Krvetvorné kmenové buňky žloutkového váčku

Je zřejmé, že různé proliferační a diferenciační potenciály hematopoetických kmenových buněk jsou určeny zvláštnostmi jejich ontogenetického vývoje, protože i lokalizace hlavních oblastí hematopoézy se u lidí během ontogeneze mění. Hematopoetické progenitorové buňky fetálního žloutkového vaku jsou vázány na tvorbu výhradně erytropoetické buněčné linie. Po migraci primárních HSC do jater a sleziny se spektrum závazkových linií v mikroprostředí těchto orgánů rozšiřuje. Zejména hematopoetické kmenové buňky získávají schopnost generovat buňky lymfoidní linie. V prenatálním období se hematopoetické progenitorové buňky dostanou do zóny konečné lokalizace a osídlí kostní dřeň. Během nitroděložního vývoje obsahuje fetální krev významné množství hematopoetických kmenových buněk. Například ve 13. týdnu těhotenství dosahuje hladina HSC 18 % z celkového počtu mononukleárních krvinek. Následně je pozorován progresivní pokles jejich obsahu, ale i před narozením se množství HSC v pupečníkové krvi jen málo liší od jejich množství v kostní dřeni.

Podle klasických konceptů se přirozená změna lokalizace hematopoézy během embryonálního vývoje savců provádí migrací a zavedením pluripotentních hematopoetických kmenových buněk do nového mikroprostředí - ze žloutkového vaku do jater, sleziny a kostní dřeně. Vzhledem k tomu, že v raných fázích embryonálního vývoje obsahuje hematopoetická tkáň velké množství kmenových buněk, které s dozráváním plodu klesá, je za nejslibnější pro získání hematopoetických kmenových buněk považována hematopoetická tkáň embryonálních jater, izolovaná z potrateného materiálu v 5.-8. týdnu těhotenství.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Otázky ohledně původu hematopoetických kmenových buněk

Není pochyb o tom, že embryonální tvorba erytrocytů vzniká v krevních ostrůvcích žloutkového vaku. Diferenciační potenciál hematopoetických buněk žloutkového vaku in vitro je však velmi omezený (diferencují se převážně na erytrocyty). Je třeba poznamenat, že transplantace hematopoetických kmenových buněk žloutkového vaku není schopna dlouhodobě obnovit hematopoézu. Ukázalo se, že tyto buňky nejsou prekurzory dospělých HSC. Pravé HSC se objevují dříve, ve 3.–5. týdnu nitroděložního vývoje, v zóně tvorby žaludeční tkáně a endotelu cév (paraaortální splanchnopleura, P-SP), stejně jako v místě aorty, pohlavních žláz a primárních ledvin – v mezonefros neboli tzv. AGM oblasti. Bylo prokázáno, že buňky AGM oblasti jsou zdrojem nejen HSC, ale také endotelových buněk cév a osteoklastů zapojených do procesů tvorby kostní tkáně. V 6. týdnu těhotenství se rané hematopoetické progenitorové buňky z oblasti AGM přesouvají do jater, která zůstávají hlavním hematopoetickým orgánem plodu až do narození.

Vzhledem k tomu, že tento bod je z hlediska buněčné transplantace mimořádně důležitý, zaslouží si problém původu HSC v procesu lidské embryogeneze podrobnější prezentaci. Klasické představy o tom, že hematopoetické kmenové buňky savců a ptáků pocházejí z extraembryonálního zdroje, jsou založeny na studiích Metcalfa a Moora, kteří jako první použili metody klonování HSC a jejich potomků izolovaných ze žloutkového vaku. Výsledky jejich práce sloužily jako základ pro migrační teorii, podle které HSC, které se nejprve objevily v žloutkovém vaku, postupně osidlují přechodné a definitivní hematopoetické orgány, jakmile se v nich vytvoří odpovídající mikroprostředí. Takto byl stanoven názor, že tvorba HSC, původně lokalizovaných v žloutkovém vaku, slouží jako buněčný základ pro definitivní hematopoézu.

