Umělé srdcové ventily

Moderní, k dispozici pro klinické použití, biologické umělé srdeční chlopně, s výjimkou plicního autograftu, jsou neživotaschopné struktury, které postrádají potenciál pro růst a opravu tkáně. To způsobuje významná omezení jejich použití, zejména u dětí, při korekci chlopňové patologie. Tkáňové inženýrství vzniklo za posledních 15 let. Účelem tohoto vědeckého směru je vytvoření umělých stavů umělých srdečních chlopní s tromboticky odolným povrchem a životaschopným interstitem.

[1], [2],

Jak se vyvíjejí umělé srdeční chlopně?

Vědecké koncepce tkáňového inženýrství je založen na myšlence usazování a pěstování živých buněk (fibroblasty, kmenové buňky, atd) ve syntetického nebo přírodního vstřebatelné kostry (matrice), které představují trojrozměrné struktury ventilu, stejně jako využívání signálů, které regulují expresi genů, organizace a produktivita transplantovaný buněk během periody tvorby extracelulární matrice.

Takové umělé srdeční chlopně jsou integrovány do tkáně pacienta pro konečnou obnovu a další údržbu její struktury a funkce. Tak na počáteční matrice v důsledku provozních buněk (fibroblasty a myofibroblasty al.), Nový rám kollagenoelastinovy, nebo přesněji, extracelulární matrix. Výsledkem je, že optimální umělé srdeční chlopně podle tkáňové inženýrství technika moštu anatomické struktury a jejich funkce je blíže k nativní, a mají biomechanickou přizpůsobivost, schopnost opravit a růst.

Tkáňové inženýrství vyvíjí umělé srdeční chlopně pomocí různých zdrojů sklizně buněk. Tak mohou být použity xenogenetické nebo alogenní buňky, i když první jsou spojeny s rizikem přenosu zoonóz na člověka. Ke snížení antigenicity a předcházení reakcí odmítnutí organismu je možná genetická modifikace alogenních buněk. Tkáňové inženýrství vyžaduje spolehlivý zdroj buněčné produkce. Tento zdroj jsou autogenní buňky, které byly odebrány přímo od pacienta a nedávají imunitní odpovědi během reimplantace. Účinné umělé srdeční chlopně se vyrábějí na základě autologních buněk pocházejících z cév (tepny a žíly). K získání čisté buněčné kultury byl vyvinut způsob založený na použití třídění fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS). Smíšená buněčná populace odvozená z krevní cévy je značena acetylovaným lipoproteinovým markerem s nízkou hustotou, který je selektivně absorbován na povrchu endoteliocytů. Endoteliocyty mohou být následně snadno odděleny od velkého množství buněk odvozených z cév, které budou reprezentovány směsí buněk hladkého svalstva, myofibroblastů a fibroblastů. Zdroj buněk, ať už jde o tepnu nebo žíly, ovlivní vlastnosti konečné struktury. Takže umělé srdeční chlopně s matricí osetou žilními buňkami, co se týče stupně tvorby kolagenu a mechanické stability, překračují struktury poseté arteriálními buňkami. Výběr periferních žil se zdá být vhodnějším zdrojem sklizně buněk.

Myofibroblasty mohou být také odebrány z karotických arterií. Současně se buňky získané z nádob v podstatě liší od jejich přirozených intersticiálních buněk. Autologní buňky pupečníkové šňůry mohou být použity jako alternativní zdroj buněk.

Umělé srdcové chlopně založené na kmenových buňkách

Pokrok v oblasti tkáňového inženýrství v posledních letech usnadňuje výzkum kmenových buněk. Použití kmenových buněk červené kostní dřeně má své výhody. Zejména jednoduchost odběru biomateriálů a kultivace in vitro s následnou diferenciací na různé typy mezenchymálních buněk umožňuje zabránit použití neporušených nádob. Kmenové buňky jsou pluripotentní zdroje buněčných zárodků, mají jedinečné imunologické vlastnosti, které přispívají k jejich stabilitě v alogenních podmínkách.

