Příčiny tuberkulózy

Čeleď Mycobacteriaceae z řádu Actinomycetales obsahuje jediný rod Mycobacterium. V roce 1975 tento rod obsahoval asi 30 druhů a do roku 2000 se tento počet již blížil 100. Většina druhů mykobakterií je klasifikována jako saprofytické mikroorganismy, rozšířené v životním prostředí.

Skupina obligátních parazitů je nevýznamná, ale její praktický význam je velký a je určen druhy, které způsobují tuberkulózu u lidí a zvířat. Existuje názor, že předchůdci mykobakterií patogenních pro člověka byly starověké půdní mykobakterie.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Taxonomie mykobakterií

Všechny mykobakterie se dělí na patogenní pro člověka a oportunní.

V klinické mikrobiologii se ke klasifikaci mykobakterií používá několik přístupů:

• rychlostí a optimální teplotou růstu, schopností tvořit pigment;
• pro klinicky významné komplexy.

Druhy mykobakterií, které způsobují tuberkulózu, jsou sloučeny do komplexu M. tuberculosis, který zahrnuje M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii. Nedávno k němu byly přidány M. pinnipedii a M. sarrae, které jsou fylogeneticky příbuzné s M. microti a M. bovis.

Zbývající mykobakterie způsobující různé mykobakteriózy jsou klasifikovány jako netuberkulózní mykobakterie. Z této skupiny se rozlišují následující komplexy: M. avium, zahrnující M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M. fortuitum včetně poddruhů M.fortuitum a M. chelonae a M. terrae, včetně M. terrae, M. triviale a M. nonchromogenicum. Nejdůležitějšími skupinami jsou patogen lepry M. leprae a patogen ulcerózních lézí Buruli M. ulcerans.

Tato klasifikace sjednocuje druhy mykobakterií se stejným klinickým významem, kdy jejich jemnější diferenciace není nezbytná. K identifikaci druhů v rámci skupin a komplexů se používají biologické, biochemické a molekulární metody.

Klasifikace netuberkulózních mykobakterií založená na kulturních rozdílech byla vyvinuta Runyonem v roce 1959. Podle ní se rozlišují 4 skupiny mykobakterií.

Skupina I - fotochromogenní mykobakterie

Do této skupiny patří mykobakterie, které nejsou pigmentované při růstu ve tmě, ale po vystavení světlu získávají jasně žlutou nebo žlutooranžovou pigmentaci. Potenciálně patogenními kmeny patřícími do této skupiny jsou M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Mezi mykobakteriemi této skupiny se vyskytují jak rychle rostoucí (M. marinum), tak pomalu rostoucí (M. asiaticum, M. kansasii). Optimální teplota růstu se pohybuje od 25 ^° C pro M. simiae, 32–33 ^° C pro M. marinum do 37 ^° C pro M. asiaticum.

Klinicky nejvýznamnějším druhem v naší zemi je M. kansasii, který se vyskytuje ve vodních plochách. Kmen M. kansasii (M. luciflavum) způsobuje onemocnění u lidí. Roste ve vaječném médiu jako drsné nebo hladké kolonie s teplotním optimem 37 ^° C. Morfologicky jsou bakterie střední délky. Dosud byly popsány dvě varianty M. kansasii: oranžová a bílá. Po zavlečení do morčat způsobuje M. kansasii infiltráty a zhutnění regionálních lymfatických uzlin.

Skupina II - skotochromogenní mykobakterie (z řeckého slova scotos - tma)

Do této skupiny patří mykobakterie, které tvoří pigment ve tmě. Rychlost růstu je 30–60 dní. Do této skupiny patří M. aquae (M. gordonae) a M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum je považován za potenciálně patogenní druh. Na vaječném médiu rostou bakterie tohoto druhu jako hladké nebo drsné kolonie oranžové barvy. Morfologicky jsou mykobakterie tyčinkovité, krátké nebo dlouhé. Rostou při teplotě 25-37 ^° C. U dětí způsobují poškození lymfatických uzlin a plic.

M. aquae (M. gordonae) jsou klasifikovány jako saprofytické skotochromogenní mykobakterie. Rostou ve vaječném médiu jako oranžové kolonie při teplotě 25–37 °C. Morfologicky jsou mykobakterie tyčinkovité a středně dlouhé (>5 μm). Vyskytují se ve vodních plochách.

Skupina III - nefotochromogenní mykobakterie

Do této skupiny patří mykobakterie, které netvoří pigment nebo mají světle žlutou barvu, která se na světle nezesiluje. Rostou 2–3 nebo 5–6 týdnů. Patří mezi ně: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (ptačí mykobakterie) rostou na Lowenstein-Jensenově médiu jako pigmentované nebo slabě pigmentované kolonie při teplotě 37 ^° C a 45 ^° C. Morfologicky se jedná o tyčinky střední délky. Mohou být patogenní pro člověka a řadu laboratorních a domácích zvířat (např. prasata). Vyskytují se ve vodě a půdě.

M. xenopi je izolován z ropuchy. Mladé kultury rostou jako nepigmentované kolonie. Později se objevuje žlutý pigment. Morfologicky se jedná o dlouhé vláknité tyčinky. Rostou při teplotě 40-45 ^° C. Jsou podmíněně patogenní pro člověka.

M. terrae byly poprvé izolovány z ředkvičky. Rostou na Lowenstein-Jensenově médiu a jako kolonie bez pigmentu. Optimální teplota růstu je 37 ^° C. Morfologicky jsou reprezentovány tyčinkami střední délky, saprofyty.

Skupina IV - rychle rostoucí mykobakterie

Mykobakterie patřící do této skupiny se vyznačují rychlým růstem (až 7-10 dní). Rostou ve formě pigmentovaných nebo nepigmentovaných kolonií, častěji ve formě R-formy. Dobrý růst je patrný po dobu 2-5 dnů při teplotě 25 ^° C. Do této skupiny patří potenciálně patogenní mykobakterie M.fortuitum, stejně jako saprofytické mykobakterie, jako jsou M. phlei, M. smegmatis atd. M.fortuitum vykazuje na vaječném médiu viditelný růst 2.-4. den ve formě "růžice". Morfologicky jsou mykobakterie reprezentovány krátkými tyčinkami. Na Lowenstein-Jensenově médiu mohou absorbovat malachitovou zeleň a zezelenat. Jsou v přírodě rozšířené.

