřeně. V této souvislosti jsou zajímavé statistické údaje o transplantaci alogenní kostní dřeně při talasémii. Ve zprávách Evropské transplantační skupiny o kostní dřeni bylo zaznamenáno přibližně 800 transplantací kostní dřeně u pacientů s velkou talasemií. Alogenní transplantace v thalassemia ve většině případů provádí z HLA-identický sourozenci, což je spojeno se závažným komplikacím a vyšší úmrtnosti v transplantaci kmenových buněk materiály týkající částečně kompatibilní nebo uzavřeno nepříbuzných dárců. Aby se minimalizovalo riziko fatálních infekčních komplikací, pacienti jsou umístěny v izolovaných aseptickém boxu s laminárním prouděním, jsou nízké nebo nebakteriální stravy. Pro bakteriální dekontaminaci střev per os předepisují neresorpční formy antibiotik, antifungální léky. Aby se zabránilo intravenózní amfotericin B. Prevence systémových infekcí pevných amikacin a ceftazidim, které označují den před transplantací, zatímco pokračuje v léčbě propustit pacienty. Všechny přípravky v krvi před ozařováním jsou ozařovány v dávce 30 Gy. Parenterální výživa během transplantace je předpokladem a okamžitě začíná omezením příjmu potravy přirozeně.

Řada komplikací spojených s vysokou toxicitou imunosupresiv, které často způsobit nevolnost, zvracení a mukozitida, poškození ledvin a intersticiální zápal plic. Jednou z nejzávažnějších komplikací chemoterapie je veno-okluzivní onemocnění jater, které vedlo ke smrti v časném období po transplantaci. Mezi rizikové faktory pro žilní trombózou portálového systému játrech je třeba poznamenat, věk pacienta, přítomnost hepatitidy a jaterní fibrózy, a drží imunosupresivní terapií po transplantaci kostní dřeně. Venookklyuzionnaya nemoc je zvláště nebezpečná v thalassemia, který je doprovázen hemosideróza fibrózy jater a hepatitida - časté satelity trans fusional terapii. Žilní trombóza portálového systému jater vyvíjí během 1-2 týdnů po transplantaci a je charakterizován rychlým zvýšení krevního bilirubinu a transamináz, progresivní hepatomegalie, ascites, encefalopatie, a bolest v horní části břicha. Histologicky pitva materiál definovaný v poškozením endotelu, subendoteliální krvácení, poranění tsentrolobulyarnyh hepatocyty, trombotické obstrukce jaterní žilek a centrální žíly. U pacientů s talasemií byly popsány případy smrtelné srdeční zástavy spojené s toxickými účinky cytostatiky.

Při přípravě na transplantaci způsobují cyklofosfamid a busulfan často toxickou hemoragickou cystitidu s patologickými změnami v uroepiteliálních buňkách. Použití cyklosporinu A v transplantaci kostní dřeně je často doprovázeno účinky nefro- a neurotoxicity, syndromu hypertenze, retence tekutin v těle a cytolýzy hepatocytů. Porušení sexuální a reprodukční funkce je častěji pozorováno u žen. U malých dětí po transplantaci obvykle trpí vývoj pubertu, ale u starších dětí může patologie vývoje genitální sféry být velmi závažná - až po sterilitu. Komplikace přímo související s transplantací samy o sobě zahrnují odmítnutí alogenních buněk kostní dřeně, neslučitelnost v systému ABO, akutní a chronické formy reakce "štěpu versus hostitel".

Do pacienta po transplantaci ABO-nekompatibilní kostní dřeně typu idioagglutinin „hostitele proti dárcovské ABO“ vyrobeno v 330-605 dnů po transplantaci, což může vést k prodlouženému hemolýzou a prudkým nárůstem potřeby krevní transfuze. Uvedené komplikace je zabráněno transfuze erytrocytů skupin pouze 0. Po transplantaci v počtu pacientů, autoimunitní neutropenie, trombocytopenie, pancytopenie, nebo pro opravu, která musí být provedena splenektomie.