Progenitorové hematopoetické buňky žloutkového vaku patří do kategorie nejranějších hematopoetických progenitorových buněk. Jejich fenotyp je popsán vzorcem AA4.1+CD34+c-kit+. Na rozdíl od zralých HSC kostní dřeně neexprimují antigeny Sca-1 a molekuly MHC. Zdá se, že výskyt markerových antigenů na povrchových membránách HSC žloutkového vaku během kultivace odpovídá jejich diferenciaci během embryonálního vývoje s tvorbou kommitovaných hematopoetických linií: hladina exprese antigenu CD34 a Thy-1 klesá, exprese CD38 a CD45RA se zvyšuje a objevují se molekuly HLA-DR. S následnou specializací in vitro indukovanou cytokiny a růstovými faktory začíná exprese antigenů specifických pro hematopoetické progenitorové buňky určité buněčné linie. Výsledky studia embryonální hematopoézy u zástupců tří tříd obratlovců (obojživelníci, ptáci a savci) a zejména analýza původu HSC zodpovědných za definitivní hematopoézu v postnatální ontogenezi však odporují klasickým konceptům. Bylo zjištěno, že u zástupců všech uvažovaných tříd se během embryogeneze tvoří dvě nezávislé oblasti, ve kterých vznikají HSC. Extraembryonální „klasická“ oblast je reprezentována žloutkovým vakem nebo jeho analogy, zatímco nedávno identifikovaná intraembryonální zóna lokalizace HSC zahrnuje paraaortální mezenchym a oblast AGM. Dnes lze tvrdit, že u obojživelníků a ptáků definitivní HSC pocházejí z intraembryonálních zdrojů, zatímco u savců a lidí nelze účast HSC žloutkového vaku na definitivní hematopoéze zatím zcela vyloučit.

Embryonální hematopoéza v žloutkovém vaku je ve skutečnosti primární erytropoéza, která se vyznačuje zachováním jádra ve všech fázích zrání erytrocytů a syntézou hemoglobinu fetálního typu. Podle nejnovějších údajů končí vlna primární erytropoézy v žloutkovém vaku 8. den embryonálního vývoje. Následuje období akumulace definitivních erytroidních progenitorových buněk - BFU-E, které se tvoří výhradně v žloutkovém vaku a poprvé se objevují 9. den gestace. V další fázi embryogeneze jsou již vytvořeny definitivní erytroidní progenitorové buňky - CFU-E, stejně jako (!) žírné buňky a CFU-GM. To je základ pro názor, že definitivní progenitorové buňky vznikají v žloutkovém vaku, migrují s krevním oběhem, usazují se v játrech a rychle zahajují první fázi intraembryonální hematopoézy. Podle těchto konceptů lze žloutkový váček považovat na jedné straně za místo primární erytropoézy a na druhé straně za první zdroj definitivních hematopoetických progenitorových buněk v embryonálním vývoji.

Bylo prokázáno, že buňky tvořící kolonie s vysokým proliferačním potenciálem lze izolovat ze žloutkového vaku již 8. den gestace, tj. dlouho před uzavřením cévního systému embrya a žloutkového vaku. Buňky s vysokým proliferačním potenciálem získané ze žloutkového vaku in vitro navíc tvoří kolonie, jejichž velikost a buněčné složení se neliší od odpovídajících parametrů kulturního růstu kmenových buněk kostní dřeně. Zároveň se při retransplantaci buněk tvořících kolonie ze žloutkového vaku s vysokým proliferačním potenciálem tvoří výrazně více dceřiných buněk tvořících kolonie a multipotentních progenitorových buněk než při použití progenitorových buněk kostní dřeně hematopoézy.

Konečný závěr o roli hematopoetických kmenových buněk žloutkového váčku v definitivní hematopoéze by mohly poskytnout výsledky práce, ve které autoři získali linii endotelových buněk žloutkového váčku (G166), která účinně podporovala proliferaci svých buněk s fenotypovými a funkčními charakteristikami HSC (AA4.1+WGA+, nízká hustota a slabé adhezní vlastnosti). Obsah těchto buněk se při kultivaci na podpůrné vrstvě buněk C166 po dobu 8 dnů zvýšil více než 100krát. Ve smíšených koloniích pěstovaných na podvrstvě buněk C166 byly identifikovány makrofágy, granulocyty, megakaryocyty, blastové buňky a monocyty, stejně jako prekurzorové buňky B- a T-lymfocytů. Buňky žloutkového váčku rostoucí na podvrstvě endotelových buněk měly schopnost autonomní reprodukce a v experimentech autorů vydržely až tři pasáže. Obnovení hematopoézy s jejich pomocí u dospělých myší s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) bylo doprovázeno tvorbou všech typů leukocytů, stejně jako T- a B-lymfocytů. Autoři však ve svých studiích použili buňky žloutkového vaku 10 dní starého embrya, u kterého jsou extra- a intraembryonální cévní systémy již uzavřeny, což nám neumožňuje vyloučit přítomnost intraembryonálních HSC mezi buňkami žloutkového vaku.