Runyonova klasifikace se ukázala jako velmi vhodná pro identifikaci nejběžnějších typů mykobakterií. Objev nových druhů a vznik rostoucího počtu přechodných forem mykobakterií však způsobuje potíže s jejich zařazením do té či oné Runyonovy skupiny.

M. tuberculosis je mladý evoluční útvar. V poslední době se objevila tendence dělit M. tuberculosis do shluků nebo čeledí. Nejdůležitějšími kmeny jsou ty, které patří do čeledi Beijing, a které se vyznačují klonálním chováním a schopností způsobovat mikroohniska tuberkulózy.

Morfologie mykobakterií

Mykobakterie jsou tenké tyčinkovité buňky s charakteristickou vlastností kyselino- a alkoholostálosti (v jednom z růstových stádií), aerobní. Při barvení podle Grama jsou slabě grampozitivní. Mykobakterie jsou nepohyblivé, netvoří spory. Konidie ani kapsle chybí. Na hustých živných médiích rostou pomalu nebo velmi pomalu: při optimální teplotě se viditelné kolonie objevují po 2–60 dnech. Kolonie jsou růžové, oranžové nebo žluté, zejména při růstu na světle. Pigment nedifunduje. Povrch kolonií je obvykle matný (typ S) nebo drsný (typ R). Mykobakterie často rostou ve formě slizovitých nebo vrásčitých kolonií. Na tekutých médiích rostou mykobakterie na povrchu. Jemný suchý film časem houstne, stává se hrbolatým a vrásčitým a získává nažloutlý odstín. Bujón zůstává průhledný a v přítomnosti detergentů lze dosáhnout difúzního růstu. V mikrokoloniích M. tuberculosis (tj. v raných stádiích) se tvoří struktury připomínající provazce – rys, který je spojen s provazcovým faktorem.

Po obarvení karbolfuchsinem se mykobakterie tuberkulózy jeví jako tenké, mírně zakřivené tyčinky malinovočervené barvy, obsahující různý počet granulí.

Délka mykobakterií je přibližně 1–10 µm a šířka 0,2–0,7 µm. Někdy se vyskytují i zakřivené nebo zkroucené varianty. Mikroorganismy umístěné jednotlivě, ve dvojicích nebo ve skupinách dobře vynikají na modrém pozadí ostatních složek přípravku. Bakteriální buňky mohou být často uspořádány do tvaru římské číslice „V“.

Preparát může také odhalit změněné kokoidní kyselinovzdorné formy patogenu, zaoblené kulovité nebo myceliu podobné struktury. V tomto případě je nutné pozitivní odpověď potvrdit dalšími metodami.

Struktura buněčné stěny mykobakterií

Buněčná stěna mykobakterií je ve srovnání s jinými prokaryoty nejsložitější.

Zatímco gramnegativní bakterie mají dvě membrány, buněčná stěna mykobakterií se skládá z několika vrstev, z nichž některé obsahují cukry a vyznačují se relativně konstantním složením. Vnější vrstvy mají proměnlivé chemické složení a jsou reprezentovány převážně lipidy, z nichž většinu tvoří mykolové kyseliny a jejich deriváty. Tyto vrstvy zpravidla nejsou pod elektronovou mikroskopií viditelné. Primární kostrou buněčné stěny jsou zesítěné peptidové glykany – elektronově hustá vrstva. Vrstva arabinogalaktanu opakuje vrstvu peptidových glykanů a tvoří polysacharidové stroma buněčné stěny. Má body spojení s vrstvou peptidových glykanů a struktury pro připojení mykolových kyselin a jejich derivátů.

Mykolové kyseliny jsou přítomny ve formě volných sulfolipidů a kordového faktoru, jejichž přítomnost na povrchu buněk je spojena s charakteristickou tvorbou kolonií M. tuberculosis ve formě bičíků. Jedinečnost a klíčová role mykolových kyselin ve strukturální organizaci a fyziologii mykobakterií z nich činí vynikající cíl pro etiotropní terapii.

Glykolipidová vrstva se nazývá „mykosidy“ a někdy se přirovnává k mikrokapsli. Mykosidy jsou strukturně a funkčně podobné lipopolysacharidům vnější membrány gramnegativních bakterií, ale postrádají jejich agresivitu; nicméně jsou toxické a (stejně jako kordový faktor a sulfolipidy) způsobují tvorbu granulomů.

Buněčná membrána a vrstvy buněčné stěny jsou prostoupeny kanálky neboli póry, mezi nimiž můžeme rozlišit pasivní póry s krátkou životností, zajišťující řízenou difuzi látek, a kanálky s delší životností, zajišťující energeticky závislý transport látek.

Další složkou buněčné stěny mykobakterií je lipoarabinoman. Je ukotven v plazmatické membráně, proniká buněčnou stěnou a vystupuje na její povrch. V tomto ohledu je podobný lipoteichoovým kyselinám grampozitivních bakterií nebo lipopolysacharidovému O-antigenu gramnegativních bakterií. Terminální fragmenty lipoarabinomananu, primárně jeho manózové radikály, nespecificky potlačují aktivaci T-lymfocytů a leukocytů v periferní krvi. To vede k narušení imunitní odpovědi na mykobakterie.

Variabilita a formy existence mykobakterií

Perzistence bakterií má zvláštní patogenetický význam. Laboratorní experimenty provedené in vitro a in vivo ukázaly, že baktericidní léky isoniazid a pyrazinamid usmrcují mykobakterie pouze ve fázi reprodukce. Pokud se mykobakterie nacházejí ve fázi nízké metabolické aktivity (tj. růst bakterií je téměř zcela pozastaven a bakterie lze nazvat „dormantními“), baktericidní léky na ně nepůsobí. Tento stav se obvykle nazývá dormantní a mikroorganismy se nazývají perzistující. Perzistující bakterie nejsou citlivé na chemoterapeutika, tj. chovají se jako rezistentní mikroorganismy. Ve skutečnosti si mohou zachovat citlivost na léky.