V 35-40% příjemců akutní reakce „štěp versus hostitel“ se vyvíjí v průběhu 100 dnů po transplantaci alogenní hemoglobin identické kostní dřeni. Stupeň kožních lézí, jater a střev se pohybuje od vyrážka, hyperbilirubinemie, průjem a mírné k deskvamace kůže, střevní obstrukce, a akutní selhání jater. Pacienti s thalassemia frekvence akutní reakce „štěp versus hostitel“ I míře po transplantaci kostní dřeně, je 75%, II a vyšší rozsah - 11 až 53%. Chronická reakce „štěp versus hostitel“ tak, jak systémové multiorgánové syndrom obvykle se vyvíjí v průběhu 100-500 dnů po transplantaci alogenní kostní dřeně u 30-50% pacientů. Kůže, ústa, játra, oči, jícnu a horní dýchací cesty jsou ovlivněny. Rozlišovat omezenou formu chronické reakce „štěp versus hostitel“, když na postiženou kůži a / nebo jater, a rozšířené, generalizované kožní léze v kombinaci s chronickou agresivní hepatitidu, oční choroby, slinných žláz nebo jiného orgánu. Příčinou smrti jsou často infekční komplikace, které jsou důsledkem závažné imunodeficience. V thalassemia chronické mírné formě reakčního „štěp versus hostitel“ byla nalezena v 12%, střední - 3% a těžká - má 0,9% příjemců HLA-kompatibilní alogenní kostní dřeně. Závažnou komplikací v transplantaci kostní dřeně je odmítnutí transplantátu, které se rozvíjí 50-130 dnů po operaci. Frekvence odmítnutí závisí na režimu kondicionování. Zejména pacienti s thalassemia zpracuje při přípravě samotného metotrexátu, odmítnutí štěpu kostní dřeně je pozorována u 26% případů, kombinace methotrexátu s cyklosporinu A - 9%, a při přiřazování pouze cyklosporin A - 8% případů (Haziyev atd. ., 1995).

Infekční komplikace po transplantaci kostní dřeně, způsobené viry, bakterie a plísně. Jejich vývoj je spojen s hlubokou neutropenie, který je vyvolán v průběhu chemoterapie klimatizace, cytostatika porazit slizniční bariéry a reakce „štěp versus hostitel“. V závislosti na době vývoje, tam jsou tři fáze infekce. V první fázi (vyvíjí v prvním měsíci po transplantaci) dominuje poškození slizniční bariéry a neutropenie, často doprovázen virovou infekcí (herpes, virus Epstein-Barrové, cytomegalovirus, varicella zoster), stejně jako infekcí způsobených grampolozhi - zánětlivých a gram-negativních bakterií, Candida houby , aspergilomy. V období krátce po transplantaci (druhý a třetí měsíců po transplantaci) je nejzávažnější cytomegalovirové infekce, což často vede k úmrtí pacientů ve druhé fázi infekce. Thalassemia cytomegalovirové infekce po transplantaci kostní dřeně, se vyskytuje v 1.7-4.4% příjemců. Třetí fáze je pozorována na konci po transplantaci období (tři měsíce po operaci), a je charakterizována těžkou kombinovanou imunodeficiencí. Tato doba je obvykle nalezen infekcí způsobených Varicella zoster, Streptococcus, Pneumocystis Carini, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, a hepatotropní viry. Mortalita talasemie u pacientů po transplantaci kostní dřeně je spojena s bakteriální a plísňové sepse, idiopatické intersticiální a cytomegalovirem zápal plic, syndrom akutní respirační tísně, akutní srdeční selhání, srdeční tamponády, mozkové krvácení, onemocnění venookklyuzionnoy jater a akutní reakce „štěp versus hostitel“.

V současné době bylo dosaženo jistého pokroku při vývoji metod pro izolaci čisté populace kmenových hemopoetických buněk z kostní dřeně. Byla zlepšena technika získání plodové krve z pupeční šňůry a byly vyvinuty metody pro izolaci krvetvorných buněk z pupočníkové krve. Ve vědeckém tisku jsou zprávy, že při kultivaci v médiích s cytokiny jsou hematopoetické kmenové buňky schopné množit. Při použití speciálně navržených bioreaktorů pro expanzi HSC se výrazně zvyšuje biomasa kmenových hemopoetických buněk izolovaných z kostní dřeně, periferní nebo pupočníkové krve. Možnost rozšíření HSC je důležitým krokem v klinickém vývoji transplantace buněk.