Zároveň analýza diferenciačního potenciálu hematopoetických buněk raných stádií vývoje, izolovaných před sjednocením cévních systémů žloutkového vaku a embrya (8-8,5 dne gestace), odhalila přítomnost prekurzorů T- a B-buněk v žloutkovém vaku, ale nikoli v těle embrya. V systému in vitro se metodou dvoustupňové kultivace na monovrstvě epiteliálních a subepiteliálních buněk brzlíku mononukleární buňky žloutkového vaku diferencovaly na pre-T- a zralé T-lymfocyty. Za stejných kultivačních podmínek, ale na monovrstvě stromálních buněk jater a kostní dřeně, se mononukleární buňky žloutkového vaku diferencovaly na pre-B-buňky a zralé IglVT-B-lymfocyty.

Výsledky těchto studií naznačují možnost vývoje buněk imunitního systému z extraembryonální tkáně žloutkového vaku a tvorba primárních T- a B-buněčných linií závisí na faktorech stromálního mikroprostředí embryonálních hematopoetických orgánů.

Jiní autoři také prokázali, že žloutkový vak obsahuje buňky s potenciálem pro lymfoidní diferenciaci a výsledné lymfocyty se neliší antigenními vlastnostmi od buněk pohlavně dospělých zvířat. Bylo zjištěno, že buňky žloutkového vaku 8-9denního embrya jsou schopny obnovit lymfopoézu v atymocytárním brzlíku se vznikem zralých CD3+CD4+- a CD3+CD8+-lymfocytů s vytvořeným repertoárem T-buněčných receptorů. Brzlík tedy může být osídlen buňkami extraembryonálního původu, ale nelze vyloučit pravděpodobnou migraci raných prekurzorových buněk T-lymfocytů z intraembryonálních zdrojů lymfopoézy do brzlíku.

Zároveň transplantace hematopoetických buněk žloutkového vaku dospělým ozářeným příjemcům nevede vždy k dlouhodobé repopulaci depleovaných lokalizačních zón hematopoetické tkáně a buňky žloutkového vaku in vitro tvoří výrazně méně slezinných kolonií než buňky oblasti AGM. V některých případech je s použitím buněk žloutkového vaku 9denního embrya stále možné dosáhnout dlouhodobé (až 6 měsíců) repopulace hematopoetické tkáně u ozářených příjemců. Autoři se domnívají, že buňky žloutkového vaku s fenotypem CD34+c-kit+ se nejen neliší od buněk z oblasti AGM ve své schopnosti repopulovat depleované hematopoetické orgány, ale také účinněji obnovují hematopoézu, protože žloutkový vak jich obsahuje téměř 37krát více.

Je třeba poznamenat, že v experimentech byly použity hematopoetické buňky žloutkového váčku s markerovými antigeny hematopoetických kmenových buněk (c-kit+ a/nebo CD34+ a CD38+), které byly injikovány přímo do jater nebo břišní žíly potomků samic myší, které dostaly injekci busulfanu 18. den březosti. U těchto novorozených zvířat byla jejich vlastní myelopoéza prudce potlačena v důsledku eliminace hematopoetických kmenových buněk způsobené busulfanem. Po transplantaci hematopoetických kmenových buněk žloutkového váčku byly v periferní krvi příjemců po dobu 11 měsíců detekovány formované elementy obsahující donorový marker - glycerofosfátdehydrogenázu. Bylo zjištěno, že HSC žloutkového váčku obnovují obsah lymfoidních, myeloidních a erytroidních buněk v krvi, brzlíku, slezině a kostní dřeni a úroveň chimerismu byla vyšší v případě intrahepatálního než intravenózního podání buněk žloutkového váčku. Autoři se domnívají, že HSC žloutkového vaku embryí v raném stádiu (do 10 dnů) vyžadují předběžnou interakci s hematopoetickým mikroprostředím jater, aby se úspěšně osídlily hematopoetické orgány dospělých příjemců. Je možné, že v embryogenezi existuje jedinečná fáze vývoje, kdy buňky žloutkového vaku, nejprve migrující do jater, poté získají schopnost osídlit stroma hematopoetických orgánů zralých příjemců.

