Omezení, nebezpečí a komplikace transplantace buněk

Regenerativní plastická medicína je založena na klinickém využití toti- a pluripotentních vlastností embryonálních a progenitorových kmenových buněk, které umožňují in vitro a in vivo vytváření specifických buněčných linií, které repopulují poškozené tkáně a orgány nemocného člověka.

Reálná možnost využití embryonálních kmenových buněk a kmenových buněk definitivních tkání (tzv. „dospělých“ kmenových buněk) lidí pro terapeutické účely již není pochybná. Odborníci z Národní a lékařské akademie USA (Kmenové buňky a budoucí regenerativní medicína National Academy Press) a Národního institutu zdraví USA (Kmenové buňky a budoucí směry výzkumu. Nat. Inst, of Health USA) však doporučují podrobnější studium vlastností kmenových buněk v experimentech na adekvátních biologických modelech a objektivní posouzení všech důsledků transplantace a teprve poté kmenové buňky používat v klinické praxi.

Bylo zjištěno, že kmenové buňky jsou součástí tkáňových derivátů všech tří zárodečných vrstev. Kmenové buňky se nacházejí v sítnici, rohovce, kožní epidermis, kostní dřeni a periferní krvi, v cévách, zubní dřeni, ledvinách, gastrointestinálním epitelu, slinivce břišní a játrech. Pomocí moderních metod bylo prokázáno, že nervové kmenové buňky jsou lokalizovány v mozku a míše dospělého člověka. Tato senzační data přitáhla zvláštní pozornost vědců a médií, protože neurony v mozku sloužily jako klasický příklad statické buněčné populace, která se neobnovuje. Jak v rané, tak v pozdní fázi ontogeneze se v mozku zvířat i lidí tvoří neurony, astrocyty a oligodendrocyty díky nervovým kmenovým buňkám (Kmenové buňky: vědecký pokrok a směry budoucího výzkumu. Národní institut zdraví USA).

Za normálních podmínek se však plasticita kmenových buněk definitivních tkání neprojevuje. Aby se realizoval plastický potenciál kmenových buněk definitivních tkání, musí být izolovány a následně kultivovány v médiu s cytokiny (LIF, EGF, FGF). Deriváty kmenových buněk se navíc úspěšně uchytí pouze po transplantaci do těla zvířete s oslabeným imunitním systémem (γ-záření, cytostatika, busulfan atd.). Dosud nebyly získány žádné přesvědčivé důkazy o realizaci plasticity kmenových buněk u zvířat, která nebyla vystavena záření nebo jiným účinkům způsobujícím hlubokou imunosupresi.

Za takových podmínek se nebezpečný potenciál embryonálních kmenových buněk (ESC) projevuje především při jejich transplantaci do ektopických oblastí – při subkutánní injekci ESC imunodeficitním myším se v místě injekce tvoří teratokarcinomy. Navíc během vývoje lidského embrya je frekvence chromozomálních abnormalit vyšší než v embryogenezi u zvířat. Ve stádiu blastocysty se pouze 20–25 % lidských embryí skládá z buněk s normálním karyotypem a drtivá většina raných lidských embryí získaných po oplodnění in vitro vykazuje chaotickou chromozomální mozaiku a velmi často se setkává s numerickými a strukturálními aberacemi.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Blahodárné účinky kmenových buněk

Předběžné výsledky klinických studií potvrzují příznivý vliv kmenových buněk na pacienta, ale stále neexistují žádné informace o dlouhodobých účincích transplantace buněk. V literatuře zpočátku dominovaly zprávy o pozitivních výsledcích transplantace embryonálních mozkových fragmentů u Parkinsonovy choroby, ale poté se začaly objevovat údaje popírající účinný terapeutický účinek embryonální nebo fetální nervové tkáně transplantované do mozku pacientů.

V polovině 20. století byla poprvé objevena obnova hematopoézy u letálně ozářených zvířat po intravenózní transfuzi buněk kostní dřeně a v roce 1969 provedl americký výzkumník D. Thomas první transplantaci kostní dřeně u lidí. Nedostatek znalostí o mechanismech imunologické nekompatibility buněk kostní dřeně dárce a příjemce v té době vedl k vysoké úmrtnosti v důsledku častého selhání transplantace a rozvoje reakce štěp proti hostiteli. Objev hlavního histokompatibilního komplexu, který zahrnuje lidské leukocytární antigeny (HbA1c), a zlepšení metod jejich typizace umožnily výrazně zvýšit přežití po transplantaci kostní dřeně, což vedlo k širokému využití této léčebné metody v onkohematologii. O deset let později byly provedeny první transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSC) získaných z periferní krve pomocí leukaferézy. V roce 1988 byla pupečníková krev poprvé použita jako zdroj HSC ve Francii k léčbě dítěte s Fanconiho anémií a od konce roku 2000 se v tisku objevují zprávy o schopnosti HSC diferencovat se na buňky různých typů tkání, což potenciálně rozšiřuje rozsah jejich klinického využití. Ukázalo se však, že transplantační materiál spolu s HSC obsahuje značné množství nečistot nehematopoetických buněk různé povahy a vlastností. V tomto ohledu se vyvíjejí metody čištění transplantátu a kritéria pro posouzení jeho buněčné čistoty. Používá se zejména pozitivní imunoselekce CD34+ buněk, která umožňuje izolaci HSC pomocí monoklonálních protilátek.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikace terapie kmenovými buňkami