Avšak před reprodukcí HSC in vitro je nutné izolovat homogenní populaci hematopoetických kmenových buněk. Toho se obvykle dosáhne za použití markerů, které umožňují selektivně označit HSC monoklonální protilátky kovalentně spojených s magnetickým nebo fluorescenční značky, a zvolit, které se vhodným pro třídění buněk. Současně nebyla vyřešena otázka fenotypových charakteristik hematopoetických kmenových buněk. A. Petrenko., V. Hryschenko (2003), jako kandidáty pro GSK ošetřené buňky, které jsou přítomny na povrchu CD34, AC133 a antigeny methyl a žádný CD38, HLA-DR a dalšími markery diferenciace (buněk s fenotypem CD34 + Liir). Lineárními diferenciačních markerů (linií, Lin) zahrnují glykoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Považován za perspektivní pro transplantaci buněk s fenotypem CD34 + CD45RalüW CD71low, tak i CD34 + Thyl + CD38low / c-kit / nízká.

Problém počtu HSC, který je dostatečný pro účinnou transplantaci, zůstává problémem. V současné době jsou zdrojem kmenových buněk tvořících kostní dřeň, periferní a pupočníkovou krev, stejně jako embryonální játra. Rozšíření kmenových hemopoetických buněk je dosaženo jejich kultivací v přítomnosti endotheliocytů a hematopoetických růstových faktorů. V různých protokolech se pro vyvolání proliferace HSC používají myeloproteiny, SCF, erytropoetin, růstové faktory podobné inzulínu, kortikosteroidy a estrogeny. Při použití kombinací cytokinů in vitro je možné dosáhnout významného zvýšení koncentrace HSC s vrcholem jejich uvolňování na konci druhého týdne kultivace.

Tradičně se krevní šňůra HSC používá hlavně u hemoblastóz. Nicméně, je minimální dávka krvetvorných buněk, které jsou nezbytné pro úspěšné transplantaci krevních buněk pupečníkové je 3,7 x 10 ⁷ jaderných buněk na 1 kg tělesné hmotnosti příjemce. Použití menších množství HSC významně zvyšuje riziko selhání štěpu a relapsu onemocnění. Transplantace krvetvorných buněk pupečníkové krve se proto používá především při léčbě hemoblastózy u dětí.

Bohužel, stále není standardní prázdné a standardizované protokoly klinické využití krvetvorných buněk pupečníkové krve. V souladu s tím se kmenové buňky z pupečníkové krve nejsou právně uznávány jako zdroj krvetvorných kmenových buněk pro transplantaci. Navíc neexistují žádné etické nebo právní předpisy, kterými se řídí činnost a organizaci bank pupečníkové krovb které jsou k dispozici v zahraničí. Mezitím, za bezpečnost transplantace pupečníkové krve, všechny vzorky musí být pečlivě sledováni. Před odběrem krve na začátku těhotné ženy musí získat její souhlas. Každý těhotné, musí být zkoumána na vozíku HBsAg, protilátky proti viru hepatitidy C, HIV, a syfilis. Každý vzorek z pupečníkové krve, musí být testovány na standardní počet jaderných buněk a CD34 + schopnosti tvořit kolonie. Kromě toho, HbA provedena psaní, krevních skupin ABO a jeho členství v Rh faktoru. Zkušební postupy jsou zapotřebí oříznout na bakteriální sterility, sérologických testů na HIV-1 a HIV-2 infekci, HBsAg, viru hepatitidy C, cytomegalovirus infekci, NTLY NTLY-1 a-II, syfilis, toxoplazmózu. Kromě toho pro detekci cytomegaloviru a polymerázové řetězové reakce HIV se provádí. Zdá se, že vhodné doplnit analýzu protokoly testování pupečníkové krve HSC k identifikaci takových genetických onemocnění, jako je thalassemia a srpkovitá anémie, adenosin deaminázy, nedostatek agamaglobulinémií Bruton, onemocnění Harlera a sázkaře.

V další fázi přípravy na transplantaci vzniká otázka zachování GSK. Nejvíce nebezpečné pro životaschopnost buněk při jejich přípravě jsou postupy zmrazování a rozmrazování. Při zmrazení hemopoetických buněk může být značná část z nich zničena kvůli tvorbě krystalů. Pro snížení podílu buněčné smrti se používají speciální látky - kryoprotektanty. Nejčastěji se jako kryoprotektant používá DMSO při konečné koncentraci 10%. U DMSO je však tato koncentrace charakterizována přímým cytotoxickým účinkem, který se projevuje i za podmínek minimální expozice. Snížená cytotoxický účinek dosažený udržováním pevné nulový teplotní expoziční režim a dodržování regulace zpracování materiálu v průběhu a po rozmrazení (rychlost všech manipulací Použití více pro praní postupy). Nepoužívejte koncentraci DMSO menší než 5%, protože v tomto případě dochází k masové smrti hematopoetických buněk během období zmrazení.