V tomto ohledu je třeba poznamenat, že chimerismus buněk imunitního systému je poměrně často pozorován po transplantaci buněk kostní dřeně ozářeným zralým příjemcům - v krvi těchto příjemců se buňky dárcovského fenotypu nacházejí v poměrně velkém množství mezi B-, T-lymfocyty a granulocyty příjemce, což trvá nejméně 6 měsíců.

Hematopoetické buňky u savců jsou poprvé detekovány morfologickými metodami 7. den embryonálního vývoje a jsou reprezentovány hematopoetickými ostrůvky uvnitř cév žloutkového vaku. Přirozená hematopoetická diferenciace v žloutkovém vaku je však omezena na primární erytrocyty, které si zachovávají jádra a syntetizují fetální hemoglobin. Tradičně se však věřilo, že žloutkový vak slouží jako jediný zdroj HSC migrujících do hematopoetických orgánů vyvíjejícího se embrya a zajišťujících definitivní hematopoézu u dospělých zvířat, protože výskyt HSC v těle embrya se shoduje s uzavřením cévních systémů žloutkového vaku a embrya. Tento názor podporují údaje, že buňky žloutkového vaku, když jsou klonovány in vitro, dávají vzniknout granulocytům a makrofágům a in vivo slezinným koloniím. V průběhu transplantačních experimentů bylo následně zjištěno, že hematopoetické buňky žloutkového vaku, které jsou v samotném žloutkovém vaku schopny diferenciace pouze na primární erytrocyty, v mikroprostředí jater novorozených a dospělých myší SCID, depleovaném brzlíku nebo stromálním výživném orgánu, získávají schopnost repopulovat hematopoetické orgány s obnovou všech hematopoetických linií i u dospělých recipientních zvířat. V principu nám to umožňuje klasifikovat je jako skutečné HSC - jako buňky, které fungují v postnatálním období. Předpokládá se, že žloutkový vak spolu s oblastí AGM slouží jako zdroj HSC pro definitivní hematopoézu u savců, ale jejich příspěvek k vývoji hematopoetického systému je stále nejasný. Biologický význam existence dvou hematopoetických orgánů s podobnými funkcemi v rané embryogenezi savců je také nejasný.

Hledání odpovědí na tyto otázky pokračuje. In vivo se podařilo prokázat přítomnost buněk, které obnovují lymfopoézu, v žloutkovém vaku 8-8,5 dne starých embryí u subletálně ozářených myší SCID s výrazným deficitem T- a B-lymfocytů. Hematopoetické buňky ze žloutkového vaku byly injikovány intraperitoneálně i přímo do sleziny a jaterní tkáně. Po 16 týdnech byly u příjemců detekovány TCR/CD34 CD4+ a CD8+ T-lymfocyty a B-220+IgM+ B-lymfocyty značené antrogenními geny MHC od dárce. Zároveň autoři v těle 8-8,5 dne starých embryí nenalezli kmenové buňky schopné takové obnovy imunitního systému.

Hematopoetické buňky žloutkového vaku mají vysoký proliferační potenciál a jsou schopné prodloužené autoreprodukce in vitro. Někteří autoři identifikují tyto buňky jako HSC na základě prodloužené (téměř 7 měsíců) generace erytroidních progenitorových buněk, které se od progenitorů kostní dřeně erytroidní linie liší delší dobou pasážování, větší velikostí kolonií, zvýšenou citlivostí na růstové faktory a delší proliferací. Kromě toho se za vhodných podmínek kultivace buněk žloutkového vaku in vitro tvoří i lymfoidní progenitorové buňky.