Komplikace při transplantaci kostní dřeně jsou nejčastěji hematologické a spojené s dlouhým obdobím iatrogenní pancytopenie. Nejčastěji se rozvíjejí infekční komplikace, anémie a krvácení. V tomto ohledu je nesmírně důležité zvolit optimální způsob odběru, zpracování a skladování kostní dřeně pro maximální zachování kmenových buněk, což zajistí rychlé a stabilní obnovení krvetvorby. Při charakterizaci transplantátu se v současnosti běžně hodnotí následující parametry: počet mononukleárních a/nebo jaderných buněk, jednotky tvořící kolonie a obsah CD34-pozitivních buněk. Tyto ukazatele bohužel poskytují pouze nepřímé posouzení skutečné hematopoetické kapacity populace kmenových buněk transplantátu. V současné době neexistují absolutně přesné parametry pro určení dostatečnosti transplantátu pro dlouhodobou obnovu krvetvorby u pacientů, a to ani při autologní transplantaci kostní dřeně. Vypracování obecných kritérií je extrémně obtížné kvůli nedostatku přísných standardů pro zpracování, kryokonzervaci a testování transplantátu. Kromě toho je nutné vzít v úvahu celou řadu faktorů ovlivňujících parametry úspěšné obnovy hematopoézy u každého jednotlivého pacienta. U autologní transplantace kostní dřeně jsou nejdůležitější počet předchozích chemoterapeutických cyklů, charakteristiky kondičního režimu, období onemocnění, ve kterém byla kostní dřeň odebrána, a schémata použití faktorů stimulujících kolonie v potransplantačním období. Kromě toho by se nemělo zapomínat, že chemoterapie předcházející odběru transplantátu může mít negativní vliv na kmenové buňky kostní dřeně.

Výskyt závažných toxických komplikací se během alogenní transplantace kostní dřeně významně zvyšuje. V tomto ohledu jsou zajímavé statistické údaje o alogenní transplantaci kostní dřeně u pacientů s talasemií. Zprávy Evropské skupiny pro transplantaci kostní dřeně registrují přibližně 800 transplantací kostní dřeně pacientům s talasemií major. Alogenní transplantace u pacientů s talasemií se v naprosté většině případů provádí od HLA-identických sourozenců, což je spojeno s těžkými komplikacemi a vysokou mortalitou při transplantaci materiálu kmenových buněk od částečně kompatibilních příbuzných nebo kompatibilních nepříbuzných dárců. Pro minimalizaci rizika fatálních infekčních komplikací jsou pacienti umístěni do izolovaných aseptických boxů s laminárním prouděním vzduchu a dostávají nízkobakteriální nebo abakteriální dietu. Pro bakteriální dekontaminaci střeva se perorálně předepisují nevstřebatelné formy antibiotik a antimykotika. Pro profylaxi se intravenózně podává amfotericin B. Prevence systémových infekcí je posílena amikacinem a ceftazidimem, které se předepisují den před transplantací, a léčba pokračuje až do propuštění pacienta. Všechny krevní produkty jsou před transfuzí ozařovány dávkou 30 Gy. Parenterální výživa během transplantace je nezbytnou podmínkou a začíná ihned po omezení příjmu potravy přirozenou cestou.

S vysokou toxicitou imunosupresivních léků je spojena řada komplikací, které často způsobují nevolnost, zvracení a mukozitidu, poškození ledvin a intersticiální pneumonii. Jednou z nejzávažnějších komplikací chemoterapie je venookluzivní onemocnění jater, které vede k úmrtí v časném potransplantačním období. Mezi rizikové faktory trombózy žil portálního systému jater patří věk pacientů, přítomnost hepatitidy a jaterní fibrózy, stejně jako imunosupresivní terapie po transplantaci kostní dřeně. Venookluzivní onemocnění je obzvláště nebezpečné při talasemii, která je doprovázena hemosiderózou jater, hepatitidou a fibrózou - častými průvodci transfuzní terapie. Trombóza žil portálního systému jater se rozvíjí 1-2 týdny po transplantaci a je charakterizována rychlým zvýšením obsahu bilirubinu a aktivity transamináz v krvi, progresí hepatomegalie, ascitu, encefalopatie a bolesti v horní části břicha. Histologicky pitevní materiál odhaluje poškození endotelu, subendoteliální krvácení, poškození centrilobulárních hepatocytů, trombotickou obstrukci venul a centrálních žil jater. U pacientů s talasemií byly popsány případy fatální srdeční zástavy spojené s toxickými účinky cytostatik.

V období před transplantací cyklofosfamid a busulfan často způsobují toxicko-hemoragickou cystitidu s patologickými změnami uroepiteliálních buněk. Použití cyklosporinu A při transplantaci kostní dřeně je často doprovázeno nefro- a neurotoxicitou, hypertenzním syndromem, zadržováním tekutin v těle a cytolýzou hepatocytů. Sexuální a reprodukční dysfunkce je častěji pozorována u žen. U malých dětí obvykle není pubertální vývoj po transplantaci ovlivněn, ale u starších dětí může být patologie vývoje pohlavní sféry velmi závažná - až po sterilitu. Mezi komplikace přímo související s transplantací patří odmítnutí alogenních buněk kostní dřeně, ABO inkompatibilita, akutní a chronické formy reakce štěpu proti hostiteli.