Přítomnost nečistot červených krvinek v suspenzi směsi GSK vytváří nebezpečí vzniku reakce inkompatibility pro antigeny erytrocytů. Současně s odstraněním erytrocytů se ztráta hematopoetických buněk významně zvyšuje. V souvislosti s tím byl navržen postup pro nefrakcionovanou izolaci GSK. V tomto případě, pro ochranu jaderné buňky před škodlivými účinky nízkých teplot za použití 10% roztoku DMSO a chlazení při konstantní rychlosti (HS / min) na teplotu -80 ° C, načež se suspenze buněk se zmrazí v kapalném dusíku. Předpokládá se, že touto kryoprezervační technikou probíhá částečná lýza erytrocytů, proto krevní vzorky nevyžadují frakcionaci. Před transplantací se buněčná suspenze rozmrazí, promyje se bez hemoglobinu a DMSO v roztoku lidského albuminu nebo séra. Zachování hematopoetické progenitorové použití této metody je skutečně vyšší než po pupečníkové krve frakcionaci, ale nebezpečí komplikací v důsledku transfuzí ABO nekompatibilní transfuze erytrocytů uložených.

Zavedení systému bank pro ukládání testovaných HSC a vzorků HSC by mohlo vyřešit výše uvedené problémy. Pro to je však nutné vyvinout etické a právní normy, o nichž se stále diskutuje. Před vytvořením bankovní sítě je nutné přijmout řadu ustanovení a dokumentů o standardizaci postupů pro odběr vzorků, frakcionaci, testování a psaní a kryokonzervaci GCW. Předpokladem účinné aktivity bank GSK je pořádání počítačových databázích pro vztah s dárcem kostní dřeně eviduje World Association (WMDA) a Národní dárce kostní dřeně Spojených států programu (NMDP).

Kromě toho je nezbytné optimalizovat a standardizovat metody expanze HSC in vitro, primárně krvetvorných buněk krvetvorby. Reprodukce HSC pupoční krve je nezbytná pro zvýšení počtu potenciálních příjemců kompatibilních s HLA systémem. Vzhledem k malým objemům pupočníkové krve není množství HSC v něm obsažené zpravidla schopné poskytnout repopulaci kostní dřeně u dospělých pacientů. Současně, pro provádění nesouvisejících transplantací je nutné mít přístup k dostatečnému počtu typických vzorků GSK (od 10 000 do 1 500 000 na 1 příjemce).

Transplantace kmenových hemopoetických buněk nevylučuje komplikace doprovázející transplantaci kostní dřeně. Analýza ukazuje, že při transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve se vážné formy akutní reakce "štěp-versus-hostitel" vyvíjejí u 23%, chronické u 25% pacientů. U onkohematologických pacientů se recidivy akutní leukémie během prvního roku po transplantaci HSC pupočníkové krve objevily v 26% případů.

V posledních letech se intenzivně vyvíjejí metody transplantace periferních hematopoetických kmenových buněk. Obsah HSC v periferní krvi je tak malý (existuje 1 GSK na 100 000 krevních buněk), že jejich izolace bez zvláštní přípravy nemá smysl. Dárce je proto předtím podáván k léčbě uvolňování hematopoetických buněk kostní dřeně do krve. Za tímto účelem se používají tak daleko neškodné drogy, jako je cyklofosfamid a faktor stimulující kolonie granulocytů. Ale i po postupu mobilizace HSC v periferní krvi nepřesahuje obsah buněk CD34 + 1,6%.

