Krvetvorné kmenové buňky

Hematopoetické kmenové buňky (HSC), stejně jako mezenchymální progenitorové buňky, se vyznačují multipotencí a dávají vznik buněčným liniím, jejichž konečné elementy tvoří krevní elementy, a také řadě specializovaných tkáňových buněk imunitního systému.

Hypotéza o existenci společného prekurzoru všech krevních buněk, stejně jako samotný termín „kmenová buňka“, patří A. Maksimovovi (1909). Potenciál pro tvorbu buněčné hmoty v HSC je obrovský – kmenové buňky kostní dřeně denně produkují 10 buněk, které tvoří formované elementy periferní krve. Samotná skutečnost existence hematopoetických kmenových buněk byla stanovena v roce 1961 v experimentech s obnovou hematopoézy u myší, které dostaly smrtelnou dávku radioaktivního ozáření, které ničí kmenové buňky kostní dřeně. Po transplantaci syngenních buněk kostní dřeně takovým letálně ozářeným zvířatům byla ve slezině příjemců nalezena samostatná ložiska hematopoézy, jejichž zdrojem byly jednotlivé klonogenní prekurzorové buňky.

Poté byla prokázána schopnost hematopoetických kmenových buněk k sebeudržování a zajištění funkce hematopoézy v procesu ontogeneze. V procesu embryonálního vývoje se HSC vyznačují vysokou migrační aktivitou, která je nezbytná pro jejich přesun do zón tvorby hematopoetických orgánů. Tato vlastnost HSC je zachována i v ontogenezi - díky jejich neustálé migraci dochází k neustálé obnově zásoby imunokompetentních buněk. Schopnost HSC migrovat, pronikat histohematickými bariérami, implantovat se do tkání a klonogenně růst sloužila jako základ pro transplantaci buněk kostní dřeně u řady onemocnění spojených s patologií hematopoetického systému.

Stejně jako všechny zdroje kmenových buněk jsou i hematopoetické kmenové buňky přítomny ve svém niku (kostní dřeni) ve velmi malém množství, což způsobuje určité obtíže při jejich izolaci. Imunofenotypicky jsou lidské HSC charakterizovány jako CD34+NK buňky schopné migrovat do krevního oběhu a osídlit orgány imunitního systému nebo repopulovat stroma kostní dřeně. Je třeba si uvědomit, že HSC nejsou nejzralejšími buňkami kostní dřeně, ale pocházejí z prekurzorů, mezi které patří dormantní CD34-negativní buňky podobné fibroblastům. Bylo zjištěno, že buňky s fenotypem CD34 jsou schopny vstoupit do krevního oběhu, kde mění svůj fenotyp na CD34+, ale při zpětné migraci do kostní dřeně se pod vlivem mikroprostředí opět stávají CD34-negativními elementy kmenových buněk. V klidovém stavu CD34~ buňky nereagují na parakrinní regulační signály stromatu (růstové faktory, cytokiny). V situacích vyžadujících zvýšenou intenzitu hematopoézy však kmenové buňky s fenotypem CD34 reagují na diferenciační signály tvorbou hematopoetických i mezenchymálních progenitorových buněk. Hematopoéza probíhá přímým kontaktem HSC s buněčnými prvky stromatu kostní dřeně, které představuje komplexní síť makrofágů, retikulárních endoteliálních buněk, osteoblastů, stromálních fibroblastů a extracelulární matrix. Stromální základ kostní dřeně není jen matricí nebo „kostrou“ pro hematopoetickou tkáň; provádí jemnou regulaci hematopoézy díky parakrinním regulačním signálům růstových faktorů, cytokinů a chemokinů a také zajišťuje adhezivní interakce nezbytné pro tvorbu krevních buněk.