U pacientů s transplantací kostní dřeně nekompatibilní s ABO systémem jsou izoaglutininy typu hostitel versus ABO dárce produkovány po dobu 330–605 dnů po transplantaci, což může vést k prodloužené hemolýze a dramaticky zvýšit potřebu krevních transfuzí. Této komplikaci se předchází transfuzí pouze červených krvinek typu 0. Po transplantaci se u některých pacientů objeví autoimunitní neutropenie, trombocytopenie nebo pancytopenie, jejichž korekce vyžaduje splenektomii.

U 35–40 % příjemců se akutní reakce štěpu proti hostiteli vyvine do 100 dnů po alogenní transplantaci kostní dřeně s identickým HLA. Stupeň postižení kůže, jater a střev se pohybuje od vyrážky, průjmu a středně těžké hyperbilirubinemie až po deskvamaci kůže, střevní obstrukci a akutní selhání jater. U pacientů s talasemií je incidence akutní reakce štěpu proti hostiteli stupně I po transplantaci kostní dřeně 75 % a stupně II a vyššího je 11–53 %. Chronická reakce štěpu proti hostiteli jako systémový multiorgánový syndrom se obvykle vyvine do 100–500 dnů po alogenní transplantaci kostní dřeně u 30–50 % pacientů. Postižena je kůže, ústní dutina, játra, oči, jícen a horní cesty dýchací. Rozlišuje se mezi omezenou formou chronické reakce štěpu proti hostiteli, kdy je postižena kůže a/nebo játra, a rozšířenou formou, kdy jsou generalizované kožní léze kombinovány s chronickou agresivní hepatitidou, lézemi očí, slinných žláz nebo jakéhokoli jiného orgánu. Úmrtí je často způsobeno infekčními komplikacemi vyplývajícími z těžké imunodeficience. U talasemii se mírná forma chronické reakce štěpu proti hostiteli vyskytuje u 12 %, středně těžká forma u 3 % a těžká forma u 0,9 % příjemců alogenní HLA-kompatibilní kostní dřeně. Závažnou komplikací transplantace kostní dřeně je odmítnutí štěpu, které se rozvíjí 50–130 dní po operaci. Četnost odmítnutí závisí na kondičním režimu. Zejména u pacientů s talasemií, kteří během přípravného období dostávali pouze methotrexát, byla odmítnutí transplantátu kostní dřeně pozorováno u 26 % případů, při kombinaci methotrexátu s cyklosporinem A u 9 % případů a při podávání pouze cyklosporinu A u 8 % případů (Gaziev a kol., 1995).

Infekční komplikace po transplantaci kostní dřeně jsou způsobeny viry, bakteriemi a plísněmi. Jejich rozvoj je spojen s hlubokou neutropenií vyvolanou chemoterapeutiky během období kondicionace, poškozením slizničních bariér cytostatiky a reakcí štěp proti hostiteli. V závislosti na době vývoje se rozlišují tři fáze infekčních komplikací. V první fázi (vyvíjí se v prvním měsíci po transplantaci) převládá poškození slizničních bariér a neutropenie, často doprovázené virovými infekcemi (herpes, virus Epstein-Barrové, cytomegalovirus, Varicella zoster), dále infekcemi způsobenými grampozitivními a gramnegativními bakteriemi, plísněmi Candida, aspergily. V časném potransplantačním období (druhý a třetí měsíc po transplantaci) je nejzávažnější infekcí cytomegalovirová, která často vede k úmrtí pacientů ve druhé fázi infekčních komplikací. U talasemie se cytomegalovirová infekce po transplantaci kostní dřeně vyvíjí u 1,7–4,4 % příjemců. Třetí fáze je pozorována v pozdním období po transplantaci (tři měsíce po operaci) a je charakterizována těžkou kombinovanou imunodeficiencí. Infekce způsobené viry Varicella zoster, streptokoky, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae a hepatotropními viry jsou v tomto období běžné. U pacientů s talasemií je úmrtnost pacientů po transplantaci kostní dřeně spojena s bakteriální a mykotickou sepsí, idiopatickou intersticiální a cytomegalovirovou pneumonií, syndromem akutní respirační tísně, akutním srdečním selháním, srdeční tamponádou, mozkovým krvácením, venookluzivním onemocněním jater a akutní reakcí štěpu proti hostiteli.

V současné době bylo dosaženo určitých úspěchů ve vývoji metod pro izolaci čistých populací hematopoetických kmenových buněk z kostní dřeně. Byla vylepšena technika pro získávání fetální krve z pupeční šňůry a byly vytvořeny metody pro izolaci hematopoetických buněk z pupečníkové krve. Ve vědeckém tisku se objevují zprávy, že hematopoetické kmenové buňky jsou schopny množení, pokud jsou kultivovány v médiích s cytokiny. Při použití speciálně navržených bioreaktorů pro expanzi hematopoetických kmenových buněk se biomasa hematopoetických kmenových buněk izolovaných z kostní dřeně, periferní nebo pupečníkové krve výrazně zvyšuje. Možnost expanze hematopoetických kmenových buněk je důležitým krokem ke klinickému vývoji buněčné transplantace.

