Nervové kmenové buňky

Experimentální důkazy o možnosti regenerace buněk CNS byly získány mnohem dříve než objev embryonálních kmenových buněk ve studiích, které prokázaly přítomnost buněk v neokortexu, hipokampu a čichových bulbech mozku dospělých krys, které zachycují 3H-thymidin, tj. jsou schopné syntézy a dělení proteinů. Ještě v 60. letech minulého století se předpokládalo, že tyto buňky jsou prekurzory neuronů a přímo se podílejí na procesech učení a paměti. O něco později byla odhalena přítomnost synapsí na neuronech vytvořených de novo a objevily se první práce o využití embryonálních kmenových buněk za účelem indukce neurogeneze in vitro. Na konci 20. století vedly experimenty s řízenou diferenciací embryonálních kmenových buněk (ESC) na nervové progenitorové buňky, dopaminergní a serotonergní neurony k revizi klasických představ o schopnosti regenerace nervových buněk savců. Výsledky četných studií přesvědčivě prokázaly jak realitu restrukturalizace neuronových sítí, tak i přítomnost neurogeneze v celém období postnatálního života savčího organismu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Zdroje nervových kmenových buněk

Lidské nervové kmenové buňky jsou izolovány během operací na subventrikulární oblasti laterálních komor a gyrus dentatus hipokampu, jejichž buňky tvoří v kultuře neurosféry (neurální koule) a po disperzi a preformaci těchto - všechny hlavní buněčné typy centrálního nervového systému nebo ve speciálním médiu nové mikrosféry. V suspenzních kulturách disociované tkáně izolované z periventrikulárních oblastí embryonálního mozku také vznikají neurosféry.

Mezi markery nezralých mozkových buněk patří nestin, beta-tubulin III (marker neuronální linie), vimentin, GFAP a NCAM, které jsou identifikovány imunocytochemicky pomocí monoklonálních protilátek. Nestin (intermediate neurofilament protein typ IV) je exprimován multipotentními neuroektodermálními buňkami. Tento protein se používá k identifikaci a izolaci multipotentních neuroepiteliálních progenitorových buněk z CNS pomocí monoklonálních protilátek Rat-401, které dokáží detekovat až 95 % buněk neurální trubice u embryí potkanů jedenáctý den gestace. Nestin není exprimován na diferencovaných potomcích nervových kmenových buněk, ale je přítomen v raných nervových progenitorových buňkách, postmitotických neuronech a raných neuroblastech. Tento marker byl použit k identifikaci neuroepiteliálních progenitorových buněk a k prokázání existence kmenových buněk v CNS. Vimentin (intermediate neurofilament protein typ III) je exprimován nervovými a gliovými progenitorovými buňkami, stejně jako neurony, fibroblasty a buňkami hladkého svalstva. Oba imunocytochemické markery proto postrádají specificitu potřebnou k oddělené identifikaci nervových kmenových a progenitorových buněk. Beta-tubulin III určuje neuronální směr diferenciace kmenových buněk, zatímco astrocyty typu I jsou identifikovány expresí GFAP a oligodendrocyty specificky exprimují galaktocerebrosid (Ga!C).

FGF2 a EGF slouží jako mitogeny pro nervové progenitorové buňky a podporují proliferaci nediferencovaných progenitorových buněk v kultuře s tvorbou neurosfér. Rychlost dělení nervových kmenových buněk se významně zvyšuje pod vlivem FGF2, stejně jako při použití kombinace FGF2 + EGF. Proliferační účinky FGF2 jsou zprostředkovány receptory FGF2-R1. Heparin zvyšuje afinitu vazby receptoru FGF2 a dramaticky zesiluje jeho mitogenní účinek na neuroepiteliální buňky. V raných fázích embryogeneze jsou receptory FGF2 exprimovány v telencefalonu potkanů, zatímco v pozdějších fázích je jejich lokalizace omezena na ventrikulární zónu. Vrchol exprese FGF2-R1 postmitotickými buňkami je pozorován po dokončení období rané neurogeneze. Počáteční období vývoje telencefalonu je charakterizováno nízkou hladinou exprese receptoru EGF, zejména v buňkách ventrální oblasti. V pozdějších fázích embryogeneze se exprese EGF-R zvyšuje v dorzálním směru. V mozku hlodavců má EGF vysokou afinitu k receptoru transformujícího růstového faktoru beta (TGF-beta-R), na který se přednostně váže. Nepřímý důkaz funkční role EGF-R poskytují data o kortikální dysgenezi předního mozku, ke které dochází v pozdním období embryogeneze a postnatální ontogeneze, snížené funkci předního mozku, úmrtí kortikálních buněk a ektopii hipokampu u myší s knockoutem genu pro receptor EGF. Kromě toho je přítomnost TGF-a v živném médiu naprosto nezbytná pro tvorbu neurosfér. Po odstranění růstových faktorů z podmíněného média se buňky přestanou dělit a podléhají spontánní diferenciaci za vzniku neuronů, astrocytů a oligodendroblastů.