Silným stimulem pro přechod mykobakteriálních buněk do dormantního stavu jsou chemoterapeutické léky, stejně jako faktory imunitního systému hostitele. Perzistující bakterie jsou schopny v lézích přetrvávat měsíce nebo i roky. Během perzistence se mykobakterie mohou transformovat do L-forem. V této formě vykazují mykobakterie extrémně nízkou metabolickou aktivitu, zaměřenou především na zvětšení tloušťky buněčné stěny a extracelulární matrix, což brání jednoduché difúzi látek. Mykobakterie navíc akumulují genetický materiál, což zvyšuje pravděpodobnost obnovení normálně fungující buňky, když nastanou příznivé podmínky. Detekce L-forem standardními mikrobiologickými metodami je obtížná.

Pokud dormantní mykobakterie během chemoterapie znovu aktivují metabolickou aktivitu a začnou se množit, rychle hynou. Pokud je chemoterapie dokončena, takto „oživené“ mykobakterie se dále množí a způsobují recidivu onemocnění. To vysvětluje opodstatnění dlouhých cyklů chemoterapie a použití následných krátkých profylaktických, obvykle sezónních, cyklů chemoprofylaxe.

Fyziologie mykobakterií

V říši prokaryot jsou mykobakterie nesporným lídrem v oblasti syntézy komplexních organických sloučenin. Pravděpodobně mají nejflexibilnější metabolismus, který poskytuje nezbytnou variabilitu pro přežití jak ve vnějším prostředí, tak v makroorganismu. Dosud bylo popsáno více než 100 enzymatických reakcí, které ukazují na rozvětvenou a komplexní povahu metabolismu mykobakterií. Pro syntézu konečných sloučenin nebo zajištění nezbytných fyziologických funkcí u mykobakterií mohou probíhat paralelní metabolické dráhy v závislosti na dostupnosti substrátu, chemickém prostředí, zajištění dýchacích cyklů potřebnými složkami (kovové ionty, parciální tlak kyslíku, oxidu uhličitého atd.).

Biochemické vlastnosti mykobakterií

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Metabolismus lipidů

Lipidy buněčné stěny, které tvoří až 60 % suché hmotnosti buňky, určují nestandardní tinkturální, fyziologické a ekologické vlastnosti mykobakterií.

Specifické lipidy mykobakterií popsané dosud jsou rozděleny do 7 hlavních skupin podle strukturních znaků:

1. deriváty mastných kyselin sacharidů (zejména trehalóza - kordový faktor):
2. fosfatidylmyoinositolmannosidy:
3. deriváty mastných kyselin peptidů;
4. N-acylpeptidové glykosidy - mykosidy C;
5. estery mastných kyselin s fthioceroly;
6. mykosidy A, B. G;
7. glycerolové mykoláty.

Lipidy skupin 4-6 se nacházejí pouze v mykobakteriích.

Mezi unikátními stojí za zmínku kyseliny tuberkulostearové a tuberkulopalmitové, které jsou prekurzory mykolových kyselin.

Mykolové kyseliny jsou skupinou vysokomolekulárních mastných kyselin s délkou řetězce až 84 atomů uhlíku, jejichž struktura hlavního řetězce je určena systematickou polohou mikroorganismu a podmínkami jeho růstu. Jejich nízká reaktivita zajišťuje vysokou chemickou odolnost buněčné stěny mykobakterií. Mykoláty potlačují enzymatické štěpení buněčné stěny a reakce volných radikálů.

Šňůrový faktor je klasifikován jako lipidová skupina 1. Je spojován s vysokou toxicitou mykobakterií a virulencí.

Povrchově aktivní lipidy neboli sulfolipidy hrají důležitou roli v intracelulární adaptaci mykobakterií. Spolu s kordovým faktorem tvoří cytotoxické membranotropní komplexy.

Lipoarabinomannan je heterogenní směs vysokomolekulárních lipopolysacharidů: rozvětvených polymerů arabinózy a manózy s diacylglycerolovými deriváty kyseliny palmitové a tuberkulostearové.

Mykosidy C jsou peptidové glykolipidy, které tvoří vnější membránu mykobakterií. Tyto membrány lze pod elektronovou mikroskopií pozorovat jako průhlednou zónu na okraji buněk. Mykosidy jsou druhově specifické sloučeniny. Antigenní vlastnosti mykobakterií závisí na jejich typu.

Kvantitativní a kvalitativní složení lipidových sloučenin mykobakterií je dynamické a závisí na stáří buněk, složení živného média a fyzikálně-chemických vlastnostech prostředí. Mladé mykobakteriální buňky začínají tvořit buněčnou stěnu syntézou lipopolysacharidů s relativně krátkými alifatickými řetězci. V této fázi jsou poměrně zranitelné a přístupné imunitnímu systému. S růstem buněčné stěny a tvorbou vysokomolekulárních lipidů získávají mykobakterie rezistenci a lhostejnost ve svých interakcích s imunitním systémem.

Metabolismus sacharidů

Nejoblíbenějším zdrojem uhlíku pro mykobakterie je glycerol.

Nejdůležitějšími sacharidy jsou arabinóza, manóza a maltóza, které tvoří více než polovinu všech sacharidů. Kromě toho hrají v životně důležité činnosti buňky roli trehalóza, glukóza, fruktóza, galaktóza, rhamnóza a některé další sacharidy. V tomto případě probíhá syntéza podél hydrolázové a aldolázové dráhy. Pyruvátová dráha se používá k syntéze glykogenu. Arabinóza a manóza se podílejí na tvorbě důležitých strukturních sloučenin. Pentózofosfátová dráha oxidace glukózy se používá k získání energie. Zajišťují ji enzymy malát, isocitrát a sukcinátdehydrogenázy, což dodává dýchacímu systému flexibilitu.

Glyoxylátová dráha, kterou mykobakterie používají k začlenění volných mastných kyselin hromadících se během růstu mykobakterií do cyklu trikarboxylových kyselin, je unikátní. Tento cyklus přitáhl pozornost výzkumníků jako možný mechanismus chemotaxe mykobakterií během perzistence.