Před in vitro množením hematopoetických kmenových buněk je však nutné izolovat homogenní populaci hematopoetických kmenových buněk. Toho se obvykle dosahuje pomocí markerů, které umožňují selektivní značení hematopoetických kmenových buněk monoklonálními protilátkami kovalentně vázanými na fluorescenční nebo magnetickou značku a jejich izolaci pomocí vhodného buněčného třídiče. Zároveň otázka fenotypových charakteristik hematopoetických kmenových buněk nebyla definitivně vyřešena. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) považují buňky s antigeny CD34, AC133 a Thyl na povrchu a bez markerů CD38, HLA-DR nebo jiných diferenciačních markerů (buňky s fenotypem CD34+Liir) za kandidáty na hematopoetické kmenové buňky. Mezi markery linie (Lin) patří glykoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Buňky s fenotypem CD34+CD45RalüW CD71low, stejně jako s fenotypem CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, jsou považovány za slibné pro transplantaci.

Problematická zůstává otázka počtu hematopoetických kmenových buněk dostatečných pro efektivní transplantaci. V současné době jsou zdroji hematopoetických kmenových buněk kostní dřeň, periferní a pupečníková krev a embryonální játra. Expanze hematopoetických kmenových buněk se dosahuje jejich kultivací v přítomnosti endotelových buněk a hematopoetických růstových faktorů. V různých protokolech se k indukci proliferace HSC používají myeloproteiny, SCF, erytropoetin, inzulinu podobné růstové faktory, kortikosteroidy a estrogeny. Při použití kombinací cytokinů in vitro je možné dosáhnout významného zvýšení zásoby HSC s vrcholem jejich produkce na konci druhého týdne kultivace.

Transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve se tradičně používá hlavně u hemoblastóz. Minimální dávka hematopoetických buněk potřebná pro úspěšnou transplantaci pupečníkové krve je však 3,7 x 107 ^jaderných buněk na 1 kg tělesné hmotnosti příjemce. Použití menšího počtu hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve významně zvyšuje riziko selhání štěpu a relapsu onemocnění. Proto se transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve používá hlavně k léčbě hemoblastóz u dětí.

Bohužel stále neexistují žádné standardy pro odběr ani standardizované protokoly pro klinické využití krvetvorných buněk z pupečníkové krve. Kmenové buňky z pupečníkové krve samy o sobě proto nejsou právně uznávaným zdrojem krvetvorných buněk pro transplantaci. Navíc neexistují žádné etické ani právní normy upravující činnost a organizaci bank pupečníkové krve, které existují v zahraničí. Pro bezpečnou transplantaci je však nutné pečlivě sledovat všechny vzorky pupečníkové krve. Před odběrem krve od těhotné ženy je nutné získat její souhlas. Každá těhotná žena musí být vyšetřena na nosičství HBsAg, přítomnost protilátek proti virům hepatitidy C, HIV a syfilisu. Každý vzorek pupečníkové krve musí být standardně testován na počet jaderných buněk, CD34+ a schopnost tvořit kolonie. Dále se provádí typizace HbA, stanovení krevní skupiny pomocí ABO a její příslušnosti pomocí Rh faktoru. Nezbytné testovací postupy zahrnují bakteriologickou kultivaci na sterilitu, sérologické testování na infekce HIV-1 a HIV-2, HBsAg, virovou hepatitidu C, cytomegalovirovou infekci, HTLY-1 a HTLY-II, syfilis a toxoplazmózu. Kromě toho se provádí polymerázová řetězová reakce k detekci infekcí cytomegalovirem a HIV. Zdá se vhodné doplnit testovací protokoly o analýzu GSC pupečníkové krve k detekci genetických onemocnění, jako je α-talasemie, srpkovitá anémie, deficit adenosindeaminázy, Brutonova agamaglobulinémie, Hurlerova a Ponterova choroba.

Další fází přípravy na transplantaci je otázka konzervace hematopoetických kmenových buněk. Nejnebezpečnějšími postupy pro životaschopnost buněk během jejich přípravy jsou zmrazování a rozmrazování. Při zmrazování hematopoetických buněk může být jejich významná část zničena v důsledku tvorby krystalů. Ke snížení procenta buněčné smrti se používají speciální látky - kryoprotektory. Nejčastěji se jako kryoprotektor používá DMSO v konečné koncentraci 10 %. DMSO v takové koncentraci se však vyznačuje přímým cytotoxickým účinkem, který se projevuje i za podmínek minimální expozice. Snížení cytotoxického účinku se dosahuje přísným dodržováním nulové teploty expozičního režimu a také dodržováním předpisů pro zpracování materiálu během a po rozmrazování (rychlost všech manipulací, použití vícenásobných promývacích postupů). Koncentrace DMSO nižší než 5 % by se neměly používat, protože to způsobuje masivní úmrtí hematopoetických buněk během období zmrazování.