Pro mobilizaci HSC na klinice se C-CEC běžněji používá, což se vyznačuje poměrně dobrou snášenlivostí, s výjimkou téměř pravidelného vzhledu bolesti v kostech. Je třeba poznamenat, že použití moderních krevních separátorů nám umožňuje účinně izolovat kmenové progenitory hematopoézy. V podmínkách normální krvetvorby je však nutné provést minimálně 6 procedur pro získání dostatečného počtu hematopoetických kmenových buněk, srovnatelných s repopulační kapacitou suspenze kostní dřeně. Při každém takovém postupu dělí separátor 10-12 litrů krve, což může způsobit trombocytopenii a leukopenii. Postup separace zahrnuje podávání antikoagulantu (citranu sodného) donorovi, což však nevylučuje kontaktování aktivace krevních destiček během extrakorporálního odstřeďování. Tyto faktory vytvářejí podmínky pro vznik infekčních a hemoragických komplikací. Další nevýhodou metody spočívá v výrazné variabilitě reakce mobilizace, která vyžaduje sledování obsahu HSC u dárců periferní krve, nutných k určení jejich maximální hladiny.

Autologní transplantace HSC, na rozdíl od alogenních, zcela vylučuje vývoj odmítnutí. Značná nevýhoda autologní transplantací hematopoetických kmenových buněk, což omezuje rozsah indikací pro její provedení, je vysoká pravděpodobnost, reinfúze buněk leukemických klon s transplantací. Kromě toho nedostatek imuno-zprostředkovaného účinku "štěpu proti nádoru" významně zvyšuje frekvenci rekurencí maligní krevní choroby. Proto je jediný způsob, jak radikální eliminace klonální hematopoetických neoplastických a obnovit normální polyklonální krvetvorbu v myelodysplastických syndromů je intenzivní chemoterapie s alogenní transplantací HSC.

Ale i v tomto případě je léčba většiny hemoblastóz zaměřena pouze na zvýšení doby přežití pacientů a zlepšení jejich kvality života. Podle několika velkých studií bylo dosaženo prodloužení přežití bez onemocnění po transplantaci HSC u 40% onkohematologických pacientů. Při použití kmenových buněk sourozenců kompatibilních s HbA jsou nejlepší výsledky pozorovány u mladých pacientů s krátkou anamnézou onemocnění, počtem blastových buněk až do 10% a příznivou cytogenetikou. Bohužel mortalita spojená s postupem pro transplantaci HSC u pacientů s myelodysplastickými onemocněními zůstává vysoká (ve většině hlášení - asi 40%). Výsledky 10 let pracovat US National program dárcovství kostní dřeně (510 pacientů, medián věku - 38 let) ukazují, že přežití bez nemoci je 29% v průběhu dvou let na relativně nízkou pravděpodobností recidivy (14%). Úmrtnost způsobená postupem alotransplantace GSK od dárce, který není ve spojení, je však extrémně vysoká a během dvouletého období dosahuje 54%. Podobné výsledky byly získány v evropské studii (118 pacientů, medián věku 24 let, přežití bez relapsu 2 roky, 28%, recidivy 35%, úmrtnost 58%).

Při provádění intenzivních cyklů chemoterapie s následnou obnovou hematopoézy alogenními hemopoetickými buňkami často vznikají imunohematologické a transfuzní komplikace. V mnoha ohledech souvisí se skutečností, že krevní skupiny u lidí jsou děděny nezávisle na molekulách MHC. Proto i když je donor a příjemce kompatibilní s hlavními antigeny HLA, jejich erytrocyty mohou mít odlišný fenotyp. Přidělit „velké“ nekompatibilita při preexist v přijímající protilátky proti antigenům dárce červených krvinek, a „malé“, když dárcovské protilátky proti antigenům červených krvinek příjemce. Existují případy kombinace "velké" a "malé" neslučitelnosti.

Výsledky srovnávací analýzy klinické účinnosti kostní dřeně a krvetvorných kmenových buněk z pupečníkové krve allo-štěpů u hematologických malignit ukazují, že děti alotransplantace GSK pupečníkové krve výrazně snižuje riziko reakce „štěp versus hostitel“, ale je delší doba zotavení neutrofilů a destiček vyšší frekvence 100-ti denní úmrtnost v po transplantaci.

Studium příčin časné letality umožnilo objasnit kontraindikace k alogenní transplantaci GSK, mezi které patří nejdůležitější:

• přítomnost pozitivních testů na infekci cytomegaloviru (bez preventivní léčby) u příjemce nebo dárce;
• akutní radiační onemocnění;
• přítomnost nebo dokonce podezření na přítomnost mykotické infekce u pacienta (bez systémové včasné profylaxe s fungicidními léky);
• hemoblastózy, u kterých pacienti dostávali dlouhodobou léčbu cytostatiky (kvůli vysoké pravděpodobnosti náhlé srdeční zástavy a selhání více orgánů);
• transplantace z HLA neidentických dárců (bez prevence akutní reakce "transplantace proti hostiteli" cyklosporinem A);
• chronická virovou hepatitidu C (kvůli vysokému riziku vzniku veno-okluzivního onemocnění jater).