Metabolismus dusíku a aminokyselin

Rychlost využití dusičnanů, dusitanů a hydroxylaminů mykobakteriemi lze použít k identifikaci druhů. Mykobakterie preferují asparagin jako zdroj dusíku. Syntéza aminokyselin je energeticky závislý proces a je zajištěna skupinou enzymů, které umožňují využití jiných aminokyselinových sloučenin, jako je glutamát.

Aktivita nitritové a nitrátové reduktázy

Mycobacterium tuberculosis může tvořit adenosintrifosfát (ATP) přenosem elektronů podél řetězce nosičů končících na NO3 namísto O2 _. Tyto reakce redukují _NO3 na NH3 _v množství, které je nezbytné pro syntézu aminokyselin, purinových a pyrimidinových bází. Toho se dosahuje postupným působením nitrátových a nitritových reduktáz.

Aktivita katalázy a peroxidázy

Kataláza zabraňuje hromadění peroxidu vodíku, který vzniká při aerobní oxidaci redukovaných flavoproteinů. Aktivita enzymu závisí na pH média a teplotě. Při teplotě 56 °C kataláza není aktivní. Existují testy pro zařazení do patogenního komplexu mykobakterií, založené na termolabilitě katalázy.

Je známo, že 70 % kmenů Mycobacterium tuberculosis rezistentních na isoniazid ztrácí svou katalázovou a peroxidázovou aktivitu.

Peroxidázová a katalázová aktivita je prováděna stejným enzymovým komplexem.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Vitamíny a koenzymy

M. tuberculosis obsahuje vitamíny skupiny B (riboflavin, pyridoxin, kyanokobalamin, thiamin), vitamíny C a K, kyselinu para-aminobenzoovou, kyselinu pantothenovou a nikotinovou, biotin a kyselinu listovou.

Metabolismus, výživa a dýchání mykobakterií

Za normálních, příznivých podmínek jsou mykobakterie tuberculosis striktní aerobní a mezofilní bakterie, tj. rostou v přítomnosti kyslíku a v teplotním rozmezí 30-42 ^o C, nejlépe při 37 ^o C. Za nepříznivých vnějších podmínek a/nebo nedostatku kyslíku se mykobakterie tuberculosis projevují jako mikroaerofilní bakterie a dokonce i jako anaerobi. V tomto případě dochází k významným změnám jejich metabolismu.

_{Co se týče spotřeby kyslíku a vývoje oxidázových systémů, mykobakterie jsou podobné pravým houbám. Vitamin K9} slouží jako spojka mezi NADH dehydrogenázou a cytochromem b v přenosovém systému rodu Mycobacterium. Tento cytochromový systém se podobá mitochondriálnímu. Je citlivý na dinitrofenol, stejně jako u vyšších organismů.

Popsaný typ dýchání není jediným zdrojem tvorby ATP. Kromě O2 terminálního mohou mykobakterie používat dýchací řetězce, které přenášejí elektrony a končí dusičnany (NO3- ₎^. Rezervou dýchacího systému mykobakterií je glyoxylátový cyklus.

Anoxické (endogenní) dýchání, které probíhá v atmosféře s koncentrací kyslíku menší než 1 %, je stimulováno azidovými sloučeninami, které snižují oxidaci pyruvátu nebo trehalózy.

Růst a reprodukce mykobakterií

Mycobacterium tuberculosis se množí extrémně pomalu: doba zdvojnásobení je 18–24 hodin (normální bakterie se dělí každých 15 minut). Proto je k dosažení viditelného růstu typických kolonií zapotřebí alespoň 4–6 týdnů. Za jeden z důvodů pomalé reprodukce mykobakterií se považuje jejich výrazná hydrofobicita, která komplikuje difuzi živin. Je pravděpodobnější, že je to geneticky podmíněno a souvisí to se složitější strukturou mykobakterií. Je například známo, že většina bakterií má více kopií operonu ribozomální ribonukleové kyseliny (rRNA). Pomalu rostoucí mykobakterie (M. tuberculosis, M. leprae) mají jednu kopii operonu a rychle rostoucí (M. smegmatis) pouze dvě kopie.

Při kultivaci v tekutém médiu rostou mykobakterie na povrchu. Jemný suchý film časem houstne, stává se hrbolatým a zvrásněným a získává nažloutlý odstín, často přirovnávaný k barvě slonové kosti. Bujón zůstává průhledný a difúzního růstu lze dosáhnout pouze za přítomnosti detergentů, jako je Tween-80. V mikrokoloniích (tj. v raných stádiích) se tvoří struktury připomínající svazky – rys spojený s kordovým faktorem M. tuberculosis.

Genetika mykobakterií

Rod Mycobacterium je geneticky velmi rozmanitý. Na rozdíl od mnoha saprofytických a netuberkulózních mykobakterií Mycobacterium tuberculosis neobsahuje extrachromozomální inkluze (např. plasmidy). Veškerá rozmanitost vlastností Mycobacterium tuberculosis je určena jeho chromozomem.

Genom komplexu M. tuberculosis je extrémně konzervativní. Jeho zástupci mají homologii DNA na úrovni 85-100 %, zatímco DNA jiných druhů mykobakterií je homologní s M. tuberculosis pouze z 4-26 %.

Zástupci rodu Mycobacteria mají ve srovnání s jinými prokaryoty velké genomy – 3,1–4,5x10⁻ ^Da. Genomy patogenních druhů jsou však menší než u jiných mykobakterií (u M. tuberculosis – 2,5x10⁻ ^Da ). Klasický původce lidské tuberkulózy, M. tuberculosis, má více genů než M. africanum a M. bovis, které během evoluce ztratily část svého genetického materiálu.

V roce 1998 byla publikována nukleotidová sekvence chromozomu kmene H37Rv M. tuberculosis. Její délka je 4 411 529 párů bází. Chromozom mykobakterie tuberkulózy má kruhovou strukturu. Obsahuje přibližně 4 000 genů kódujících proteiny a také 60 kódujících funkční složky RNA: unikátní ribozomální RNA operon, 10Sa RNA, účastnící se degradace proteinů s atypickou matrixovou RNA, 45 transportních RNA (tRNA) a více než 90 lipoproteinů.