Přítomnost nečistot erytrocytů v suspenzní směsi hematopoetických kmenových buněk vytváří riziko vzniku reakce inkompatibility s erytrocytárními antigeny. Zároveň se při odstraňování erytrocytů výrazně zvyšuje ztráta hematopoetických buněk. V tomto ohledu byla navržena metoda nefrakcionované izolace hematopoetických kmenových buněk. V tomto případě se k ochraně jaderných buněk před škodlivými účinky nízkých teplot používá 10% roztok DMSO a konstantní rychlost chlazení (GS/min) na -80 °C, po čemž se buněčná suspenze zmrazí v tekutém dusíku. Předpokládá se, že tato metoda kryokonzervace vede k částečné lýze erytrocytů, takže vzorky krve nevyžadují frakcionaci. Před transplantací se buněčná suspenze rozmrazí, promyje se od volného hemoglobinu a DMSO v roztoku lidského albuminu nebo v krevním séru. Konzervace hematopoetických prekurzorů touto metodou je sice vyšší než po frakcionaci pupečníkové krve, ale riziko transfuzních komplikací v důsledku transfuze ABO-nekompatibilních erytrocytů zůstává.

Zřízení bankovního systému pro ukládání vzorků HSC testovaných a typovaných pomocí HLA by mohlo výše uvedené problémy vyřešit. To však vyžaduje vytvoření etických a právních norem, o kterých se v současné době pouze diskutuje. Před vytvořením bankovní sítě je nutné přijmout řadu předpisů a dokumentů o standardizaci postupů pro odběr, frakcionaci, testování a typizaci, jakož i kryokonzervaci HSC. Nezbytnou podmínkou pro efektivní fungování bank HSC je organizace počítačové základny pro interakci s registry Světové asociace dárců dřeně (WMDA) a Národního programu dárců dřeně Spojených států (NMDP).

Kromě toho je nutné optimalizovat a standardizovat metody expanze HSC in vitro, primárně hematopoetických buněk z pupečníkové krve. Expanze HSC z pupečníkové krve je nezbytná pro zvýšení počtu potenciálních příjemců kompatibilních se systémem HLA. Vzhledem k malým objemům pupečníkové krve obvykle počet HSC v ní obsažených není schopen zajistit repopulaci kostní dřeně u dospělých pacientů. Zároveň je pro provedení nepříbuzných transplantací nutné mít přístup k dostatečnému počtu typovaných vzorků HSC (od 10 000 do 1 500 000 na příjemce).

Transplantace hematopoetických kmenových buněk neodstraňuje komplikace, které transplantaci kostní dřeně doprovázejí. Analýzy ukazují, že při transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve se u 23 % příjemců vyvinou těžké formy akutní reakce štěpu proti hostiteli a u 25 % chronické formy. U onkohematologických pacientů jsou relapsy akutní leukémie během prvního roku po transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve pozorovány u 26 % případů.

V posledních letech se intenzivně rozvíjejí metody transplantace periferních hematopoetických kmenových buněk. Obsah HSC v periferní krvi je tak malý (1 HSC na 100 000 krvinek), že jejich izolace bez speciální přípravy nedává smysl. Proto je dárci nejprve podána kúra lékové stimulace uvolňování hematopoetických buněk z kostní dřeně do krve. K tomuto účelu se používají takové zdaleka neškodné léky, jako je cyklofosfamid a faktor stimulující kolonie granulocytů. Ale i po proceduře mobilizace HSC do periferní krve obsah CD34+ buněk v ní nepřesahuje 1,6 %.

Pro mobilizaci hematopoetických kmenových buněk v klinických podmínkách se nejčastěji používá S-SEC, která se vyznačuje relativně dobrou tolerancí, s výjimkou téměř přirozeného výskytu bolesti kostí. Je třeba poznamenat, že použití moderních krevních separátorů umožňuje efektivní izolaci hematopoetických kmenových buněk. Za normálních podmínek hematopoézy je však nutné provést alespoň 6 procedur, aby se získal dostatečný počet hematopoetických kmenových buněk srovnatelných repopulační kapacitou se suspenzí kostní dřeně. Každý takový postup vyžaduje zpracování 10–12 litrů krve na separátoru, což může způsobit trombocytopenii a leukopenii. Separační postup zahrnuje zavedení antikoagulancia (citrátu sodného) dárci, což však nevylučuje kontaktní aktivaci krevních destiček během extrakorporální centrifugace. Tyto faktory vytvářejí podmínky pro rozvoj infekčních a hemoragických komplikací. Další nevýhodou metody je značná variabilita mobilizační reakce, která vyžaduje sledování obsahu HSC v periferní krvi dárců, což je nezbytné pro stanovení jejich maximální hladiny.

Autogenní transplantace hematopoetických kmenových buněk, na rozdíl od alogenní transplantace, zcela eliminuje rozvoj rejekční reakce. Významnou nevýhodou autotransplantace hematopoetických kmenových buněk, která omezuje rozsah indikací pro její provedení, je však vysoká pravděpodobnost reinfuze leukemických klonových buněk s transplantátem. Absence imunitně zprostředkovaného efektu „štěp proti nádoru“ navíc významně zvyšuje frekvenci relapsů maligních onemocnění krve. Jedinou radikální metodou eliminace neoplastické klonální hematopoézy a obnovení normální polyklonální hematopoézy u myelodysplastických syndromů proto zůstává intenzivní polychemoterapie s transplantací alogenní hematopoézy.