Neustále se obnovující systém hematopoézy je tedy založen na polypotentní (z hlediska hematopoézy) hematopoetické kmenové buňce schopné dlouhodobé sebeudržby. V procesu komitace (commitace) HSC procházejí primární diferenciací a tvoří klony buněk, které se liší cytomorfologickými a imunofenotypickými vlastnostmi. Postupná tvorba primitivních a kommitovaných progenitorových buněk končí tvorbou morfologicky identifikovatelných progenitorových buněk různých hematopoetických linií. Výsledkem následných fází komplexního vícestupňového procesu hematopoézy je zrání buněk a uvolňování zralých formovaných elementů do periferní krve - erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a trombocytů.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Zdroje hematopoetických kmenových buněk

Hematopoetické kmenové buňky jsou považovány za nejvíce studovaný zdroj kmenových buněk, což je z velké části dáno jejich klinickým využitím při transplantaci kostní dřeně. Na první pohled je o těchto buňkách známo poměrně dost. Do jisté míry je to pravda, jelikož intermediární a zralí potomci HSC jsou nejdostupnějšími buněčnými elementy, z nichž každý (erytrocyty, leukocyty, lymfocyty, monocyty/makrofágy a krevní destičky) byl pečlivě studován na všech úrovních - od světelné po elektronovou mikroskopii, od biochemických a imunofenotypických charakteristik až po identifikaci pomocí PCR analytických metod. Sledování morfologických, ultrastrukturálních, biochemických, imunofenotypických, biofyzikálních a genomických parametrů HSC však neposkytlo odpovědi na mnoho problematických otázek, jejichž řešení je nezbytné pro rozvoj buněčné transplantologie. Mechanismy stabilizace hematopoetických kmenových buněk v dormantním stavu, jejich aktivace, vstup do fáze symetrického nebo asymetrického dělení a především angažovanost v tvorbě tak funkčně odlišných krevních elementů, jako jsou erytrocyty, leukocyty, lymfocyty a krevní destičky, dosud nebyly stanoveny.

Přítomnost buněk s fenotypem CD34 v kostní dřeni, které jsou progenitory mezenchymálních i hematopoetických kmenových buněk, vyvolala otázku existence nejranějších prekurzorů buněčné diferenciace do stromálních a hematopoetických linií, blízkých CD34-negativním buňkám. Metodou dlouhodobé kultivace byly získány tzv. dlouhodobé kultivační iniciační buňky (LTC-IC). Životnost těchto prekurzorových buněk s aktivitou tvorby kolonií na stromálním základě kostní dřeně s určitou kombinací růstových faktorů přesahuje 5 týdnů, zatímco životaschopnost vázaných jednotek tvořících kolonie (CFU) v kultuře je pouze 3 týdny. V současné době je LTC-IC považována za funkční analog HSC, protože s vysokým repopulačním potenciálem je asi 20 % LTC-IC charakterizováno fenotypem CD34+CD38- a vykazuje vysokou schopnost sebeobnovy. Takové buňky se v lidské kostní dřeni nacházejí s frekvencí 1:50 000. Nicméně, buňky iniciující myeloidní lymfoidní růst, které jsou získávány za dlouhodobých (15 týdnů) kultivačních podmínek, by měly být považovány za nejblíže HSC. Takové buňky, označované jako LTC, patří mezi buňky kostní dřeně lidského mozku, vyskytují se 10krát méně často než LTC-IC a tvoří buněčné linie myeloidní i lymfoidní hematopoetické linie.

Ačkoli je značení hematopoetických kmenových buněk monoklonálními protilátkami s následnou imunofenotypovou identifikací hlavní metodou pro rozpoznávání a selektivní třídění hematopoetických buněk s kmenovým potenciálem, klinické využití takto izolovaných HSC je omezené. Blokování receptoru CD34 nebo jiných markerových antigenů protilátkami během imunopozitivního třídění nevyhnutelně mění vlastnosti buňky izolované s jeho pomocí. Imunonegativní izolace HSC na magnetických kolonách je považována za vhodnější. V tomto případě se však pro třídění obvykle používají monoklonální protilátky fixované na kovovém nosiči. Navíc, což je důležité, obě metody izolace HSC jsou založeny spíše na fenotypových než funkčních charakteristikách. Proto mnoho výzkumníků dává přednost analýze klonogenních parametrů HSC, která umožňuje určit stupeň zralosti a směr diferenciace progenitorových buněk podle velikosti a složení kolonií. Je známo, že během procesu komitace se počet buněk a jejich typy v kolonii snižují. Hematopoetická kmenová buňka a její raná dceřiná buňka, nazývaná „jednotka tvořící kolonie granulocytů-erytrocytů-monocytů-megakaryocytů“ (CFU-GEMM), vytvářejí v kultuře velké víceliniové kolonie obsahující granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocyty. Jednotka tvořící kolonie granulocytů-monocytů (CFU-GM), která se nachází podél linie závazku, tvoří kolonie granulocytů a makrofágů a jednotka tvořící kolonie granulocytů (CFU-G) tvoří pouze malou kolonii zralých granulocytů. Raný prekurzor erytrocytů, jednotka erytrocytů tvořící burst (CFU-E), je zdrojem velkých kolonií erytrocytů a zralejší jednotka erytrocytů tvořící kolonie (CFU-E) je zdrojem malých kolonií erytrocytů. Obecně platí, že když buňky rostou na polotuhém médiu, lze identifikovat buňky, které tvoří šest typů myeloidních kolonií: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E a CFU-E.