Více než 20 % genomu zabírají geny metabolismu mastných kyselin buněčné stěny, včetně mykolových kyselin, kyselých polypeptidů bohatých na glycin (rodiny PE a PPE), kódovaných polymorfními oblastmi genomu PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) a MPTR (Major polymorphic tandem repeat) (pátý a čtvrtý kruh genomové chromozomální mapy). Variabilita těchto genomových oblastí zajišťuje rozdíly v antigenech a schopnost inhibovat imunitní odpověď. Genom Mycobacterium tuberculosis široce obsahuje geny, které řídí faktory virulence.

Mycobacterium tuberculosis syntetizuje všechny složky nezbytné pro metabolismus: esenciální aminokyseliny, vitamíny, enzymy a kofaktory. Ve srovnání s jinými typy bakterií má M. tuberculosis zvýšenou aktivitu lipogenetických enzymů. Dva geny kódují proteiny podobné hemoglobinu, které fungují jako antioxidační ochranné látky nebo lapáky přebytečného buněčného kyslíku. Tyto vlastnosti usnadňují rychlou adaptaci Mycobacterium tuberculosis na náhlé změny podmínek prostředí.

Charakteristickým rysem genomu komplexu M. tuberculosis je velký počet opakujících se sekvencí DNA. Chromozom M. tuberculosis H37Rv tedy obsahuje až 56 kopií IS elementů (inzerčních sekvencí), které zajišťují polymorfismus DNA Mycobacterium tuberculosis. Většina z nich, s výjimkou elementu IS6110, je nezměněna. Chromozomy různých kmenů Mycobacterium tuberculosis obvykle obsahují 5 až 20 kopií IS6110, ale existují kmeny, které tento element nemají. Spolu s IS elementy genom obsahuje několik typů krátkých nukleotidových repetic (PGRS a MPTR), stejně jako přímé repetic DR (Direct Repeat), umístěné v oblasti DR a oddělené variabilními sekvencemi - spacery (šestý kruh na mapě chromozomů). Rozdíly v počtu kopií a lokalizaci těchto genetických elementů na chromozomu se používají k rozlišení kmenů Mycobacterium tuberculosis v molekulární epidemiologii. Nejpokročilejší schémata pro genotypizaci mykobakterií jsou založena na detekci genomového polymorfismu způsobeného elementem IS6110, stejně jako DR a jejich spacery. Je charakteristické, že k divergenci druhů M. tuberculosis dochází zpravidla v důsledku rekombinací mezi kopiemi elementu IS6110, které ohraničují různé geny.

V genomu H37Rv byly nalezeny dva profágy, phiRv1 a phiRv2. Stejně jako polymorfní místo Dral jsou pravděpodobně spojeny s faktory patogenity, protože tyto oblasti genomu se liší od podobných oblastí avirulentních kmenů M. tuberculosis H37Ra a M. bom BCG. Byly identifikovány oblasti genomu (mutT, ogt-geny) zodpovědné za zvýšení rychlosti mutací a adaptaci mykobakterií tuberculosis za podmínek press. Objev spouštěcích genů pro dormanci mykobakterií tuberculosis změnil koncept latentní tuberkulózní infekce.

Studium polymorfismu genů kódujících katalázu, peroxidázu a A-podjednotku DNA gyrázy. V komplexu M. tuberculosis byly identifikovány tři genotypové skupiny. Nejstarší (z hlediska evoluce) je skupina I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis a M. microti. Skupiny II a III zahrnují různé kmeny M. tuberculosis, které se rozšířily v některých geografických oblastech. Klonální chování je charakteristické pro skupiny I a II a kmeny skupiny III extrémně zřídka způsobují masová onemocnění. Genetické rodiny M. tuberculosis, které dostaly názvy Haarlem, Africa, Filipino, jsou rozšířené v různých regionech světa.

Zvláštní místo zaujímá čeleď Beijing, poprvé identifikovaná v histologických preparátech plicní tkáně pacientů na předměstí Pekingu v letech 1956-1990. Dosud byly kmeny této čeledi nalezeny v asijských zemích, Jižní Africe, Karibiku a Spojených státech. Šíření tohoto genotypu na různých územích je určeno etnickými charakteristikami domorodého obyvatelstva a migrantů. V poslední době byly získány údaje o šíření kmenů genotypu SI/Beijing na severozápadě evropské části Ruska (Petrohrad) a v oblastech Sibiře.

Mykobakteriální rezistence

Během evoluce si mykobakterie tuberkulózy vyvinuly různé mechanismy k překonání nebo inaktivaci nepříznivých faktorů prostředí. Zaprvé, jedná se o silnou buněčnou stěnu. Zadruhé, jedná se o rozsáhlé metabolické schopnosti. Jsou schopny inaktivovat mnoho buněčných toxinů a látek (různé peroxidy, aldehydy a další), které ničí buněčnou membránu. Zatřetí, jedná se o morfologickou plasticita, která spočívá v transformaci mykobakterií (tvorba L-forem dormantních buněk). Co se týče jejich stability, zaujímají po sporotvorných bakteriích přední místo v říši prokaryot.

Patogen zůstává životaschopný v suchém stavu až 3 roky. Při zahřátí mohou mykobakterie tuberkulózy odolat teplotám výrazně vyšším než 80 °C. Dnes se předpokládá, že mykobakterie tuberkulózy nalezené ve sputu zůstávají životaschopné, pokud se sputum otevřeně vaří po dobu 5 minut.

Mycobacterium tuberculosis je rezistentní vůči organickým a anorganickým kyselinám, zásadám, mnoha oxidačním činidlům a také vůči řadě antiseptických a dehydratačních látek, které mají škodlivý účinek na jiné patogenní mikroorganismy. Mycobacterium vykazuje rezistenci vůči účinkům alkoholů a acetonu.

Je třeba poznamenat, že produkty na bázi kvartérních amoniových iontů nevykazují antituberkulózní aktivitu. Za určitých podmínek nemají koncentrace chloru a kyslíkových radikálů až do 0,5 % škodlivý vliv na mykobakterie tuberkulózy. To znamená nemožnost použití těchto produktů ke sterilizaci sputa a dalších infikovaných biologických materiálů.