S ohledem na to se reagregace disociovaných kmenových buněk a kultivace neurosfér provádí v živných médiích obsahujících EGF a bazický FGF nebo FGF2, ale bez přidání séra. Bylo prokázáno, že EGF indukuje proliferaci kmenových buněk subependymální zóny laterálních komor a bazický FGF podporuje proliferaci kmenových buněk striata, hipokampu, neokortexu a zrakového nervu zralého mozku. Kombinace EGF a bazického FGF je naprosto nezbytná pro aktivní proliferaci kmenových buněk izolovaných z ependymu třetí a čtvrté komory předního mozku, stejně jako z míšního kanálu hrudní a bederní míchy.

Po disociaci se suspenze nervových kmenových buněk kultivuje v plastových miskách nebo vícejamkových destičkách bez adhezivního substrátu, aby se zvětšila velikost nově vytvořených neurosfér, což obvykle trvá asi 3 týdny. Metoda mnohočetné disperze a reprodukce neurosfér umožňuje získat dostatečný počet lineárních klonů multipotentních kmenových buněk pro intracerebrální transplantaci. Tento princip je také základem pro vytvoření banky kmenových buněk izolovaných z lidského embryonálního mozku. Jejich dlouhodobé (po dobu několika let) klonování umožňuje získat stabilní linie nervových kmenových buněk, z nichž se během indukované diferenciace tvoří katecholaminergní neurony.

Pokud se neurosféry nedispergují a nerostou na adhezivních substrátech v médiu bez růstových faktorů, proliferující kmenové buňky se začnou spontánně diferencovat a vytvářejí neuronální a gliové prekurzorové buňky exprimující markery všech typů nervových buněk: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (neurony), GFAP (astrocyty) a CalC, 04 (oligodendrocyty). Na rozdíl od myších a krysích buněk tvoří neurony v kulturách lidských nervových kmenových buněk více než 40 % všech diferencovaných buněk (u hlodavců od 1 do 5 %), ale oligodendrocytů se tvoří výrazně méně, což je z hlediska buněčné terapie demyelinizačních onemocnění velmi důležité. Problém se řeší přidáním kultivačního média B104, které stimuluje tvorbu buněk produkujících myelin.

Při kultivaci nervových progenitorových buněk z mozku lidských embryí v médiu obsahujícím EGF, bazický FGF a LIF se počet prekurzorových buněk nervové linie zvyšuje 10 milionůkrát. Buňky expandované in vitro si po transplantaci do mozku dospělých potkanů zachovávají schopnost migrace a diferenciace na nervové a gliové elementy. In vivo je však počet dělení multipotentních prekurzorových buněk omezený. Opakovaně bylo zmíněno, že Hayflickův limit pro „dospělou“ nervovou kmenovou buňku (asi 50 mitóz) je stále nedosažitelný i v experimentu – buňky ve formě neurosfér si zachovávají své vlastnosti pouze 7 měsíců a pouze po 8 pasážích. Předpokládá se, že je to způsobeno zvláštnostmi jejich disperzních metod během pasážování (trypsinizace nebo mechanické působení), které prudce snižují proliferační aktivitu buněk v důsledku narušení mezibuněčných kontaktů. Pokud se místo disperze použije metoda dělení neurosfér na 4 části, životaschopnost buněk během pasážování se výrazně zvyšuje. Tato metoda umožňuje kultivaci lidských nervových kmenových buněk po dobu 300 dnů. Po uplynutí této doby však buňky ztrácejí mitotickou aktivitu a podléhají degeneraci nebo vstupují do fáze spontánní diferenciace s tvorbou neuronů a astrocytů. Na tomto základě se autor domnívá, že 30 mitóz je maximální počet dělení pro kultivované nervové kmenové buňky.