Nicméně, kromě hematopoetických derivátů, jakýkoli výchozí materiál pro izolaci HSC obsahuje značné množství doprovodných buněk. V tomto ohledu je nezbytná předběžná purifikace transplantátu, a to především od aktivních buněk imunitního systému dárce. Obvykle se k tomuto účelu používá imunoselekce, založená na expresi specifických antigenů lymfocyty, což umožňuje jejich izolaci a odstranění pomocí monoklonálních protilátek. Kromě toho byla vyvinuta imunorozetová metoda deplece T-lymfocytů z transplantované kostní dřeně, která je založena na tvorbě komplexů CD4+ lymfocytů a specifických monoklonálních protilátek, účinně odstraněných pomocí aferézy. Tato metoda zajišťuje produkci purifikovaného buněčného materiálu s 40-60% obsahem hematopoetických kmenových buněk.

Zvýšení počtu progenitorových buněk v důsledku odstranění zralých krevních elementů z produktu leukaferézy se dosahuje protiproudou centrifugací s následnou filtrací (za přítomnosti chelátoru - trisodné soli citrátu) přes kolony obsahující nylonová vlákna potažená lidským imunoglobulinem. Postupné použití těchto dvou metod zajišťuje úplnou purifikaci transplantátu od krevních destiček, 89 % od erytrocytů a 91 % od leukocytů. Díky významnému snížení ztráty HSC lze hladinu CD34+ buněk v celkové buněčné hmotě zvýšit až na 50 %.

Schopnost izolovaných hematopoetických kmenových buněk tvořit kolonie zralých krvinek v kultuře se využívá k funkční charakterizaci buněk. Analýza vytvořených kolonií umožňuje identifikovat a kvantifikovat typy progenitorových buněk, stupeň jejich vázání a stanovit směr jejich diferenciace. Klonogenní aktivita se stanovuje v polotuhých médiích na methylcelulóze, agaru, plazmě nebo fibrinovém gelu, které snižují migrační aktivitu buněk a brání jejich přichycení k povrchu skla nebo plastu. Za optimálních kultivačních podmínek se klony vyvíjejí z jedné buňky za 7–18 dní. Pokud klon obsahuje méně než 50 buněk, identifikuje se jako jeden shluk; pokud počet buněk přesahuje 50, identifikuje se jako kolonie. Zohledňuje se počet buněk schopných tvořit kolonii (jednotky tvořící kolonie - CFU nebo buňky tvořící kolonie - COC). Je třeba poznamenat, že parametry CFU a COC neodpovídají počtu HSC v buněčné suspenzi, ačkoli s ním korelují, což opět zdůrazňuje potřebu stanovit funkční (kolonie tvořící) aktivitu HSC in vitro.

Mezi buňkami kostní dřeně mají hematopoetické kmenové buňky nejvyšší proliferační potenciál, díky čemuž tvoří v kultuře největší kolonie. Počet těchto kolonií se navrhuje pro nepřímé určení počtu kmenových buněk. Po vzniku kolonií in vitro o průměru přesahujícím 0,5 mm a s počtem buněk více než 1000 autoři testovali tyto buňky na rezistenci vůči subletálním dávkám 5-fluorouracilu a studovali jejich schopnost repopulovat kostní dřeň letálně ozářených zvířat. Podle stanovených parametrů byly izolované buňky téměř nerozeznatelné od HSC a dostaly zkratku HPP-CFC - buňky tvořící kolonie s vysokým proliferačním potenciálem.

