Obnova kloubní chrupavky a růstové faktory v patogenezi osteoartrózy

Díky pokroku v biotechnologiích, zejména v klonovacích technologiích, se v poslední době intenzivně rozšiřuje seznam růstových faktorů, které jako anabolické faktory hrají důležitou, ale ne zcela pochopenou roli v patogenezi osteoartrózy.

První skupinou růstových faktorů, o kterých budeme diskutovat níže, jsou IGF. Ty se nacházejí ve velkém množství v krevním séru a mají řadu společných vlastností s inzulínem. IGF-2 je typičtější pro embryonální stádium vývoje, zatímco IGF-1 je dominantním zástupcem této skupiny u dospělých. Oba zástupci této skupiny působí vazbou na receptory IGF typu I. Zatímco funkce IGF-2 zůstává neznámá, význam IGF-1 byl již stanoven - je schopen stimulovat syntézu proteoglykanů chondrocyty a významně inhibovat katabolické procesy v kloubní chrupavce. IGF-1 je hlavním anabolickým stimulem pro syntézu proteoglykanů chondrocyty, přítomnými v krevním séru a synoviální tekutině. IGF-1 je důležitým faktorem pro kultivaci chondrocytů v experimentálních modelech osteoartrózy in vitro. Předpokládá se, že IGF-1 vstupuje do synoviální tekutiny z krevní plazmy. Kromě toho normální chondrocyty produkují oba faktory - exprese IGF-1 a IGF-2 byla zjištěna v synoviální membráně a chrupavce pacientů s osteoartrózou. V normální chrupavce nemá IGF-1 mitogenní vlastnosti, ale je schopen stimulovat proliferaci buněk v poškozené matrici, což naznačuje účast v reparačních procesech.

Biologicky aktivní látky, které stimulují reparaci a inhibují degradaci kloubní chrupavky

• Inzulín
• Gama interferon
• Somatotropní hormon, androgeny
• Somatomediny (IPF-1 a -2)
• TGF-beta (tkáňový růstový faktor)
• Růstový faktor odvozený z krevních destiček
• Základní fibroblastový růstový faktor
• EFR
• Antagonista receptoru IL-1
• Proteiny vázající TNF-a
• Tkáňové inhibitory metaloproteináz
• a2 makroglobulin
• AI-antitrypsin
• RG-makroglobulin
• Rg-antichymotrypsin

Působení IGF-1 a IGF-2 je řízeno různými proteiny vázajícími IGF (IGF-BP), které jsou také produkovány chondrocyty. IGF-BP může působit jako nosič a také blokovat IGF. Buňky izolované z kloubní chrupavky pacientů s osteoartrózou produkují nadměrné množství IGF-BP, což naznačuje, že blokují účinky IGF. J. Martel-Pelletier a kol. (1998) ukázali, že ačkoli se syntéza IGF-1 v chrupavce při osteoartróze zvyšuje, chondrocyty reagují na stimulaci IGF-1 slabě. Ukázalo se, že tento jev je (alespoň částečně) spojen se zvýšením hladiny IGF-BP. IGF-BP má vysokou afinitu k IGF a je důležitým biomodulátorem jeho aktivity. Dosud bylo studováno sedm typů IGF-BP a dysregulace IGF-BP-3 a IGF-BP-4 hraje důležitou roli v osteoartróze.

Další kategorií růstových faktorů, které vykazují různé účinky na chondrocyty, je růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF), FGF a TGF-beta. Tyto faktory jsou produkovány nejen chondrocyty, ale také aktivovanými synovocyty. FGF má anabolické i katabolické vlastnosti v závislosti na koncentraci a stavu kloubní chrupavky. PDGF se podílí na udržování homeostázy extracelulární hmoty kloubní chrupavky, aniž by měl zjevné mitogenní vlastnosti. Je známo, že tento růstový faktor zvyšuje syntézu proteoglykanů a snižuje jejich degradaci.