Ale i v tomto případě je léčba většiny hemoblastóz zaměřena pouze na prodloužení doby přežití pacientů a zlepšení jejich kvality života. Podle několika velkých studií je dlouhodobého přežití bez relapsu po alotransplantaci HSC dosaženo u 40 % onkohematologických pacientů. Při použití kmenových buněk HLA-kompatibilního sourozence jsou nejlepší výsledky pozorovány u mladých pacientů s krátkou anamnézou onemocnění, počtem blastových buněk do 10 % a příznivou cytogenetikou. Bohužel mortalita spojená s postupem alotransplantace HSC u pacientů s myelodysplastickými onemocněními zůstává vysoká (ve většině zpráv - asi 40 %). Výsledky 10leté práce Národního programu dárcovství kostní dřeně v USA (510 pacientů, medián věku - 38 let) ukazují, že přežití bez relapsu po dobu dvou let je 29 % s relativně nízkou pravděpodobností relapsu (14 %). Úmrtnost spojená s alotransplantací HSC od nepříbuzného dárce je však extrémně vysoká a dosahuje 54 % během dvouletého období. Podobné výsledky byly získány v evropské studii (118 pacientů, medián věku - 24 let, dvouleté přežití bez relapsu - 28 %, relaps - 35 %, úmrtnost - 58 %).

Během intenzivních chemoterapeutických cyklů s následnou obnovou hematopoézy alogenními hematopoetickými buňkami se často vyskytují imunohematologické a transfuzní komplikace. Jsou z velké části způsobeny skutečností, že lidské krevní skupiny se dědí nezávisle na molekulách MHC. Proto i když jsou dárce a příjemce kompatibilní, pokud jde o hlavní HLA antigeny, jejich erytrocyty mohou mít odlišné fenotypy. Rozlišuje se mezi „velkou“ inkompatibilitou, kdy má příjemce již existující protilátky proti erytrocytárním antigenům dárce, a „vedlejší“ inkompatibilitou, kdy má dárce protilátky proti erytrocytárním antigenům příjemce. Možné jsou případy kombinace „velké“ a „vedlejší“ inkompatibility.

Výsledky srovnávací analýzy klinické účinnosti alotransplantace hematopoetických kmenových buněk kostní dřeně a pupečníkové krve u hemoblastóz naznačují, že u dětí po alotransplantaci hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve je riziko vzniku reakce štěpu proti hostiteli významně sníženo, ale je pozorováno delší období obnovy počtu neutrofilů a krevních destiček s vyšším výskytem 100denní posttransplantační mortality.

Studium příčin časné úmrtnosti umožnilo objasnit kontraindikace alogenní transplantace HSC, mezi nimiž nejdůležitější jsou:

• přítomnost pozitivních testů na cytomegalovirovou infekci u příjemce nebo dárce (bez preventivní léčby);
• akutní nemoc z ozáření;
• přítomnost nebo dokonce podezření na přítomnost mykotické infekce u pacienta (bez provedení systémové včasné profylaxe fungicidními léky);
• hemoblastózy, u kterých pacienti dostávali dlouhodobou léčbu cytostatiky (kvůli vysoké pravděpodobnosti náhlé srdeční zástavy a selhání více orgánů);
• transplantace od HLA-neidentických dárců (bez profylaxe akutní reakce štěpu proti hostiteli cyklosporinem A);
• chronická virová hepatitida C (kvůli vysokému riziku vzniku venookluzivního onemocnění jater).

Transplantace HSC tedy může způsobit závažné komplikace, které často vedou k úmrtí. V časném (až 100 dní po transplantaci) období se jedná o infekční komplikace, akutní reakci štěpu proti hostiteli, odmítnutí štěpu (selhání dárcovských HSC), venookluzivní onemocnění jater, stejně jako poškození tkání způsobené toxicitou kondičního režimu, který se vyznačuje vysokou mírou remodelace (kůže, cévní endotel, střevní epitel). Mezi komplikace pozdního období po transplantaci patří chronická reakce štěpu proti hostiteli, relapsy základního onemocnění, růstová retardace u dětí, dysfunkce reprodukčního systému a štítné žlázy a poškození očí.

V poslední době se v souvislosti s publikacemi o plasticitě buněk kostní dřeně objevila myšlenka využití HSC k léčbě infarktů a dalších onemocnění. Ačkoli některé experimenty na zvířatech tuto možnost podporují, je třeba závěry o plasticitě buněk kostní dřeně potvrdit. Tuto okolnost by měli vzít v úvahu ti výzkumníci, kteří se domnívají, že transplantované lidské buňky kostní dřeně se snadno transformují do buněk kosterního svalstva, myokardu nebo CNS. Hypotéza, že HSC jsou přirozeným buněčným zdrojem regenerace těchto orgánů, vyžaduje závažné důkazy.

Zejména byly publikovány první výsledky otevřené randomizované studie V. Belenkova (2003). Jejím cílem bylo studovat vliv C-SvK (tj. mobilizace autologních HSC do krve) na klinický, hemodynamický a neurohumorální stav pacientů se středně těžkým až těžkým chronickým srdečním selháním a také vyhodnotit její bezpečnost na pozadí standardní terapie (inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu, beta-blokátory, diuretika, srdeční glykosidy). V první publikaci výsledků studie autoři programu poznamenávají, že jediným argumentem ve prospěch O-SvK jsou výsledky léčby jednoho pacienta, u kterého došlo k nespornému zlepšení všech klinických a hemodynamických parametrů na pozadí terapie tímto lékem. Teorie mobilizace HSC do krevního oběhu s následnou regenerací myokardu v postinfarktové zóně však nebyla potvrzena - ani u pacienta s pozitivní klinickou dynamikou stresová echokardiografie s dobutaminem neodhalila výskyt zón životaschopného myokardu v oblasti jizvy.