Tak transplantaci HSC může způsobit vážné komplikace, které často vedou ke smrti. Na začátku (až do 100 dnů po transplantaci) doba mezi ně patří infekční komplikace, akutní reakce „štěp versus hostitel“, odmítnutí transplantátu (neprizhivlenie HSC dárce), venookklyuzionnaya onemocnění jater, jakož i vzhledem k toxicitě přípravného režimu, poškození tkáně, pro které je vysoká charakteristika rychlost přestavby (kůže, vaskulární endotel, střevní epitel). Komplikace pozdní po transplantaci období zahrnují chronické reakce „štěp versus hostitel“ obnovení základního onemocnění, zpomalení růstu u dětí, poruchy reprodukční funkce a onemocnění štítné žlázy očí.

Nedávno v souvislosti s výskytem publikací o plasticitě buněk kostní dřeně vznikla myšlenka užívání GSK pro léčbu srdečních infarktů a dalších onemocnění. Ačkoli některé experimenty na zvířatech také tuto možnost podporují, musí být potvrzeny závěry o plasticitě buněk kostní dřeně. Tuto skutečnost by měli vzít v úvahu ti výzkumníci, kteří věří, že transplantované buňky lidské kostní dřeně jsou snadno transformovány do buněk kosterních svalů, myokardu nebo CNS. Hypotéza, že GSK je přirozeným buněčným zdrojem regenerace těchto orgánů, vyžaduje vážné důkazy.

Zejména zveřejnila první výsledky otevřené randomizované studii Belenkova V. (2003), jehož cílem - studovat vliv C-SIS (tj mobilizace autologní krve HSC) v klinických, hemodynamických a neurohumorální stavu pacientů se středně těžkou až těžkou chronickou srdeční selhání, jakož i jeho posouzení bezpečnosti se standardní terapii (inhibitory ACE, beta-blokátory, diuretika, srdeční glykosidy). První publikace výsledků autorů výzkumného programu je upozornit, že jediným argumentem ve prospěch O-CBP jsou výsledky léčení jednoho pacienta, který se v průběhu léčby této drogy nalezené nezpochybnitelné zlepšení ve všech klinických a hemodynamických parametrů. Nicméně, nebylo potvrzeno teorie HSC uvolnění do krevního řečiště s následnou regeneraci myokardu v post-infarktové zóny - a to iu pacientů s pozitivními klinickými dynamiky zátěžové echokardiografie s dobutaminem neodhalilo vznik životaschopného myokardu v jizvě oblastech oboru.

Je třeba poznamenat, že v současné době nejsou údaje, které dovolují doporučit substituční buněčnou terapii pro široké zavedení do každodenní klinické praxe, zjevně nestačí. Dobře řemeslně a kvalitativní výkon klinických studií pro stanovení účinnosti různých možností léčby regeneračních buněk, rozvoj indikace a kontraindikace k ní, jakož i pokyny pro kombinované použití regenerativní a plastové terapie a konvenční chirurgické nebo konzervativní léčbě. Doposud žádná odpověď na otázku, jaké populace buněk kostní dřeně (hematopoetických kmenových nebo stromální), může vést k neuronů a kardiomyocytů, a není jasné, co podmínky přispívají k tomu in vivo.

Práce v těchto oblastech se provádí v mnoha zemích. V souhrnu sympozia o akutní selhání jater americké National Institutes of Health mezi slibných způsobů léčby, spolu s transplantací jater, transplantace označený xenonové nebo alogenní hepatocyty a in vitro bioreaktorech spojení s jaterních buněk. Existuje přímý důkaz, že pouze cizí, funkčně aktivní hepatocyty mohou poskytnout účinnou podporu jater příjemce. Pro klinické použití izolovaných hepatocytů je nutné vytvořit buněčnou banku, která významně omezí čas mezi uvolněním buněk a jejich použitím. Nejpřijatelnější pro vytvoření banky izolovaných hepatocytů je kryoprezervace jaterních buněk v kapalném dusíku. Při použití takových buněk v klinice u pacientů s akutní a chronickou jaterní nedostatečností byl zjištěn poměrně vysoký terapeutický účinek.