Hledání kvalitnější izolace hematopoetických kmenových buněk pokračuje. Hematopoetické kmenové buňky jsou však morfologicky podobné lymfocytům a představují relativně homogenní soubor buněk s téměř kulatými jádry, jemně dispergovaným chromatinem a malým množstvím slabě bazofilní cytoplazmy. Jejich přesný počet je také obtížné určit. Předpokládá se, že HSC se v lidské kostní dřeni vyskytují s frekvencí 1 na 106 jaderných buněk.

Identifikace hematopoetických kmenových buněk

Pro zlepšení kvality identifikace hematopoetických kmenových buněk se provádí sekvenční nebo simultánní (na vícekanálovém sorteru) studie spektra membránově vázaných antigenů, přičemž u HSC by měl být fenotyp CD34+CD38 kombinován s absencí markerů lineární diferenciace, zejména antigenů imunokompetentních buněk, jako je CD4, povrchové imunoglobuliny a glykoforin.

Téměř všechna schémata fenotypizace hematopoetických kmenových buněk zahrnují stanovení antigenu CD34. Tento glykoprotein s molekulovou hmotností přibližně 110 kDa, nesoucí několik glykosylačních míst, je exprimován na membráně plazmatických buněk po aktivaci odpovídajícího genu lokalizovaného na chromozomu 1. Funkce molekuly CD34 je spojena s interakcí časných hematopoetických progenitorových buněk se stromální bází kostní dřeně zprostředkovanou L-selektinem. Je však třeba mít na paměti, že přítomnost antigenu CD34 na povrchu buněk umožňuje pouze předběžné posouzení obsahu HSC v buněčné suspenzi, protože je exprimován i jinými hematopoetickými progenitorovými buňkami, stejně jako stromálními buňkami kostní dřeně a endotelovými buňkami.

Během diferenciace hematopoetických progenitorových buněk je exprese CD34 trvale snížena. Erytrocytární, granulocytární a monocytární kommitované progenitorové buňky buď slabě exprimují antigen CD34, nebo jej na svém povrchu vůbec neexprimují (fenotyp CD34). Antigen CD34 není detekován na povrchové membráně diferencovaných buněk kostní dřeně a zralých krvinek.

Je třeba poznamenat, že v dynamice diferenciace hematopoetických progenitorových buněk se nejen snižuje hladina exprese CD34, ale také progresivně roste exprese antigenu CD38, integrálního membránového glykoproteinu s molekulovou hmotností 46 kDa, který má aktivitu NAD-glykohydrolázy a ADP-ribosylcyklázy, což naznačuje jeho účast na transportu a syntéze ADP-ribózy. Objevuje se tak možnost dvojí kontroly stupně angažmá hematopoetických progenitorových buněk. Populace buněk s fenotypem CD34+CD38+, která tvoří 90 až 99 % CD34-pozitivních buněk kostní dřeně, obsahuje progenitorové buňky s omezeným proliferačním a diferenciačním potenciálem, zatímco buňky s fenotypem CD34+CD38 si mohou nárokovat roli HSC.

Populace buněk kostní dřeně popsaná vzorcem CD34+CD38- skutečně obsahuje relativně velké množství primitivních kmenových buněk schopných diferenciace v myeloidním a lymfoidním směru. Za podmínek dlouhodobé kultivace buněk s fenotypem CD34+CD38- je možné získat všechny zralé krevní elementy: neutrofily, eosinofily, bazofily, monocyty, megakaryocyty, erytrocyty a lymfocyty.