Lidské kmenové buňky kostní dřeně jsou získány stenovou punkcí nebo punkcí iliakálního hřebene. Izolují se z 10-15 ml aspirátu hrudní kosti, oddělují se od ostatních buněk a kultivují se. Po dosažení požadovaného počtu buněk (obvykle během 21-28 dnů) produkují jejich setí (kolonizace) v matrici se kultivuje v médiu v této poloze (po dobu 7 dnů ve zvlhčovaném inkubátoru při 37 ° C v přítomnosti 5% CO 2). Následně stimulace růstu buněk prostřednictvím kupturalnuyu prostředí (biologický podněty) nebo fyziologických podmínek prostřednictvím vytvoření růstu tkání během jeho deformace v izometrickém přehrávacího přístroje pulzní - bioreaktoru (mechanické stimuly). Fibroblasty jsou citlivé na mechanické podněty, které podporují jejich růst a funkční aktivitu. Pulzující proud způsobuje buňky osídlených ve směru působení těchto napětí nárůst radiálním i obvodových deformací, což vede k orientaci (prodloužení). To vede následně k tvorbě orientovaných vlákenných struktur klapek. Konstantní průtok způsobuje na stěnách pouze tangenciální napětí. Pulzující tok má příznivý účinek na morfologii, proliferaci a složení extracelulární matrice. Povaha živného toku média, fyzikálně-chemické podmínky (pH, pO2 a pCO 2) v bioreaktoru také významně ovlivnit tvorbu kolagenu. Takže laminární tok, cyklické vířivé proudy zvyšují tvorbu kolagenu, což vede ke zlepšení mechanických vlastností.

Dalším přístupem v rostoucí struktuře tkáně je vytvoření embryonálních podmínek v bioreaktoru namísto modelování fyziologických podmínek lidského těla. Pěstuje kmenových buněk tkáně bioklapany mít pohyblivé klapky a plastové operativně-off při vysokém tlaku a průtoku, přesahující fyziologické úrovni. Histologické a histochemické studie letáky těchto struktur ukázala přítomnost v nich aktivně běžící procesy biodegradace matrice a nahradit ji životaschopnou tkání. Tkanina typ laminátu uspořádány na vlastnostech proteinů extracelulární matrix, takové charakteristiky nativní tkáně na přítomnost kolagenu typu I a III, a glykosaminoglykanů. Typická třívrstvá struktura ventilů - ventrikulární, houbovitá a vláknitá vrstva - však nebyla získána. Ve všech fragmentech byly ASMA-pozitivní buňky exprimující vimentin vykazovaly vlastnosti podobné vlastnostem myofibroblastů. Bylo zjištěno, že elektronová mikroskopie buněčných elementů za charakteristické pro životaschopné, aktivních sekrečních myofibroblastů (aktin / myosin vlákna, kolagenových vláken, elastin) a na povrchu tkaniny - endotelové buňky.

Na ventilech byly nalezeny obojky typu I, III, ASMA a vimentinu. Mechanické vlastnosti křídel tkáně a přirozených struktur byly srovnatelné. Tkáňové umělé srdeční chlopně vykazovaly vynikající výkon po dobu 20 týdnů a připomínaly přirozené anatomické struktury pro svou mikrostrukturu, biochemický profil a tvorbu proteinové matrice.

Všechny umělé srdeční chlopně, získané metodou tkáňového inženýrství, byly implantovány do plicní polohy zvířetem, protože jejich mechanické vlastnosti neodpovídají zatížením v aortální poloze. Tkáňové ventily implantované ze zvířat jsou strukturně podobné ve své struktuře jako nativní, což naznačuje jejich další vývoj a přeskupení v podmínkách in vivo. Zda se proces implantování umělých srdečních chlopní do implantovaných umělých srdečních chlopní bude pokračovat ve fyziologických podmínkách, jak se pozoruje u experimentů na zvířatech, budou pokračovat další studie.

Ideální umělé srdeční chlopně by měly mít pórovitost ne méně než 90%, protože je velmi důležité pro růst buněk, dodávání živin a odstranění produktů buněčného metabolismu, kromě biokompatibility a biologické rozložitelnosti, umělé srdeční chlopně by měl mít chemicky příznivý k naočkování povrchu buněk a odpovídají mechanicky vlastnosti přirozené tkáně. Úroveň biodegradace matrice musí být řízena a úměrná úrovni tvorby nové tkáně, aby byla zajištěna záruka mechanické stability po určitou dobu.

V současné době se vyvíjejí syntetické a biologické matrice. Nejběžnějšími biologickými materiály pro vytváření matric jsou donorové anatomické struktury, kolagen a fibrin. Polymerní umělé srdeční chlopně jsou navrženy k biodegradaci po implantaci, jakmile implantované buňky začnou produkovat a organizovat vlastní síť extracelulárních matric. Tvorba nové matricové tkáně může být regulována nebo stimulována růstovými faktory, cytokiny nebo hormony.