Prezentovaná data nám obecně umožňují považovat žloutkový váček za zdroj HSC, méně vázaných, a proto s větším proliferačním potenciálem než kmenové buňky kostní dřeně. Navzdory skutečnosti, že žloutkový váček obsahuje pluripotentní hematopoetické progenitorové buňky, které si in vitro dlouhodobě udržují různé linie hematopoetické diferenciace, jediným kritériem pro úplnost HSC je jejich schopnost dlouhodobě repopulovat hematopoetické orgány příjemce, jehož hematopoetické buňky jsou zničeny nebo geneticky defektní. Klíčovou otázkou tedy je, zda pluripotentní hematopoetické buňky žloutkového váčku mohou migrovat a osídlovat hematopoetické orgány a zda je vhodné revidovat známé práce, které prokazují jejich schopnost repopulovat hematopoetické orgány dospělých zvířat s tvorbou hlavních hematopoetických linií. Intraembryonální zdroje definitivních GSC byly identifikovány u ptačích embryí již v 70. letech 20. století, což již tehdy zpochybnilo zavedené představy o extraembryonálním původu GSC, a to i u zástupců jiných tříd obratlovců. V posledních několika letech se objevily publikace o přítomnosti podobných intraembryonálních oblastí obsahujících GSC u savců a lidí.

Je třeba znovu poznamenat, že základní znalosti v této oblasti jsou pro praktickou buněčnou transplantologii nesmírně důležité, protože pomohou nejen určit preferovaný zdroj HSC, ale také stanovit charakteristiky interakce primárních hematopoetických buněk s geneticky cizím organismem. Je známo, že zavedení hematopoetických kmenových buněk lidských fetálních jater do embrya ovce ve fázi organogeneze vede k narození chimérických zvířat, v jejichž krvi a kostní dřeni je stabilně stanoveno 3 až 5 % lidských hematopoetických buněk. Zároveň lidské HSC nemění svůj karyotyp, zachovávají si vysokou míru proliferace a schopnost diferenciace. Transplantované xenogenní HSC navíc nekonfliktují s imunitním systémem a fagocyty hostitelského organismu a netransformují se do nádorových buněk, což tvořilo základ pro intenzivní vývoj metod intrauterinní korekce dědičné genetické patologie s využitím HSC nebo ESC transfekovaných deficitními geny.

V jaké fázi embryogeneze je však vhodnější takovou korekci provést? Poprvé se buňky určené pro hematopoézu objevují u savců bezprostředně po implantaci (6. den gestace), kdy ještě chybí morfologické známky hematopoetické diferenciace a předpokládané hematopoetické orgány. V této fázi jsou dispergované buňky myšího embrya schopny repopulovat hematopoetické orgány ozářených příjemců s tvorbou erytrocytů a lymfocytů, které se od hostitelských buněk liší typem hemoglobinu, respektive glycerofosfátizomerázy, a také dalším chromozomálním markerem (Tb) dárcovských buněk. U savců, stejně jako u ptáků, se současně se žloutkovým vakem, před uzavřením společného cévního řečiště, objevují hematopoetické buňky přímo v těle embrya v paraaortální splanchnopleuře. Z oblasti AGM byly izolovány hematopoetické buňky fenotypu AA4.1+ a charakterizovány jako multipotentní hematopoetické buňky, které tvoří T- a B-lymfocyty, granulocyty, megakaryocyty a makrofágy. Fenotypicky jsou tyto multipotentní progenitorové buňky velmi blízké HSC kostní dřeně dospělých zvířat (CD34+c-kit+). Počet multipotentních AA4.1+ buněk mezi všemi buňkami oblasti AGM je malý - tvoří ne více než 1/12 její části.

V lidském embryu byla také identifikována intraembryonální oblast obsahující HSC homologní s oblastí AGM u zvířat. Navíc u lidí je více než 80 % multipotentních buněk s vysokým proliferačním potenciálem obsaženo v těle embrya, ačkoli tyto buňky jsou přítomny i v žloutkovém vaku. Detailní analýza jejich lokalizace ukázala, že stovky takových buněk jsou shromážděny v kompaktních skupinách, které se nacházejí v těsné blízkosti endotelu ventrální stěny dorzální aorty. Fenotypicky se jedná o buňky CD34CD45+Lin. Naopak v žloutkovém vaku, stejně jako v dalších hematopoetických orgánech embrya (játra, kostní dřeň), jsou takové buňky jednotlivé.

V důsledku toho v lidském embryu obsahuje oblast AGM shluky hematopoetických buněk úzce asociované s ventrálním endotelem dorzální aorty. Tento kontakt je patrný i na imunochemické úrovni – jak buňky hematopoetických shluků, tak endotelové buňky exprimují vaskulární endoteliální růstový faktor, ligand Flt-3, jejich receptory FLK-1 a STK-1, stejně jako transkripční faktor leukemických kmenových buněk. V oblasti AGM jsou mezenchymální deriváty reprezentovány hustým řetězcem zaoblených buněk umístěných podél celé dorzální aorty a exprimujících tenascin C – glykoprotein základní látky aktivně zapojenou do procesů mezibuněčné interakce a migrace.