Mycobacterium tuberculosis je necitlivé na difúzní sluneční záření a může ve vnějším prostředí existovat déle než rok, aniž by ztratilo životaschopnost. Krátkovlnné ultrafialové záření má univerzální baktericidní účinek na všechny mikroorganismy. V reálných podmínkách, když je Mycobacterium tuberculosis suspendováno ve formě buněčných aglomerátů s prachovými částicemi, se však jeho odolnost vůči ultrafialovému záření zvyšuje.

Vysoká míra přežití tuberkulózních mykobakterií přispívá k extrémně širokému šíření této infekce mezi populací bez ohledu na klimatické podmínky. To však není jediný faktor, který přispívá ke globalizaci problému – tuberkulózní mykobakterie mohou v lidském těle přetrvávat po dlouhou dobu a reaktivovat se v neomezených intervalech.

Lokalizace tuberkulózního mykobakteria uvnitř makrofágů zajišťuje dostatečnou stabilitu substrátu s ohledem na „dlouhověkost“ mononukleárních fagocytů a dobu replikace mykobakterií, stejně jako izolaci od efektorů humorální imunity. Zároveň si patogen vybírá biotop, který je pro většinu mikroorganismů nepřijatelný kvůli jeho potenciálnímu nebezpečí. Tuto symbiózu zajišťuje řada adaptivních mechanismů mykobakterií.

Proces poškození makrofágů a parazitismu v nich vypadá takto: pronikání mykobakterií do makrofágu bez jeho aktivace; potlačení tvorby fagolysozomů nebo jejich transformace do zóny pohodlné pro bakterie; průnik z fagozomů do cytoplazmy s inaktivací antimikrobiálních faktorů; narušení životně důležité aktivity buňky; oslabení citlivosti makrofágů na aktivační signály T-lymfocytů; snížení antigen prezentující funkce makrofágů a s tím spojené oslabení reakcí cytotoxických T-lymfocytů nastavených na ničení infikovaných buněk.

Vlastnosti buněčné stěny samozřejmě hrají v tomto ohledu důležitou roli, stejně jako metabolické a funkční schopnosti. Při prvním kontaktu s mykobakteriemi není imunitní systém makroorganismu schopen aktivovat humorální imunitu, rychle neutralizovat a eliminovat buňku z těla, protože mobilní alifatické řetězce mykobakteriální stěny neumožňují posouzení povrchových struktur patogenu a přenášejí relevantní informace pro syntézu potřebné sady protilátek.

Vysoká hydrofobicita mykobakterií zajišťuje nespecifické, tj. na receptoru nezávislé, kontakty s makrofágy. Vytvořením fagozomu kolem buňky mykobakterie ji makrofág umístí do sebe. Povrchové mykosidové a lipoarabinomannanové komplexy mohou být receptory rozpoznány, ale signály spuštěné jimi makrofágy neaktivují nebo aktivují slabě. V důsledku toho fagocytóza není doprovázena uvolňováním volných radikálových forem kyslíku a dusíku. Předpokládá se, že to je charakterističtější pro virulentní kmeny M. tuberculosis, které díky strukturním vlastnostem lipoarabinomananu iniciují „neagresivní“ fagocytózu. Na rozpoznávání M. tuberculosis se podílejí i další makrofágové receptory, zejména CD14 a receptory složky komplementu C3 (CR1-CR3).

Po proniknutí do makrofágu zahrnuje mykobakterie řadu mechanismů, které brání tvorbě fagolysozomu: produkci amoniaku, který alkalizují prostředí uvnitř fagozomu, syntézu sulfolipidů, což vede k tvorbě negativního náboje na povrchu fagozomu, což brání fúzi fagozomu a lysozomu.

Pokud se vytvoří fagolysozom, mykobakterie je díky své silné voskovité skořápce schopna uhasit reakce volných radikálů způsobené baktericidními látkami fagocytů. Amonium alkalizují prostředí, blokují aktivitu lysozomálních enzymů a sulfolipidy neutralizují membranotropní kationtové proteiny. Kromě toho tuberkulózní mykobakterie produkují vysoce aktivní enzymy s katalázovou a peroxidázovou aktivitou, které konkurují peroxidázovým systémům makrofágů a současně inaktivují lysozomální hydroperoxidy. To vše zvyšuje odolnost mykobakterií vůči oxidačnímu stresu.

Další adaptace mykobakterií spočívá ve využití sloučenin obsahujících železo makrofágy pro jejich enzymatické systémy a blokování imunospecifických funkcí makrofágů. Makrofágy jsou jedním z hlavních rezervoárů železa, jehož přebytek se hromadí ve formě feritinu. Obsah železa v alveolárních makrofágech je 100krát vyšší než v krevních monocytech, což jistě přispívá k jejich kolonizaci mykobakteriemi tuberkulózy.

Mykobakterie vyvíjejí toxické účinky na makrofágy prostřednictvím endotoxinů a nespecifických faktorů. Oba faktory primárně postihují dýchací systém makrofágů - mitochondrie. Mezi endotoxiny patří mykolické arabinolipidy, které inhibují mitochondriální dýchání. Mezi nespecifické toxiny patří produkty syntézy lipidové části mykobakteriální buňky - fthien a fthionové kyseliny, které způsobují rozpojení oxidativní fosforylace. Zvýšené metabolické procesy za těchto podmínek nejsou doprovázeny správnou syntézou ATP. Hostitelské buňky začínají pociťovat energetické hladovění, což vede k inhibici jejich životně důležité aktivity a následně k cytolýze a apoptóze.

Je možné, že některé faktory patogenity se tvoří pouze uvnitř infikovaných buněk, jak je tomu u jiných bakterií, které preferují intracelulární způsob života. Například salmonely, parazitující uvnitř makrofágů, navíc exprimují více než 30 genů. Navzdory úplnému popisu genomu mykobakterie tuberkulózy se 30 % kodonů vztahuje k proteinům s neznámými vlastnostmi.