Relativně nedávno bylo zjištěno, že CD34-pozitivní buňky exprimují další dva markery, AC133 a CD90 (Thy-1), které se také používají k identifikaci hematopoetických kmenových buněk. Antigen Thy-1 je koexprimován s receptorem CD117 (c-kit) na CD34+ buňkách kostní dřeně, pupeční šňůry a periferní krve. Jedná se o povrchový glykoprotein vázající fosfatidylinositol s molekulovou hmotností 25-35 kDa, který se podílí na procesech buněčné adheze. Někteří autoři se domnívají, že antigen Thy-1 je markerem nejvíce nezralých CD34-pozitivních buněk. Samoreprodukující se buňky s fenotypem CD34+Thy-1+ dávají vzniknout dlouhodobě kultivovaným liniím s tvorbou dceřiných buněk. Předpokládá se, že antigen Thy-1 blokuje regulační signály, které způsobují zástavu buněčného dělení. Přestože jsou buňky CD34+Thy1+ schopné sebereprodukce a tvorby dlouhodobě kultivovaných linií, nelze jejich fenotyp připsat výhradně HSC, jelikož obsah Thy-1+ v celkové hmotnosti CD34-pozitivních buněčných elementů je asi 50 %, což významně převyšuje počet hematopoetických buněk.

Za slibnější pro identifikaci hematopoetických kmenových buněk by měl být považován AC133 - antigenní marker hematopoetických progenitorových buněk, jehož exprese byla poprvé detekována na embryonálních jaterních buňkách. AC133 je transmembránový glykoprotein, který se objevuje na povrchu buněčné membrány v nejranějších fázích zrání HSC - je možné, že dokonce dříve než antigen CD34. Ve studiích A. Petrenka a V. Grishčenka (2003) bylo zjištěno, že AC133 je exprimován až 30 % CD34-pozitivních embryonálních jaterních buněk.

Ideální fenotypový profil hematopoetických kmenových buněk tedy podle současných představ sestává z buněčného obrysu, jehož kontury by měly zahrnovat konfigurace antigenů CD34, AC133 a Thy-1, ale nezbývá zde místo pro molekulární projekce CD38, HLA-DR a lineárních diferenciačních markerů GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Variací fenotypového portrétu HSC může být kombinace CD34+CD45RalowCD71low, jelikož vlastnosti buněk popsané tímto vzorcem se neliší od funkčních parametrů buněk s fenotypem CD34+CD38. Lidské HSC lze navíc identifikovat podle fenotypových znaků CD34+Thy-1+CD38Iow/'c-kit/low - pouze 30 takových buněk kompletně obnoví hematopoézu u letálně ozářených myší.

Čtyřicetileté období intenzivního výzkumu HSC, které jsou schopné jak sebereprodukce, tak diferenciace do jiných buněčných elementů, začalo analýzou obecných fenotypových charakteristik buněk kostní dřeně, což umožnilo odůvodnit použití transplantace kostní dřeně k léčbě různých patologií hematopoetického systému. Nové typy kmenových buněk objevené později dosud nebyly v klinické praxi široce používány. Zároveň jsou kmenové buňky pupečníkové krve a embryonálních jater schopny významně rozšířit rozsah buněčné transplantace nejen v hematologii, ale i v dalších oblastech medicíny, protože se od HSC kostní dřeně liší jak kvantitativními, tak kvalitativními znaky.

Objem hmoty hematopoetických kmenových buněk potřebný pro transplantaci se obvykle získává z kostní dřeně, periferní a pupečníkové krve a embryonálních jater. Kromě toho lze hematopoetické progenitorové buňky získat in vitro množením embryonálních kmenových buněk (ESC) s jejich následnou řízenou diferenciací na hematopoetické buněčné elementy. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) správně upozorňují na významné rozdíly v imunologických vlastnostech a schopnosti obnovit hematopoézu HSC různého původu, což je dáno nerovnoměrným poměrem časných pluripotentních a pozdně commitovaných progenitorových buněk obsažených v jejich zdrojích. Hematopoetické kmenové buňky získané z různých kmenových zdrojů se navíc vyznačují kvantitativně i kvalitativně zcela odlišnými asociacemi nehematopoetických buněk.

Kostní dřeň se již stala tradičním zdrojem hematopoetických kmenových buněk. Suspenze buněk kostní dřeně se získává z kosti kyčelní nebo hrudní kosti promytím v lokální anestezii. Takto získaná suspenze je heterogenní a obsahuje směs HSC, stromálních buněčných elementů, progenitorových buněk myeloidní a lymfoidní linie a také zralých formovaných elementů krve. Počet buněk s fenotypem CD34+ a CD34+CD38 mezi mononukleárními buňkami kostní dřeně je 0,5–3,6 %, respektive 0–0,5 %. Periferní krev po mobilizaci HSC indukované G-CSF obsahuje 0,4–1,6 % CD34+ a 0–0,4 % CD34+CD38.