Multipotentní kmenové buňky oblasti AGM po transplantaci rychle obnovují hematopoézu u zralých ozářených myší a zajišťují účinnou hematopoézu po dlouhou dobu (až 8 měsíců). Autoři nenalezli buňky s takovými vlastnostmi v žloutkovém vaku. Výsledky této studie potvrzují data z jiné práce, která ukázala, že u embryí v raných stádiích vývoje (10,5 dne) je oblast AGM jediným zdrojem buněk, které odpovídají definici HSC, a obnovují myeloidní a lymfoidní hematopoézu u zralých ozářených příjemců.

Z oblasti AGM byla izolována stromální linie AGM-S3, jejíž buňky v kultuře podporují generování progenitorových buněk CFU-GM, BFU-E, CFU-E a jednotek tvořících kolonie smíšeného typu. Obsah těchto buněk se během kultivace na podpůrné podvrstvě buněk linie AGM-S3 zvyšuje 10 až 80krát. Mikroprostředí oblasti AGM tedy obsahuje stromální základní buňky, které účinně podporují hematopoézu, takže samotná oblast AGM může fungovat jako embryonální hematopoetický orgán - zdroj definitivních HSC, tj. HSC, které tvoří hematopoetickou tkáň dospělého zvířete.

Rozšířená imunofenotypizace buněčného složení oblasti AGM ukázala, že obsahuje nejen multipotentní hematopoetické buňky, ale také buňky vázané na myeloidní a lymfoidní (T- a B-lymfocyty) diferenciaci. Molekulární analýza jednotlivých buněk CD34+c-kit+ z oblasti AGM pomocí polymerázové řetězové reakce však odhalila aktivaci pouze genů beta-globinu a myeloperoxidázy, nikoli však lymfoidních genů kódujících syntézu CD34, Thy-1 a 15. Částečná aktivace genů specifických pro danou linii je charakteristická pro raná ontogenetická stádia generace HSC a progenitorových buněk. Vzhledem k tomu, že počet vázaných progenitorových buněk v oblasti AGM 10denního embrya je o 2–3 řády nižší než v játrech, lze tvrdit, že 10. den embryogeneze hematopoéza v oblasti AGM teprve začíná, zatímco v hlavním hematopoetickém orgánu plodu se v tomto období hematopoetické linie již vyvinuly.

Na rozdíl od dřívějších (9-11 dní) hematopoetických kmenových buněk žloutkového vaku a oblasti AGM, které repopulují hematopoetické mikroprostředí novorozence, ale nikoli dospělého organismu, hematopoetické progenitorové buňky 12-17denních embryonálních jater již nevyžadují časné postnatální mikroprostředí a osídlují hematopoetické orgány dospělého zvířete o nic hůře než novorozenec. Po transplantaci embryonálních jaterních HSC měla hematopoéza u ozářených dospělých recipientních myší polyklonální charakter. Navíc se pomocí značených kolonií ukázalo, že fungování roubovaných klonů je zcela podřízeno klonální sukcesi zjištěné v dospělé kostní dřeni. V důsledku toho embryonální jaterní HSC, značené za nejšetrnějších podmínek, bez prestimulace exogenními cytokiny, již mají hlavní vlastnosti dospělých HSC: nevyžadují časné postembryonální mikroprostředí, po transplantaci vstupují do stavu hlubokého dormance a jsou postupně mobilizovány do klonální formace v souladu s modelem klonální sukcese.

Je zřejmé, že je nutné se fenoménu klonální sukcese věnovat podrobněji. Erytropoézu provádějí hematopoetické kmenové buňky, které mají vysoký proliferační potenciál a schopnost diferencovat se do všech linií komitovaných prekurzorových buněk krevních buněk. Při normální intenzitě hematopoézy je většina hematopoetických kmenových buněk v dormantním stavu a je mobilizována k proliferaci a diferenciaci, přičemž postupně tvoří klony, které se vzájemně nahrazují. Tento proces se nazývá klonální sukcese. Experimentální důkazy o klonální sukcesi v hematopoetickém systému byly získány ve studiích s HSC označenými retrovirovým přenosem genů. U dospělých zvířat je hematopoéza udržována mnoha současně fungujícími hematopoetickými klony, deriváty HSC. Na základě fenoménu klonální sukcese byl vyvinut repopulační přístup k identifikaci HSC. Podle tohoto principu se rozlišuje mezi dlouhodobými hematopoetickými kmenovými buňkami (LT-HSC), které jsou schopny obnovovat hematopoetický systém po celý život, a krátkodobými HSC, které tuto funkci plní po omezenou dobu.