TGF-beta je obzvláště zajímavý pro svou roli v patogenezi osteoartrózy. Je členem velké superrodiny TGF a sdílí funkční a signální vlastnosti s nedávno objevenými růstovými faktory BMP (kostní morfogenetický protein).

TGF-beta je pleiotropní faktor: na jedné straně má imunosupresivní vlastnosti, na druhé straně je chemotaktickým faktorem a silným stimulátorem proliferace fibroblastů. Unikátní vlastnosti TGF-beta spočívají ve schopnosti inhibovat uvolňování enzymů z různých buněk a významně zvyšovat produkci inhibitorů enzymů (například TIMP). TGF-beta je považován za důležitý regulátor poškození tkáně v důsledku zánětu. V kloubní chrupavčité tkáni tedy TGF-beta významně stimuluje produkci matrix chondrocyty, zejména po předchozí expozici tomuto faktoru. Normální chrupavka je na TGF-beta necitlivá. U pacientů s osteoartrózou stimuluje TGF-β produkci agrekanu a malých proteoglykanů v kloubní chrupavce.

TGF-beta je produkován mnoha buňkami, zejména chondrocyty. Uvolňuje se v latentní formě vázaný na speciální protein zvaný latentně asociovaný protein (LAP). Disociace z tohoto proteinu se provádí proteázami, které jsou produkovány ve velkém množství v zanícených tkáních. Kromě TGF-beta, který je produkován aktivovanými buňkami, jsou zásoby latentní formy tohoto faktoru důležitým prvkem reaktivity TGF-beta v tkáni po lokálním poranění. TGF-beta je přítomen ve významném množství v synoviální tekutině, synoviální membráně a chrupavce kloubu postiženého osteoartrózou. V oblastech poškozené tkáně se zánětlivými infiltráty je detekována koexprese TNF a IL-1, zatímco v oblastech s fibrózou je detekována pouze exprese TGF-beta.

Inkubace kultivovaných chondrocytů od pacientů s osteoartrózou s TGF-beta způsobuje významné zvýšení syntézy proteoglykanů těmito buňkami. Stimulace normálních chondrocytů pomocí TGF-beta způsobuje zvýšení syntézy proteoglykanů až po mnoha dnech inkubace. Možná je tato doba nezbytná pro změnu buněčného fenotypu pod vlivem TGF-beta (například pro změnu tzv. kompartmentalizace proteoglykanů: nově vytvořené proteoglykany jsou lokalizovány pouze kolem chondrocytů).

Je známo, že aktivace syntézy růstových faktorů, zejména TGF-beta, je důležitým článkem v patogenezi renální a jaterní fibrózy a tvorby jizev během hojení ran. Zvýšená zátěž chondrocytů in vitro vede k hyperprodukci TGF-beta, zatímco snížená syntéza proteoglykanů po imobilizaci končetiny může být pomocí TGF-beta kompenzována. TGF-beta indukuje tvorbu osteofytů v marginální zóně kloubů jako mechanismus adaptace na změny zátěže. IL-1, který způsobuje mírný zánětlivý proces v synovii v reakci na poškození kloubu, podporuje tvorbu chondrocytů se změněným fenotypem, které jich produkují v nadměrném množství.

Opakované lokální injekce rekombinantního TGF-beta ve vysokých koncentracích vedly u myší C57B1 k rozvoji osteoartrózy – tvorbě osteofytů, která je charakteristická pro lidskou osteoartrózu, a k významné ztrátě proteoglykanů v zóně „vlnitého okraje“.