Rezistence mykobakterií na léky

Z klinického hlediska určuje citlivost mikroorganismu na léky, zda lze standardní chemoterapii s indikovaným lékem použít k léčbě onemocnění způsobeného izolovaným kmenem. Rezistence „předpovídá selhání léčby testovaným lékem“. Jinými slovy, použití standardní chemoterapie, která vede k systémové koncentraci léku, jež je za normálních podmínek obvykle účinná, nepotlačuje proliferaci „rezistentních mikroorganismů“.

V mikrobiologii je definice lékové citlivosti nebo lékové rezistence založena na populačním přístupu, který implikuje různé stupně rezistence skupiny (heterogenní sady) mikrobiálních buněk. Léková rezistence se posuzuje kvantitativními charakteristikami, jako je „minimální inhibiční koncentrace“ (MIC). Například při MIC-90 uhyne 90 % mikroorganismů (bakteriostatická koncentrace). Rezistencí by se tedy mělo rozumět její stupeň u části mikrobiální populace, který ve většině případů předurčuje selhání léčby. Obecně se uznává, že 10 % rezistentních kmenů z celé mikrobiální populace pacienta může mít patogenní účinek. Ve ftiziobakteriologii je to u antituberkulózních léků první volby 1 %, neboli 20 jednotek tvořících kolonie - CFU). Taková část mikrobiální populace je schopna během měsíce vytlačit původní a vytvořit lézi. U antituberkulózních léků druhé volby je kritériem rezistence 10% nárůst mikrobiální populace.

Vývoj lékové rezistence u mikroorganismů je spojen se selekcí v přítomnosti antibiotika a s preferenčním přežitím části mikrobiální populace, která má mechanismy ochrany proti antibakteriálnímu činidlu. Každá populace obsahuje malý počet mutantních buněk (obvykle 106 ^-109 ), které jsou rezistentní na konkrétní lék. Během chemoterapie citlivé mikrobiální buňky umírají a rezistentní se množí. V důsledku toho jsou citlivé buňky ^nahrazeny rezistentními.

Mykobakterie mají zpočátku vysokou přirozenou rezistenci vůči mnoha širokospektrým antibakteriálním lékům, ale různé druhy mají různá spektra a stupně této citlivosti.

Pravá přirozená rezistence se chápe jako trvalá druhově specifická vlastnost mikroorganismů spojená s absencí cíle pro působení antibiotika nebo nepřístupností cíle v důsledku zpočátku nízké propustnosti buněčné stěny, enzymatické inaktivace látky nebo jiných mechanismů.

Získaná rezistence je schopnost jednotlivých kmenů zůstat životaschopnými při koncentracích antibiotik, které potlačují růst hlavní části mikrobiální populace. Získání rezistence je ve všech případech geneticky podmíněno: objevením se nové genetické informace nebo změnou úrovně exprese vlastních genů.

V současné době byly objeveny různé molekulární mechanismy rezistence Mycobacterium tuberculosis:

• inaktivace antibiotik (inaktivace enzymů), například β-laktamázami;
• modifikace cíle účinku (změna prostorové konfigurace proteinu v důsledku mutace odpovídající oblasti genomu):
• hyperprodukce cíle, vedoucí ke změně poměru činidla a cíle a uvolnění části proteinů bakterií, které je podporují v životě;
• aktivní odstranění léčiva z mikrobiální buňky (eflux) v důsledku aktivace obranných mechanismů proti stresu:
• změny parametrů propustnosti vnějších struktur mikrobiální buňky, blokující schopnost antibiotika proniknout do buňky;
• zahrnutí „metabolického shuntu“ (obyvak metabolické dráhy).

Kromě přímého vlivu na metabolismus mikrobiálních buněk vede mnoho antibakteriálních léků (benzylpenicilin, streptomycin, rifampicin) a dalších nepříznivých faktorů (biocidy imunitního systému) k výskytu změněných forem mykobakterií (protoplasty, L-formy) a také k převodu buněk do klidového stavu: intenzita buněčného metabolismu se snižuje a bakterie se stává necitlivou na působení antibiotika.

Všechny mechanismy vytvářejí různý stupeň rezistence, což vede k rezistenci na různé koncentrace chemoterapeutických léků, takže vznik rezistence u bakterií není vždy doprovázen snížením klinické účinnosti antibiotika. Pro posouzení účinnosti a prognózy léčby je důležité znát stupeň rezistence.

V současné době byl pro každý lék proti tuberkulóze první volby a pro většinu rezervních léků identifikován alespoň jeden gen. Specifické mutace v tomto genu vedou k vývoji rezistentních variant mykobakterií. Při širokém rozšíření lékové rezistence u mykobakterií je důležitá vysoká míra mutací in vivo, vyšší než in vitro.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Typy lékové rezistence mykobakterií

Rozlišuje se primární a získaná rezistence na léky. Mezi mikroorganismy s primární rezistencí patří kmeny izolované od pacientů, kteří nedostávali specifickou terapii nebo užívali léky po dobu jednoho měsíce nebo kratší. Pokud není možné objasnit skutečnost užívání antituberkulózních léků, používá se termín „počáteční rezistence“.

Primární léková rezistence má velký klinický a epidemiologický význam, proto je pro její správné posouzení nutné nepodávat chemoterapii nově diagnostikovanému pacientovi s tuberkulózou před mikrobiologickým vyšetřením diagnostického materiálu. Frekvence primární lékové rezistence se vypočítá jako poměr počtu nově diagnostikovaných pacientů s primární rezistencí k počtu všech nově diagnostikovaných pacientů, u kterých byla v průběhu roku testována citlivost na léky. Pokud je u pacienta během antituberkulózní terapie podávané po dobu jednoho měsíce nebo déle izolován rezistentní kmen, rezistence se považuje za získanou. Frekvence primární lékové rezistence charakterizuje epidemiologický stav populace patogenů tuberkulózy.

Získaná léková rezistence u nově diagnostikovaných pacientů je důsledkem neúspěšné léčby (nesprávný výběr léků, nedodržování léčebného režimu, snížení dávkování léků, nekonzistentní dodávky a nízká kvalita léků). Tyto faktory vedou ke snížení systémové koncentrace léků v krvi a jejich účinnosti a zároveň „spouštějí“ obranné mechanismy v mykobakteriálních buňkách.