Pokud budeme uvažovat o hematopoetických kmenových buňkách z hlediska repopulačního přístupu, pak zvláštností hematopoetických buněk embryonálních jater je jejich schopnost vytvářet kolonie, které jsou výrazně větší než kolonie v růstu HSC z pupečníkové krve nebo kostní dřeně, a to platí pro všechny typy kolonií. Tato skutečnost sama o sobě naznačuje vyšší proliferační potenciál hematopoetických buněk embryonálních jater. Unikátní vlastností hematopoetických progenitorových buněk embryonálních jater je kratší buněčný cyklus ve srovnání s jinými zdroji, což má velký význam z hlediska účinnosti repopulace hematopoetických orgánů během transplantace. Analýza buněčného složení hematopoetické suspenze získané ze zdrojů zralého organismu ukazuje, že ve všech fázích ontogeneze jsou jaderné buňky převážně reprezentovány finalně diferencovanými buňkami, jejichž počet a fenotyp závisí na ontogenetickém věku dárce hematopoetické tkáně. Zejména suspenze mononukleárních buněk kostní dřeně a pupečníkové krve se skládají z více než 50 % zralých buněk lymfoidní řady, zatímco hematopoetická tkáň embryonálních jater obsahuje méně než 10 % lymfocytů. Kromě toho jsou buňky myeloidní linie v embryonálních a fetálních játrech zastoupeny převážně erytroidní řadou, zatímco v pupečníkové krvi a kostní dřeni převažují granulocytárně-makrofágové elementy.

Je také důležité, že embryonální játra obsahují kompletní sadu nejranějších hematopoetických prekurzorů. Mezi nimi je třeba zmínit erytroidní, granulopoetické, megakaryopoetické a multiliniové kolonie tvořící buňky. Jejich primitivnější prekurzory - LTC-IC - jsou schopné proliferovat a diferencovat se in vitro po dobu 5 týdnů nebo déle a také si zachovávají funkční aktivitu po usazení v těle příjemce během alogenní a dokonce i xenogenní transplantace imunodeficitním zvířatům.

Biologická účelnost převahy erytroidních buněk v embryonálních játrech (až 90 % celkového počtu hematopoetických elementů) je dána potřebou zásobit rychle rostoucím objemem krve vyvíjejícího se plodu erytrocytární hmotou. V embryonálních játrech je erytropoéza reprezentována jadernými erytroidními prekurzory různého stupně zralosti obsahujícími fetální hemoglobin (a2u7), který díky své vyšší afinitě ke kyslíku zajišťuje jeho efektivní absorpci z mateřské krve. Intenzifikace erytropoézy v embryonálních játrech je spojena s lokálním zvýšením syntézy erytropoetinu (EPO). Je pozoruhodné, že samotná přítomnost erytropoetinu je dostatečná k realizaci hematopoetického potenciálu hematopoetických buněk v embryonálních játrech, zatímco pro navázání HSC kostní dřeně a pupečníkové krve na erytropoézu je nutná kombinace cytokinů a růstových faktorů sestávajících z EPO, SCF, GM-CSF a IL-3. Zároveň rané hematopoetické progenitorové buňky izolované z embryonálních jater, které nemají receptory pro EPO, nereagují na exogenní erytropoetin. Pro indukci erytropoézy v suspenzi mononukleárních buněk embryonálních jater je nezbytná přítomnost pokročilejších buněk citlivých na erytropoetin s fenotypem CD34+CD38+, které exprimují EPO receptor.

V literatuře stále neexistuje shoda ohledně vývoje hematopoézy v embryonálním období. Funkční význam existence extra- a intraembryonálních zdrojů hematopoetických progenitorových buněk nebyl stanoven. Není však pochyb o tom, že v lidské embryogenezi jsou játra ústředním orgánem hematopoézy a v 6. až 12. týdnu těhotenství slouží jako hlavní zdroj hematopoetických kmenových buněk, které osídlují slezinu, brzlík a kostní dřeň. GDR zajišťují plnění odpovídajících funkcí v pre- a postnatálním období vývoje.