[3], [4], [5], [6], [7]

Dárkové umělé srdeční chlopně

Dárcovské umělé srdeční chlopně, získané z lidí nebo zvířat a bez buněčných antigenů detsellyulyarizatsii pro snížení jejich imunogenicity, mohou být použity jako matrice. Konzervované proteiny extracelulární matrice jsou základem pro následnou adhezi buněk, které se vysévají. Existují následující metody pro odstranění buněčné elementy (atsellyulyarizatsii): zmrazení, léčba trypsin / EDTA, detergent - dodecylsulfát sodný, deoksikolatom sodný, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, jakož i vícekrokové metody enzymatické ošetření. Toto odstraní buněčné membrány, nukleové kyseliny, lipidy, cytoplazmatické struktury a rozpustné molekuly matrice se zachováním kolagenu a elastinu. Nicméně ideální metoda nebyla dosud nalezena. Pouze dodecylsulfát sodný (0,03 až 1%) nebo deoksikolat sodný (0,5-2%), vedla k úplnému odstranění buněk po ošetření 24 hodin.

Histologické vyšetření dálkové detsellyulyarizovannyh bioklapanov (aloimplantátu a xenograft) u pokusných zvířat (psů a prasat), ukázaly, že dochází k částečnému vrůstání a endotelizace myofibroblastů příjemce na základně, žádné známky kalcifikace. Byla zaznamenána středně výrazná zánětlivá infiltrace. V klinických studiích odvzdušněného ventilu SynerGraftTM se však vyvinula časná nedostatečnost. Matrice byla stanovena bioprotéza vyjádřena zánětlivou reakci, která byla původně nespecifické a byl doprovázen lymfocytární reakcí. Dysfunkce a degenerace bioprotézy se vyvinuly během jednoho roku. Kolonizace buněk nebyla pozorována v buňkách, nicméně byla zjištěna kalcifikace ventilů a buněk předimplantace.

Endoteliální buňky nasazený acelulární matrice a kultivované v in vitro a in vivo podmínky vytvořené koherentní vrstvu na povrchu klapek v a intersticiálních buněk naočkovaných nativní struktura ukázala jejich schopnost diferenciace. Nicméně, pro dosažení požadovaného fyziologického úroveň kolonizace v matrici buňky selhaly v dynamických podmínkách bioreaktoru, a implantované umělé srdeční chlopně byly doprovázeny dostatečně rychle (tři měsíce) zesílení v důsledku zrychleného proliferace buněk a tvorby extracelulární matrix. Tak, v této fázi je použití dárce acelulární matrice pro jejich kolonizaci buňkami má řadu nevyřešených problémů, včetně 8 imunologické a infekční povahy práce detsellyulyarizovannymi bioprotézy pokračuje.

Je třeba poznamenat, že kolagen je také jedním z potenciálních biologických materiálů pro výrobu matric biologicky odbouratelných. Může být použita ve formě pěny, gelu nebo desek, hub a jako předlisky na bázi vláken. Použití kolagenu je však spojeno s řadou technologických potíží. Zejména je těžké získat od pacienta. Proto jsou v současné době většina kolagenových matric živočišného původu. Zpožděná biologická degradace zvířecího kolagenu může mít zvýšené riziko infekce zoonózy, způsobit imunologické a zánětlivé reakce.

Fibrin je další biologický materiál s kontrolovanými vlastnostmi biodegradace. Vzhledem k tomu, že fibrinové gely mohou být vyrobeny z krve pacienta pro následnou výrobu autologní matrice, implantace takové struktury nezpůsobí jeho toxickou degradaci a zánětlivou reakci. Fibrin má však takové nevýhody, jako je difúze a vyplavování do prostředí a nízké mechanické vlastnosti.

[8], [9], [10], [11], [12]

Umělé srdcové ventily ze syntetických materiálů

Umělé srdcové ventily jsou také vyrobeny ze syntetických materiálů. Několik pokusů o výrobu ventilů matric byly založeny na použití polyglactin, polyglykolová kyselina (PGA), polilakticheskoy kyselina (PLA), kopolymer PGA a PLA (PLGA) a polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vysoce porézní syntetický materiál lze získat z tkaných nebo netkaných vláken a za použití technologie vyluhování solí. Slibné kompozitního materiálu (PGA / R4NV) pro výrobu matric odvozených z netkaných smyček kyselina polyglykolová (PGA), potažené poly-4-hydroxybutyrátu (R4NV). Vyrobené umělé srdeční chlopně z tohoto materiálu jsou sterilizovány ethylenoxidem. Nicméně, významná počáteční tuhost a tloušťka smyček těchto polymerů, jejich rychlá a nekontrolovaná degradace je doprovázeno uvolněním cytotoxických produktů kyselé, vyžadují další zkoumání a hledání jiných materiálů.