Abychom pochopili, jak nadbytek TGF-beta způsobuje známé změny v chrupavce, je nutné poznamenat, že expozice TGF-β indukuje charakteristický chondrocytový fenotyp se změnou v podtřídě syntetizovaných proteoglykanů a narušením normální integrace prvků ECM. IGF-1 i TGF-beta stimulují syntézu proteoglykanů chondrocyty kultivovanými v alginátu, ale TGF-beta také indukuje tzv. kompartmentalizaci proteoglykanů. Navíc bylo zjištěno, že TGF-beta zvyšuje hladinu kolagenázy-3 (MMP-13) v aktivovaných chondrocytech, což je v rozporu s obecnou představou o TGF-beta jako faktoru, který naopak snižuje uvolňování destruktivních proteáz. Není však známo, zda se syntéza MMP-13 indukovaná TGF-beta podílí na patogenezi osteoartrózy. TGF-beta nejen stimuluje syntézu proteoglykanů, ale také podporuje jejich ukládání ve vazech a šlachách, čímž zvyšuje tuhost a snižuje rozsah pohybu v kloubech.

BMP jsou členy nadrodiny TGF-beta. Některé z nich (BMP-2, BMP-7 a BMP-9) mají vlastnost stimulovat syntézu proteoglykanů chondrocyty. BMP uplatňují své účinky vazbou na specifické receptory na povrchu buněk; signální dráhy TGF-beta a BMP se mírně liší. Stejně jako TGF-beta, i BMP signalizují prostřednictvím komplexu serin/threoninkinázových receptorů typu I a II. V tomto komplexu je receptor typu II transfosforylován a aktivuje receptor typu I, který přenáší signál na signální molekuly zvané Smad. Po přijetí signálu jsou Smad rychle fosforylovány. V současné době je známo, že v signální dráze BMP jsou fosforylovány Smad-1, -5 a -8 a v signální dráze TGF-beta jsou fosforylovány Smad-2 a Smad-3. Poté se pojmenované Smad asociují se Smad-4, který je společný pro signální dráhy všech členů nadrodiny TGF-beta. Tato skutečnost vysvětluje přítomnost zkřížených funkcí u členů superrodiny TGF-beta, stejně jako fenomén vzájemné inhibice signálních drah TGF-beta a BMP kompeticí o společné komponenty. Nedávno byla identifikována další třída proteinů Smad, kterou reprezentují Smad-6 a -7. Tyto molekuly fungují jako regulátory signálních drah TGF-beta a BMP.

Přestože je stimulační účinek CMP na syntézu proteoglykanů znám již dlouhou dobu, zůstává jejich role v regulaci funkce kloubní chrupavky kontroverzní vzhledem ke známé schopnosti CMP způsobovat dediferenciaci buněk, stimulovat kalcifikaci a tvorbu kostní tkáně. M. Enomoto-Iwamoto a kol. (1998) ukázali, že interakce CMP s receptorem CMP typu II je nezbytná pro udržení diferencovaného fenotypu chondrocytů, stejně jako pro kontrolu jejich proliferace a hypertrofie. Podle LZ Sailora a kol. (1996) CMP-2 udržuje fenotyp chondrocytů v kultuře po dobu 4 týdnů, aniž by způsoboval jejich hypertrofii. CMP-7 (identický s osteogenním proteinem-1) udržuje fenotyp zralých chondrocytů kloubní chrupavky kultivovaných v alginátu po dlouhou dobu.

Zavedení KMP-2 a -9 do kolenních kloubů myší zvýšilo syntézu proteoglykanů o 300 %, což je významně více než u TGF-beta. Stimulační účinek byl však dočasný a po několika dnech se úroveň syntézy vrátila na původní úroveň. TGF-beta způsobil dlouhodobější stimulaci syntézy proteoglykanů, což je pravděpodobně způsobeno autoindukcí TGF-beta a senzibilizací chondrocytů vůči tomuto faktoru.

TGF-beta je zodpovědný za tvorbu chondrofytů, což lze považovat za nežádoucí účinek jeho působení, KMP-2 také podporuje tvorbu chondrofytů, ale v jiné oblasti kloubního okraje (hlavně v oblasti růstové ploténky).