Je třeba ještě jednou poznamenat, že embryonální játra se ve srovnání s jinými zdroji vyznačují nejvyšším obsahem HSC. Přibližně 30 % buněk CD344 embryonálních jater má fenotyp CD38. Zároveň počet lymfoidních progenitorových buněk (CD45+) v raných fázích hematopoézy v játrech nepřesahuje 4 %. Bylo zjištěno, že s vývojem plodu od 7. do 17. týdne těhotenství počet B-lymfocytů progresivně roste s měsíčním „krokem“ 1,1 %, zatímco hladina HSC trvale klesá.

Funkční aktivita hematopoetických kmenových buněk závisí také na období embryonálního vývoje jejich zdroje. Studie kolonietvorné aktivity jaterních buněk lidských embryí v 6-8 a 9-12 týdnech těhotenství během kultivace v polotekutém médiu za přítomnosti SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 a EPO ukázala, že celkový počet kolonií je 1,5krát vyšší při inokulaci HSC embryonálních jater v raných stádiích vývoje. Zároveň je počet myelopoetických progenitorových buněk, jako je CFU-GEMM, v játrech v 6-8 týdnech embryogeneze více než třikrát vyšší než jejich počet v 9-12 týdnech těhotenství. Obecně byla kolonietvorná aktivita hematopoetických jaterních buněk embryí v prvním trimestru těhotenství významně vyšší než u fetálních jaterních buněk ve druhém trimestru těhotenství.

Výše uvedené údaje naznačují, že embryonální játra se na počátku embryogeneze vyznačují nejen zvýšeným obsahem raných hematopoetických progenitorových buněk, ale jejich hematopoetické buňky se vyznačují širším spektrem diferenciace do různých buněčných linií. Tyto znaky funkční aktivity hematopoetických kmenových buněk embryonálních jater mohou mít určitý klinický význam, protože jejich kvalitativní charakteristiky nám umožňují očekávat výrazný terapeutický účinek při transplantaci i malého počtu buněk získaných v raných stádiích těhotenství.

Problém množství hematopoetických kmenových buněk potřebných pro efektivní transplantaci však zůstává otevřený a relevantní. Vyvíjejí se pokusy o jeho řešení s využitím vysokého potenciálu autoreprodukce hematopoetických buněk embryonálních jater in vitro při stimulaci cytokiny a růstovými faktory. Při konstantní perfuzi raných embryonálních HSC jater v bioreaktoru je možné po 2–3 dnech získat množství hematopoetických kmenových buněk s výstupem 15krát vyšším než jejich počáteční úroveň. Pro srovnání je třeba poznamenat, že k dosažení 20násobného zvýšení výstupu lidských HSC z pupečníkové krve za stejných podmínek jsou zapotřebí alespoň dva týdny.

Embryonální játra se tedy liší od jiných zdrojů hematopoetických kmenových buněk vyšším obsahem jak commitovaných, tak i časných hematopoetických progenitorových buněk. V kultuře s růstovými faktory tvoří embryonální jaterní buňky s fenotypem CD34+CD45Ra1 CD71l0W 30krát více kolonií než podobné buňky pupečníkové krve a 90krát více než HSC kostní dřeně. Nejvýraznější rozdíly ve specifikovaných zdrojích jsou v obsahu časných hematopoetických progenitorových buněk, které tvoří smíšené kolonie - množství CFU-GEMM v embryonálních játrech převyšuje množství v pupečníkové krvi a kostní dřeni 60krát, respektive 250krát.

Je také důležité, že až do 18. týdne embryonálního vývoje (období nástupu hematopoézy v kostní dřeni) se na realizaci hematopoetické funkce podílí více než 60 % jaterních buněk. Vzhledem k tomu, že lidský plod nemá brzlík a tedy ani thymocyty až do 13. týdne vývoje, transplantace hematopoetických buněk z embryonálních jater v 6.–12. týdnu těhotenství významně snižuje riziko vzniku reakce „štěp proti hostiteli“ a nevyžaduje výběr histokompatibilního dárce, protože umožňuje relativně snadné dosažení hematopoetického chimerismu.