Přes optimistické a povzbudivé výsledky transplantace jaterních buněk v experimentu a klinice, stále existuje mnoho problémů ještě zdaleka není vyřešen. Patří mezi ně omezené množství vhodných orgánů k získání izolovaných hepatocytů nedostatečně účinné metody separace, nedostatek standardizovaných metod zachování jaterních buněk nejasný pochopení mechanismů regulace růstu a proliferaci transplantovaných buněk je nedostatek vhodných metod hodnocení přihojení nebo zamítnutí alogenní hepatocytů. To také by měla zahrnovat přítomnost transplantace imunity použitím allogenních nebo xenogenních buněk, i když méně než v ortotopické transplantaci jater, ale vyžadující použití imunosupresiv zapouzdřením izolované hepatocyty nebo zvláštní zpracování enzymy. Transplantace hepatocytů často vede k imunitní konflikty mezi příjemcem a dárce v rejekční reakce, která vyžaduje použití cytostatika. Jedním z řešení tohoto problému je použití polymerních mikroporézní média izolovat jaterní buňky, které zlepší jejich přežití, protože kapsle membrána účinně chrání hepatocyty, přes imunizaci.

Nicméně, v akutním selhání jater tak transplantace hepatocytů nemá žádný vliv, protože poměrně dlouhou dobu potřebnou pro přihojení jaterních buněk v novém prostředí s přístupem do kroku optimální fungování. Potenciální omezení je vylučování žluči ektopické transplantace izolovaných hepatocytů, a při použití bioreaktorů důležité fyziologické bariéry působí druh rozdíl mezi lidskými proteiny a proteiny, které produkují xenogenních hepatocytů.

V literatuře existují zprávy, že místní transplantace kostní dřeně stromální kmenových buněk usnadňuje efektivní korekce kostních defektů, a kostní obnovu v tomto případě je intenzivnější než v spontánní reparativní regenerace. V několika preklinických studiích na zvířecích modelech přesvědčivě prokázaly možnost využití transplantátů stromální buňky kostní dřeně v ortopedii, i když pro optimalizaci těchto metod, a to i v nejjednodušších případech, je třeba další práce. Konkrétně nebyly dosud nalezeny optimální podmínky pro expanzi osteogenních stromálních buněk ex vivo, struktura a složení jejich ideálního nosiče (matrice) zůstávají nezpracované. Minimální počet buněk potřebných pro regeneraci objemových kostí není stanoven.

Je prokázáno, že mesenchymální kmenové buňky vykazují transgermalnuyu plasticitu - schopnost diferenciace do buněčných typů, které fenotypově nesouvisí s původní buněčné linie. Za optimálních podmínek polyklonální kmenových buněk linie kultury buněk stromatu kostní dřeně udržovány in vitro po dobu více než 50 rozdělení, takže je možné získat miliardy buněk stromatu z 1 ml aspirátu kostní dřeně. Nicméně, populace mezenchymálních kmenových buněk, vyznačující se tím, heterogenitou, která se projevuje jako variabilita ve velikosti kolonií, různé rychlosti tvorby a morfologické rozmanitosti typů buněk - z fibroblastů jako vřeteno tvaru až po velké ploché buňky. Během 3 týdnů po kultivaci stromálních kmenových buněk pozorovaných fenotypové heterogenitu: jedna kolonie tvořících vtroušeniny kostní tkáně, zatímco jiné - shluky adipocytů, a další, vzácné, tvořící ostrovy chrupavky.

Pro léčení degenerativních onemocnění centrálního nervového systému byla poprvé použita transplantace embryonálního nervového tkáně. V posledních letech, namísto fetální mozkové tkáně transplantátu ocelových buněčných elementů neurosféry odvozených od nervových kmenových buněk (.Poltavtseva, 2001). Neurosféry obsahují odhodlané nervové prekurzory a neurogliu - což dává naději na obnovu ztracených funkcí mozku po jejich transplantaci. Po transplantaci buněk k neurosféry disperguje krysí striatální mozku těleso označené jejich proliferaci a diferenciaci do dopaminergických neuronů, která eliminuje motorové asymetrie u krys s experimentálním gemiparkinsonizmom. V některých případech se však nádorové buňky vyvinuly z buněk neurosféry, což vedlo ke smrti zvířat (Bjorklund, 2002).