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Morfogenetické proteiny chrupavky

Morfogenetické proteiny chrupavky (CMP-1 a -2) jsou dalšími členy nadrodiny TGF-beta, které jsou nezbytné pro tvorbu chrupavčité tkáně během vývoje končetin. Mutace v genu CMP-1 způsobují chondrodysplazii. CMP mohou mít selektivnější profil zaměřený na chrupavku. Ačkoli TGF-beta a CMP mohou stimulovat chondrocyty, mohou působit i na mnoho dalších buněk, takže jejich použití pro opravu chrupavky může být spojeno s vedlejšími účinky. Oba typy CMP se nacházejí v chrupavce zdravých i osteoartritických kloubů a podporují opravu extracelulární membrány kloubní chrupavky po enzymatické degradaci, čímž si udržují normální fenotyp.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ]

Synergie růstových faktorů

Jeden růstový faktor je schopen indukovat sám sebe, stejně jako jiné růstové faktory, tato interakce je jemně regulována. Například FGF spolu s dalšími růstovými faktory zajišťuje účinnější reparaci kloubní chrupavky po traumatickém defektu. IGF-1 spolu s TGF-beta významně indukují normální fenotyp chondrocytů při jejich kultivaci in vitro. Bylo prokázáno, že TGF-beta zabraňuje produkci IGF-1 a IGF-BP a také defosforyluje receptor IGF-1, stimuluje vazbu IGF-1. V intaktní myší chrupavce byl zjištěn fenomén synergismu IGF-1 s mnoha růstovými faktory. Slabou reakci chondrocytů na IGF-1 však nelze nivelovat jeho použitím v kombinaci s jinými růstovými faktory.

Interakce anabolických a destruktivních cytokinů

Růstové faktory vykazují komplexní interakce s IL-1. Například preexpozice chondrocytů FGF zvyšuje uvolňování proteázy po expozici IL-1, pravděpodobně prostřednictvím zvýšené exprese receptoru IL-1. PDGF také stimuluje uvolňování proteázy závislé na IL-1, ale snižuje inhibici syntézy proteoglykanů zprostředkovanou IL-1. To může naznačovat, že některé růstové faktory mohou současně stimulovat opravu chrupavky a podporovat její destrukci. Jiné růstové faktory, jako je IGF-1 a TGF-β, stimulují syntézu kloubní matrix a inhibují destrukci kloubní chrupavky zprostředkovanou IL-1, což naznačuje, že jejich aktivita souvisí pouze s opravou tkání. Tato interakce je nezávislá na preexpozici chondrocytů IL-1. Je zajímavé, že kinetika účinků IL-1 a TGF-beta se může lišit: schopnost TGF-beta potlačovat degradaci kloubní chrupavky je oslabena jeho pomalým působením na mRNA TIMP. Na druhou stranu je pozorováno zvýšení hladin hNOC a NO v nepřítomnosti TGF-beta. Vzhledem k závislosti supresivního účinku IL-1 na syntézu proteoglykanů chondrocyty na NO by to mohlo vysvětlovat, proč pozorujeme výrazně silnější protiúčinek TGF-beta vůči IL-1-dependentní inhibici syntézy proteoglykanů ve srovnání s degradací proteoglykanů in vivo.

Ve studii na myších, kterým byl intraartikulárně injikován IL-1 a růstové faktory, bylo prokázáno, že TGF-beta významně působí proti inhibici syntézy proteoglykanů v kloubní chrupavce zprostředkované IL-1, zatímco CMP-2 takového působení není schopen: jeho stimulační potenciál byl IL-1 zcela inhibován i při vysokých koncentracích CMP-2. Je pozoruhodné, že v nepřítomnosti IL-1 CMP-2 stimuloval syntézu proteoglykanů mnohem intenzivněji než TGF-beta.

Kromě svého vlivu na syntézu proteoglykanů TGF-beta také významně ovlivňuje IL-1 indukované snížení obsahu proteoglykanů v chrupavce. Je možné, že obsah proteoglykanů klesá nebo se zvyšuje v závislosti na relativní koncentraci IL-1 a TGF-beta. Je zajímavé, že výše popsaný protiúčinek IL-1 a TGF-beta byl pozorován v tloušťce chrupavky, ale tento jev nebyl pozorován v blízkosti chondrofytů na okrajích kloubních ploch. Tvorba chondrofytů je indukována TGF-β, který ovlivňuje chondrogenní buňky v periostu, což způsobuje vývoj chondroblastů a ukládání proteoglykanů. Zdá se, že tyto chondroblasty nejsou citlivé na IL-1.