Je třeba poznamenat, že v současné době zjevně neexistuje dostatek údajů k doporučení substituční buněčné terapie pro její široké zavedení do každodenní klinické praxe. Jsou zapotřebí dobře navržené a kvalitní klinické studie, které by určily účinnost různých možností regenerativní buněčné terapie, vypracovaly indikace a kontraindikace pro ni, jakož i pokyny pro kombinované použití regenerativně-plastické terapie a tradiční chirurgické nebo konzervativní léčby. Stále neexistuje odpověď na otázku, která konkrétní populace buněk kostní dřeně (kmenové hematopoetické nebo stromální) může dát vzniknout neuronům a kardiomyocytům, a také není jasné, jaké podmínky k tomu in vivo přispívají.

Práce v těchto oblastech probíhá v mnoha zemích. Ve shrnutí sympozia o akutním selhání jater Národních institutů zdraví USA je mezi slibnými metodami léčby, spolu s transplantací jater, uvedena transplantace xeno- nebo alogenních hepatocytů a mimotělní propojení bioreaktorů s jaterními buňkami. Existují přímé důkazy o tom, že pouze cizí funkčně aktivní hepatocyty jsou schopny poskytnout účinnou podporu játrům příjemce. Pro klinické využití izolovaných hepatocytů je nutné vytvořit buněčnou banku, která výrazně zkrátí dobu mezi izolací buněk a jejich použitím. Nejpřijatelnější metodou pro vytvoření banky izolovaných hepatocytů je kryokonzervace jaterních buněk v tekutém dusíku. Při použití takových buněk v klinických podmínkách u pacientů s akutním a chronickým selháním jater byl zjištěn poměrně vysoký terapeutický účinek.

Navzdory optimistickým a povzbudivým výsledkům transplantace jaterních buněk v experimentech a klinické praxi stále existuje mnoho problémů, které zdaleka nejsou vyřešeny. Patří mezi ně omezený počet orgánů vhodných pro získání izolovaných hepatocytů, nedostatečně účinné metody pro jejich izolaci, absence standardizovaných metod pro konzervaci jaterních buněk, nejasné představy o mechanismech regulace růstu a proliferace transplantovaných buněk, absence adekvátních metod pro posouzení uchycení nebo odmítnutí alogenních hepatocytů. Patří sem i přítomnost transplantační imunity při použití alogenních a xenogenních buněk, sice menší než u ortotopické transplantace jater, ale vyžadující použití imunosupresiv, zapouzdření izolovaných hepatocytů nebo jejich speciální ošetření enzymy. Transplantace hepatocytů často vede k imunitnímu konfliktu mezi příjemcem a dárcem ve formě odmítací reakce, která vyžaduje použití cytostatik. Jedním z řešení tohoto problému může být použití polymerních mikroporézních nosičů k izolaci jaterních buněk, což zlepší jejich přežití, protože membrána kapsle účinně chrání hepatocyty i přes imunizaci hostitele.

Při akutním selhání jater je však taková transplantace hepatocytů neúčinná kvůli relativně dlouhé době potřebné k uchycení jaterních buněk v novém prostředí a dosažení stádia optimální funkce. Potenciálním omezením je sekrece žluči během ektopické transplantace izolovaných hepatocytů a při použití bioreaktorů je významnou fyziologickou bariérou druhový nesoulad mezi lidskými proteiny a proteiny produkovanými xenogenními hepatocyty.

V literatuře se objevují zprávy, že lokální transplantace stromálních kmenových buněk kostní dřeně usnadňuje účinnou korekci kostních defektů a obnova kostní tkáně v tomto případě probíhá intenzivněji než při spontánní reparativní regeneraci. Několik preklinických studií na experimentálních modelech přesvědčivě prokazuje možnost využití transplantací stromálních buněk kostní dřeně v ortopedii, ačkoli je zapotřebí další práce k optimalizaci těchto metod, a to i v nejjednodušších případech. Zejména dosud nebyly nalezeny optimální podmínky pro expanzi osteogenních stromálních buněk ex vivo a struktura a složení jejich ideálního nosiče (matrice) zůstávají nevyvinuté. Minimální počet buněk potřebný pro objemovou regeneraci kosti nebyl stanoven.

Bylo prokázáno, že mezenchymální kmenové buňky vykazují transgermální plasticitu, tj. schopnost diferencovat se na buněčné typy fenotypově nepříbuzné s buňkami původní linie. Za optimálních kultivačních podmínek mohou polyklonální linie stromálních kmenových buněk kostní dřeně odolat více než 50 dělením in vitro, což umožňuje získat miliardy stromálních buněk z 1 ml aspirátu kostní dřeně. Populace mezenchymálních kmenových buněk je však heterogenní, což se projevuje jak variabilitou velikosti kolonií, různou rychlostí jejich tvorby, tak i morfologickou rozmanitostí buněčných typů, od vřetenovitě tvarovaných buněk podobných fibroblastům až po velké ploché buňky. Fenotypová heterogenita je pozorována již po 3 týdnech kultivace stromálních kmenových buněk: některé kolonie tvoří uzlíky kostní tkáně, jiné tvoří shluky adipocytů a další, vzácnější, tvoří ostrůvky chrupavčité tkáně.