Pro epidemiologické účely se vypočítává četnost dříve léčených případů. Za tímto účelem se berou v úvahu pacienti registrovaní k opakované léčbě po neúspěšné chemoterapii nebo relapsech. Vypočítává se poměr počtu rezistentních kultur Mycobacterium tuberculosis k počtu všech kmenů testovaných na rezistenci k lékům v průběhu roku u pacientů této skupiny v době jejich registrace.

Ve struktuře lékové rezistence Mycobacterium tuberculosis se rozlišují:

Monorezistence - rezistence na jeden z antituberkulózních léků, citlivost na ostatní léky je zachována. Při použití komplexní terapie je monorezistence detekována poměrně zřídka a zpravidla na streptomycin (v 10-15 % případů u nově diagnostikovaných pacientů).

Polyrezistence je rezistence na dva nebo více léků.

Mnohočetná léková rezistence je rezistence na isoniazid a rifampicin současně (bez ohledu na přítomnost rezistence na jiné léky). Obvykle je doprovázena rezistencí na streptomycin atd. V současné době se MDR tuberkulózních patogenů stala epidemiologicky nebezpečným jevem. Výpočty ukazují, že detekce patogenů s MDR u více než 6,6 % případů (u nově diagnostikovaných pacientů) vyžaduje změnu strategie Národního protituberkulózního programu. Podle údajů z monitorování lékové rezistence se frekvence MDR u nově diagnostikovaných pacientů pohybuje od 4 do 15 %, u relapsů - 45-55 % a u případů neúspěšné léčby - až 80 %.

Superrezistence je mnohočetná léková rezistence kombinovaná s rezistencí na fluorochinolony a jeden z injekčních léků (kanamycin, amikacin, kapreomycin). Tuberkulóza způsobená kmeny se superrezistencí představuje přímou hrozbu pro životy pacientů, protože jiné antituberkulózní léky druhé volby nemají výrazný antibakteriální účinek. Od roku 2006 některé země organizují dohled nad šířením kmenů mykobakterií se superrezistencí. V zahraničí je tato varianta MDR obvykle označována jako XDR.

Zkřížená rezistence nastává, když rezistence na jeden lék vede k rezistenci na jiné léky. U M. tuberculosis obvykle mutace spojené s rezistencí nesouvisejí. Vznik zkřížené rezistence je způsoben podobností chemické struktury některých antituberkulózních léků. Zkřížená rezistence je obzvláště často detekována v rámci jedné skupiny léků, jako jsou aminoglykosidy. Pro predikci zkřížené rezistence jsou nezbytné genetické studie mykobakteriálních kultur v kombinaci s mikrobiologickými studiemi rezistence.

Netuberkulózní mykobakterie

Netuberkulózní mykobakterie se přenášejí z člověka na člověka extrémně vzácně. Četnost izolace některých jejich druhů z materiálu od pacientů je srovnatelná s četností izolace těchto druhů z objektů životního prostředí. Zdroji infekce mohou být hospodářská zvířata a ptáci, nezpracované produkty. Mykobakterie se nacházejí v porážkovém materiálu a mléce skotu.

Podle bakteriologických laboratoří byla prevalence netuberkulózních mykobakterií v letech 2004-2005 u nově diagnostikovaných pacientů 0,5-6,2 % mezi všemi mykobakteriemi. Četnost může být pravděpodobně poněkud vyšší, protože metoda použitá ke zpracování diagnostického materiálu není pro netuberkulózní mykobakterie optimální. Saprofytické mykobakterie mohou být v diagnostickém materiálu přítomny, pokud nejsou dodržována pravidla odběru nebo kvůli vlastnostem materiálu (například M. smegmatis lze izolovat z moči mužských pacientů).

V tomto ohledu je důležité opakovaně potvrdit zjištěný typ mykobakterií z materiálu pacienta.

Mykobakterie postihují kůži, měkké tkáně a mohou také způsobovat mykobakteriózu plic, která je zvláště častá u stavů imunodeficience. Při plicní lokalizaci je častěji detekována u starších mužů s anamnézou chronických plicních onemocnění, včetně plísňových lézí.

Ze všech mykobakterií je komplex M. avium-intracellulare nejčastějším původcem plicní mykobakteriózy u lidí. Způsobuje onemocnění plic, periferních lymfatických uzlin a diseminovaných procesů. Na severu evropského regionu se vyskytuje asi 60 % plicních mykobakterióz. Převládají fibrokavernózní a infiltrativní procesy, které mají chronický průběh v důsledku vysoké rezistence na antituberkulózní léky.

M. kansasii jsou původci chronických plicních onemocnění připomínajících tuberkulózu. Chemoterapie je účinnější díky vyšší citlivosti M. kansasii na antibakteriální léky. M. xenopi a M. malmoense způsobují hlavně chronická plicní onemocnění. Mohou kontaminovat systémy zásobování teplou a studenou vodou. Prostředí výskytu M. malmoens není plně objasněno. M. xenopi vykazuje poměrně dobrou citlivost na antituberkulózní terapii. M. malmoense vykazuje poměrně vysokou citlivost na antibiotika in vitro, ale konzervativní léčba je často neúčinná a dokonce fatální. M. fortuitum a M. chelonae jsou uznáváni jako původci onemocnění kostí a měkkých tkání v důsledku přímé kontaminace rány během traumatu, chirurgického zákroku a penetrujícího poranění. Způsobují až 10 % plicních mykobakterióz. Vyskytuje se jako chronická destruktivní bilaterální léze, často fatální. Antituberkulózní léky a širokospektrální antibiotika nejsou proti těmto typům mykobakterií účinné nebo mají malou účinnost.

V jižních oblastech jsou rozšířené mykobakteriózy kůže a měkkých tkání způsobené M. leprae a M. ulceranse. Identifikace netuberkulózních mykobakterií se provádí v laboratořích předních protituberkulózních institucí v zemi. To vyžaduje vysokou kvalifikaci a dobré vybavení laboratoří.