Na klinice pečlivé studie dvou skupin pacientů, u kterých ani pacienti, ani lékaři znal (double-blind) pozorovali, že jedna skupina pacientů transplantovány embryonální tkáně s neurony, které produkují dopamin, druhá skupina pacientů podal nepravdivé krok, poskytly neočekávané výsledky . Pacienti, kteří byli transplantováni embryonálními nervovými tkáněmi, se necítili lépe než pacienti kontrolní skupiny. Kromě toho 5 z 33 pacientů po 2 roky po transplantaci embryonální nervové tkáně vyvinula přetrvávající dyskineze, která neměla skupina kontrolních pacientů (Kmenové buňky: vědecký pokrok a budoucí výzkumné směry Nat Inst, zdravotnictví USA ...). Jeden z nevyřešených problémů klinických studií mozkových neurálních kmenových buněk, je analýza reálných perspektiv a omezení jejich transplantaci deriváty pro korekci poruch CNS. Je možné, že prodloužení záchvatu indukované neyronogenez v hipokampu, což vede k jeho strukturní a funkční změny, může být faktorem v postupného rozvoje epilepsie. Tento závěr je obzvláště pozoruhodné, protože to ukazuje na možné negativní účinky na vytváření nových neuronů v dospělém mozku, a tvorbě aberantních synaptických spojení.

Měli bychom zapomínat, že do kultivačního média s cytokiny (mitogeny) přibližuje vlastnosti kmenových buněk, které nádorových buněk, v jakém se vyskytují v blízkosti změny v regulaci buněčného cyklu, stanovení schopnosti neomezeně dělení. Je hloupé transplantovat lidem časné deriváty embryonálních kmenových buněk, protože v tomto případě je hrozba vývoje maligních novotvarů velmi velká. Je mnohem bezpečnější používat jejich více oddaných potomků, tj. Progenitorové buňky diferencovaných linií. V současné době však zatím nebyla vypracována spolehlivá technika pro získání stabilních lidských buněčných linií, které se liší správným směrem.

Použití technologií molekulární biologie pro korekci dědičné patologie a lidských onemocnění pomocí modifikace kmenových buněk je pro praktickou medicínu velkým zájmem. Vlastnosti genomu kmenových buněk umožňují vývoj jedinečných transplantačních programů s cílem napravit genetické nemoci. Ale v tomto směru existuje také řada omezení, která je třeba překonat dříve, než začne praktická aplikace genetického inženýrství kmenových buněk. Především je nutné optimalizovat proces modifikace genomu kmenových buněk ex vivo. Je známo, že prodloužení (3-4 týdnů) proliferace kmenových buněk snižuje jejich transfekci, takže je zapotřebí několika cyklů transfekce k dosažení vysoké úrovně jejich genetické modifikace. Hlavním problémem je však doba trvání exprese terapeutického genu. Až dosud v žádné studii nebyla doba účinného vyjádření po transplantaci modifikovaných buněk delší než čtyři měsíce. Ve 100% případů se v průběhu času sníží exprese transfekovaných genů v důsledku inaktivace promotorů a / nebo smrti buněk modifikovaným genomem.

Důležitým problémem jsou náklady na používání buněčných technologií v medicíně. Například odhadovaný roční požadavek na financování pouze lékařských výdajů oddělení transplantace kostní dřeně, který je určen k provádění 50 transplantací ročně, činí asi 900 000 dolarů.

Vývoj buněčných technologií v klinické medicíně je komplexní a vícestupňový proces zahrnující konstruktivní spolupráci multidisciplinárních vědeckých a klinických center a mezinárodního společenství. Současně je věnována zvláštní pozornost vědecké organizaci výzkumu v oblasti buněčné terapie. Nejdůležitější z nich je vývoj protokolů pro klinické studie, sledování platnosti klinických údajů, vytvoření národního registru výzkumu, integrace do mezinárodních programů multicentrických klinických studií a zavedení výsledků do klinické praxe.

Uzavření úvod do problematiky transplantací buňka, bych chtěl vyjádřit naději, že společné úsilí předních odborníků na Ukrajině z různých vědních oborů zajistí významný pokrok v experimentálních a klinických studií a umožní v příštích letech najít účinné způsoby, jak pomoci vážně nemocným lidem, kteří potřebují transplantaci orgánů , tkáně a buňky.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]