HL Glansbeek a kol. (1998) studovali schopnost TGF-beta a KMP-2 působit proti potlačení syntézy proteoglykanů v kloubech myší s artritidou indukovanou zymosanem (tj. v modelu „čistého“ zánětu indukovaného IL-1). Intraartikulární podání TGF-beta významně působilo proti potlačení syntézy proteoglykanů způsobené zánětem, zatímco KMP-2 prakticky nebyl schopen působit proti tomuto procesu závislému na IL-1. Opakované injekce TGF-β do kolenního kloubu studovaných zvířat významně stimulovaly syntézu proteoglykanů chondrocyty, přispěly k zachování existujících proteoglykanů v chrupavce ochuzené zánětem, ale nepotlačily zánětlivý proces.

Při studiu proteoglykany syntetizující funkce chondrocytů s využitím experimentálních modelů osteoartrózy u zvířat byl vždy zaznamenán nárůst obsahu a stimulace syntézy proteoglykanů v raných stádiích osteoartrózy, na rozdíl od zánětlivých modelů, u kterých je pozorována významná inhibice syntézy (proces závislý na IL-1). Zvýšená aktivita anabolických faktorů, zejména růstových faktorů, která je pozorována u osteoartrózy, neutralizuje účinek supresorových cytokinů, jako je IL-1. Mezi růstovými faktory má největší význam TGF-beta; KMP-2 pravděpodobně nehraje v tomto procesu významnou roli. Ačkoli je IGF-1 schopen stimulovat syntézu proteoglykanů in vitro, tato vlastnost není in vivo pozorována při lokální aplikaci IGF-1. To může být způsobeno tím, že endogenní hladina tohoto růstového faktoru je optimální. V pozdějších stádiích osteoartrózy se objevují známky inhibice syntézy proteoglykanů, což pravděpodobně souvisí s dominantním působením IL-1 a neschopností růstových faktorů proti němu působit v důsledku snížené aktivity.

Analýza exprese růstových faktorů u myší STR/ORT se spontánní osteoartrózou prokázala zvýšené hladiny mRNA TGF-β a IL-1 v poškozené chrupavce. Je třeba poznamenat, že aktivace TGF-β z latentní formy je důležitým prvkem opravy tkání. Pochopení role TGF-β je komplikováno výsledky studie exprese receptoru TGF-β typu II u králíků s ACL. Bezprostředně po indukci osteoartrózy byly detekovány snížené hladiny těchto receptorů, což naznačuje nedostatečnou signalizaci TGF-β. Je zajímavé, že myši s deficitem receptoru TGF-β typu 11 vykazovaly známky spontánní osteoartrózy, což také naznačuje důležitou roli signalizace TGF-β při zhoršování opravy chrupavky a rozvoji osteoartrózy.

Absolutní obsah růstových faktorů v kloubech pacientů s revmatoidní artritidou nebo osteoartritidou může naznačovat jejich možnou roli v patogenezi těchto onemocnění. Navzdory skutečnosti, že se v kloubech s osteoartritidou a revmatoidní artritidou nacházejí vysoké koncentrace růstových faktorů, je povaha degradačních a reparačních procesů u obou onemocnění zcela odlišná. Pravděpodobně existují i jiné, dosud neidentifikované faktory, které hrají hlavní roli v patogenezi těchto onemocnění, nebo jiné aspekty studovaných jevů určují průběh degradačních a reparačních procesů v kloubních tkáních (například exprese určitých receptorů na povrchu chondrocytů, rozpustných receptorů vázajících proteiny nebo nerovnováha anabolických a destruktivních faktorů).