Procento buněk s imunofenotypy CD34+CD38 a CD34+ je vyšší v pupečníkové krvi - 0-0,6 a 1-2,6 % a jejich maximální počet je detekován mezi hematopoetickými buňkami embryonálních jater - 0,2-12,5 a 2,3-35,8 %.

Kvalita transplantovaného materiálu však nezávisí pouze na počtu CD34+ buněk, které obsahuje, ale také na jejich funkční aktivitě, kterou lze posoudit úrovní tvorby kolonií in vivo (repopulace kostní dřeně u letálně ozářených zvířat) a in vitro - růstem kolonií na polotekutých médiích. Ukázalo se, že aktivita tvorby kolonií a proliferace hematopoetických progenitorových buněk s fenotypem CD34+CD38 HLA-DR izolovaných z embryonálních jater, fetální kostní dřeně a pupečníkové krve významně převyšuje proliferační a kolonie tvořící potenciál hematopoetických buněk kostní dřeně a periferní krve dospělého jedince. Kvantitativní a kvalitativní analýza HSC různého původu odhalila významné rozdíly jak v jejich relativním obsahu v buněčné suspenzi, tak ve funkčních schopnostech. Maximální počet CD34+ buněk (24,6 %) byl zjištěn v transplantovaném materiálu získaném z fetální kostní dřeně. Kostní dřeň dospělého jedince obsahuje 2,1 % CD34-pozitivních buněčných elementů. Mezi mononukleárními buňkami periferní krve dospělého jedince má pouze 0,5 % fenotyp CD34+, zatímco v pupečníkové krvi jejich počet dosahuje 2 %. Zároveň je schopnost tvořit kolonie buněk CD34+ fetální kostní dřeně 2,7krát vyšší než klonální růstová kapacita hematopoetických buněk kostní dřeně dospělého jedince a buňky pupečníkové krve tvoří výrazně více kolonií než hematopoetické elementy izolované z periferní krve dospělých: 65,5 a 40,8 kolonií/105 buněk.

Rozdíly v proliferační aktivitě a schopnosti tvořit kolonie hematopoetických kmenových buněk jsou spojeny nejen s různým stupněm jejich zralosti, ale také s jejich přirozeným mikroprostředím. Je známo, že intenzita proliferace a rychlost diferenciace kmenových buněk jsou určeny integrálním regulačním účinkem vícesložkového systému růstových faktorů a cytokinů, které jsou produkovány jak samotnými kmenovými buňkami, tak buněčnými prvky jejich matrix-stromálního mikroprostředí. Použití purifikovaných buněčných populací a bezsérových médií pro kultivaci buněk umožnilo charakterizovat růstové faktory, které mají stimulační a inhibiční účinek na kmenové buňky různých úrovní, progenitorové buňky a buňky vázané v jednom či druhém lineárním směru. Výsledky studií přesvědčivě ukazují, že HSC získané ze zdrojů s různou úrovní ontogenetického vývoje se liší jak fenotypově, tak funkčně. HSC v dřívějších fázích ontogeneze se vyznačují vysokým autoreprodukčním potenciálem a vysokou proliferační aktivitou. Takové buňky se vyznačují delšími telomerami a podléhají vázání za vzniku všech hematopoetických buněčných linií. Reakce imunitního systému na HSC embryonálního původu je zpožděná, protože tyto buňky slabě exprimují molekuly HLA. Existuje jasná gradace relativního obsahu HSC, jejich schopnosti sebeobnovy a počtu typů linií závazků, které tvoří: CD34+ buňky embryonálních jater > CD34+ buňky pupečníkové krve > CD34+ buňky kostní dřeně. Je důležité, že tyto rozdíly jsou vlastní nejen intra-, neo- a časnému postnatálnímu období lidského vývoje, ale také celé ontogenezi - proliferační a kolonie tvořící aktivita HSC získaných z kostní dřeně nebo periferní krve dospělého je nepřímo úměrná věku dárce.