Které jsou použity autologní tkáňové kultivační destičky myofibroblasty kultivovaných na rámu pro vytvoření nosné matrice tím, že stimuluje produkci těchto buněk se získá vzorky s aktivními ventily živých buněk obklopených extracelulární matrix. Mechanické vlastnosti tkání těchto ventilů však nejsou dostatečné pro jejich implantaci.

Potřebná úroveň proliferace a regenerace tkáně vytvořeného ventilu nemůže být dosažena pouze kombinací buněk a matrice. Exprese buněčného genu a tvorby tkáně může být regulována nebo stimulována přidáním růstových faktorů, cytokinů nebo hormonů, mitogenních faktorů nebo adhezních faktorů v matricích a matricích. Byla studována možnost zavedení těchto regulátorů do biomateriálů matrice. Obecně existuje významný nedostatek výzkumu regulace procesu tvorby tkáňové chlopně pomocí biochemických podnětů.

Acelulární prasečí heterologní matice P plicní bioprotéza obsahuje detsellyulyarizovannoy tkaniny upraven speciální patentovanou AutoTissue GmbH postup sestávající z antibiotické léčby, deoxycholát sodný a alkohol Tato metoda zpracování přijaté Mezinárodní organizace pro normalizaci, eliminuje všechny živé buňky a strukturu postkletochnye (fibroblasty, endoteliální buňky, bakterie, viry, houby, mykoplasmy) zachovává architektura extracelulární matrix, snižuje hladinu DNA a RNA v tkáni na minim mA, což snižuje na nulu pravděpodobnost přenosu prasečího endogenního retroviru (Perv) osoby. Matrix P bioprotéza se skládá výhradně z kolagenu a elastinu se zachovanou strukturální integrace.

V průběhu pokusů na ovce byla zapsána minimální reakce od okolní tkáně za 11 měsíců po implantaci P Matrix bioprotéza s dobrým výkonem jeho přežití, který, zejména projevuje v jeho lesklý vnitřní povrch endokardu. Ve skutečnosti nedošlo k zánětlivým reakcím, zhrubnutí a zkrácení ventilových chlopní. Byla rovněž zaznamenána nízká hladina vápníku v tkáni bioprotézy Matrix P, rozdíl byl statisticky významný ve srovnání s ošetřeným glutaraldehydem.

Matrix P umělé srdeční chlopně jsou přizpůsobeny podmínkám každého jednotlivého pacienta na několik měsíců po implantaci. Ve studii na konci sledovaného období odhalila intaktní extracelulární matrice a vypouštěcí endothelium. Xenograftů Matrix R implantovány v kroku Ross provedené u 50 pacientů s vrozenými vadami v období od roku 2002 do roku 2004 se ukázalo, vyšší výkon a nižší transvalvular tlakové gradienty v porovnání s kryokonzervované a detsellyulyarizovannymi aloštěpu SynerGraftMT a bezrámových bioprotéz léčených glutaraldehydem. Matice P umělé srdeční chlopně na výměnu plicní tepny ventilu během rekonstrukce pravé komory výtokové v chirurgii vrozených i získaných vad a plicní protéza ventil na řízení Ross, je k dispozici ve čtyřech velikostech (vnitřní průměr): Dětské (15-17 mm ) děti (18-21 mm), střední (22 - 24 mm) a dospělých (25 až 28 mm).

Pokrok ve vývoji ventilů na základě tkáňového inženýrství bude záviset na úspěchu ventilu buněčné biologie (včetně problematiky genové exprese a regulace), na studium embryogenní a stáří ventilů (včetně angiogenních a neurogenních faktorů), přesné znalosti biomechaniky každý ventil, jaké dostačující pro usazování buněk vývoj optimálních matric. Pro další vývoj pokročilejších tkání ventily, úplné pochopení vztahu mezi mechanických a strukturálních vlastností nativního ventilu a pobídek (biologické nebo mechanické), aby znovu tyto vlastnosti in vitro.

[13], [14], [15], [16]