Transplantace embryonální nervové tkáně byla zpočátku používána k léčbě degenerativních onemocnění centrálního nervového systému. V posledních letech byly místo embryonální mozkové tkáně transplantovány buněčné elementy neurosfér získané z nervových kmenových buněk (Poltavtseva, 2001). Neurosféry obsahují komitované prekurzory neuronů a neuroglie, což dává naději na obnovení ztracených mozkových funkcí po jejich transplantaci. Po transplantaci dispergovaných buněk neurosfér do oblasti striata mozku potkanů byla zaznamenána jejich proliferace a diferenciace na dopaminergní neurony, což eliminovalo motorickou asymetrii u potkanů s experimentálním hemiparkinsonismem. V některých případech se však z buněk neurosfér vyvinuly nádory, což vedlo k úhynu zvířat (Bjorklund, 2002).

V klinické praxi byly provedeny pečlivé studie dvou skupin pacientů, u kterých ani pacienti, ani lékaři, kteří je pozorovali, nevěděli (dvojitě zaslepená studie), že jedné skupině pacientů byla transplantována embryonální tkáň s neurony produkujícími dopamin a druhá skupina pacientů podstoupila simulovanou operaci, což přineslo neočekávané výsledky. Pacienti, kterým byla transplantována embryonální nervová tkáň, se necítili o nic lépe než pacienti v kontrolní skupině. Kromě toho se u 5 z 33 pacientů 2 roky po transplantaci embryonální nervové tkáně vyvinula perzistující dyskineze, která u pacientů v kontrolní skupině nebyla přítomna (Kmenové buňky: vědecký pokrok a budoucí směry výzkumu. Národní ústav zdravotnictví. USA). Jedním z nevyřešených problémů klinického výzkumu nervových kmenových buněk mozku zůstává analýza reálných perspektiv a omezení transplantace jejich derivátů pro korekci poruch CNS. Je možné, že neuronogeneze v hipokampu vyvolaná prodlouženou záchvatovou aktivitou, vedoucí k jeho strukturální a funkční reorganizaci, může být faktorem progresivního rozvoje epilepsie. Tento závěr si zaslouží zvláštní pozornost, protože poukazuje na možné negativní důsledky tvorby nových neuronů ve zralém mozku a tvorby aberantních synaptických spojení jimi.

Nemělo by se zapomínat, že kultivace v médiích s cytokiny (mitogeny) přibližuje vlastnosti kmenových buněk vlastnostem nádorových buněk, protože u nich dochází k podobným změnám v regulaci buněčných cyklů, které určují schopnost neomezeného dělení. Je bezohledné transplantovat časné deriváty embryonálních kmenových buněk člověku, protože v tomto případě je riziko vzniku maligních nádorů velmi vysoké. Mnohem bezpečnější je použít jejich angažovanější potomstvo, tj. prekurzorové buňky diferencovaných linií. V současné době však dosud nebyla vyvinuta spolehlivá technika pro získání stabilních linií lidských buněk, které se diferencují požadovaným směrem.

Využití technologií molekulární biologie pro korekci dědičných patologií a lidských onemocnění modifikací kmenových buněk je pro praktickou medicínu velmi zajímavé. Vlastnosti genomu kmenových buněk umožňují vyvinout unikátní transplantační schémata pro korekci genetických onemocnění. V této oblasti však existuje řada omezení, která je třeba překonat před praktickým využitím genetického inženýrství kmenových buněk. V první řadě je nutné optimalizovat proces modifikace genomu kmenových buněk ex vivo. Je známo, že dlouhodobá (3-4 týdny) proliferace kmenových buněk snižuje jejich transfekci, takže k dosažení vysoké úrovně jejich genetické modifikace je nutné několik transfekčních cyklů. Hlavní problém je však spojen s dobou trvání terapeutické genové exprese. Dosud v žádné studii nepřekročila doba účinné exprese po transplantaci modifikovaných buněk čtyři měsíce. Ve 100 % případů se exprese transfekovaných genů v průběhu času snižuje v důsledku inaktivace promotorů a/nebo smrti buněk s modifikovaným genomem.

Důležitou otázkou jsou náklady na využití buněčných technologií v medicíně. Například odhadovaná roční potřeba financovat pouze lékařské výdaje jednotky pro transplantaci kostní dřeně určené k provádění 50 transplantací ročně je přibližně 900 000 USD.

Vývoj buněčných technologií v klinické medicíně je složitý a vícestupňový proces, který zahrnuje konstruktivní spolupráci mezi multidisciplinárními vědeckými a klinickými centry a mezinárodní komunitou. Zároveň si zvláštní pozornost vyžadují otázky vědecké organizace výzkumu v oblasti buněčné terapie. Nejdůležitější z nich jsou vývoj klinických výzkumných protokolů, kontrola spolehlivosti klinických dat, tvorba národního registru studií, integrace do mezinárodních programů multicentrických klinických studií a implementace výsledků do klinické praxe.

Závěrem úvodu k problematice buněčné transplantologie bych rád vyjádřil naději, že sjednocení úsilí předních ukrajinských specialistů z různých vědních oborů zajistí významný pokrok v experimentálním a klinickém výzkumu a v nadcházejících letech umožní najít účinné způsoby, jak pomoci vážně nemocným lidem, kteří potřebují transplantaci orgánů, tkání a buněk.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]