Při kultivaci lidských nervových kmenových buněk in vitro se tvoří převážně GABAergní neurony. Bez zvláštních podmínek dávají nervové progenitorové buňky vznik dopaminergním neuronům (nezbytným pro buněčnou terapii Parkinsonovy choroby) pouze v prvních pasážích, po kterých se všechny neurony v kultuře skládají výhradně z GABAergních buněk. U hlodavců způsobují IL-1 a IL-11, stejně jako fragmenty membrán nervových buněk, LIF a GDNF, indukci dopaminergních neuronů in vitro. Tento metodologický přístup se však u lidí ukázal jako neúspěšný. Nicméně při intracerebrální transplantaci GABAergních neuronů in vivo pod vlivem faktorů mikroprostředí vznikají nervové buňky s různými fenotypy mediátorů.

Hledání kombinací neurotrofických faktorů ukázalo, že FGF2 a IL-1 indukují tvorbu dopaminergních neuroblastů, které však nejsou schopny produkovat dopaminergní neurony. Diferenciace hipokampálních kmenových buněk na excitační glutamatergní a inhibiční GABA-ergní neurony probíhá pod vlivem neurotrofinů a EGF a IGF1 indukují tvorbu glutamatergních a GABA-ergních neuronů z nervových progenitorových buněk lidských embryí. Postupné přidání kyseliny retinové a neurotrofinu 3 (NT3) do kultury významně zvyšuje diferenciaci zralých mozkových hipokampálních kmenových buněk na neurony různé mediátorové povahy, zatímco kombinace mozkového neurotrofického faktoru (BNDF), NT3 a GDNF může produkovat pyramidální neurony v hipokampálních a neokortikálních kulturách.

Výsledky četných studií tedy naznačují, že zaprvé, kmenové buňky z různých mozkových struktur jsou pod vlivem lokálních specifických tkáňových faktorů schopny diferenciace in vivo do neuronálních fenotypů, které jsou těmto strukturám vlastní. Zadruhé, cílená indukovaná diferenciace nervových kmenových buněk in vitro pomocí klonování progenitorových buněk umožňuje získat nervové a gliové buňky se specifickými fenotypovými charakteristikami pro intracerebrální transplantaci u různých forem mozkové patologie.

Není pochyb o tom, že pluripotentní kmenové buňky izolované z embryí nebo dospělého CNS lze považovat za zdroj nových neuronů a používat je v klinické praxi k léčbě neurologické patologie. Hlavní překážkou rozvoje praktické buněčné neurotransplantace je však skutečnost, že většina nervových kmenových buněk se po implantaci do neneurogenních zón zralého CNS nediferencuje na neurony. Pro obejití této překážky je navržena velmi originální inovativní metoda, která umožňuje in vitro získat čistou populaci neuronů z lidských fetálních nervových kmenových buněk po transplantaci do CNS dospělého potkana. Autoři dokazují, že diferenciace buněk implantovaných touto metodou končí tvorbou neuronů cholinergního fenotypu, což je způsobeno vlivem faktorů okolního mikroprostředí. Navrhovaná technologie je zajímavá z hlediska vývoje nových typů terapie založené na kmenových buňkách a nahrazování neuronů poškozených v důsledku poranění nebo neurodegenerativního onemocnění, protože cholinergní neurony hrají vedoucí roli ve vývoji motorických, paměťových a učebních funkcí. Zejména cholinergní neurony izolované z lidských kmenových buněk lze použít k nahrazení motorických neuronů ztracených při amyotrofické laterální skleróze nebo poranění míchy. V současné době neexistují žádné informace o metodách pro produkci významného počtu cholinergních neuronů z populace mitogenem preformovaných kmenových buněk. Autoři navrhují poměrně jednoduchou, ale účinnou metodu pro stimulaci mitogenem preformovaných primárních lidských embryonálních nervových kmenových buněk k vývoji v prakticky čisté neurony po implantaci do neurogenních i neurogenních zón CNS dospělého potkana. Nejdůležitějším výsledkem jejich práce je přeměna dostatečně velkého počtu transplantovaných buněk na cholinergní neurony při implantaci do střední membrány a míchy.

Kromě toho se pro preformaci nervových kmenových buněk z 8týdenní lidské embryonální mozkové kůry do cholinergních neuronů in vitro navrhuje použití různých kombinací následujících trofických faktorů a chemických prvků: rekombinantní bazický FGF, EGF, LIF, myší amino-terminální zdravý peptid (Shh-N), kyselina trans-retinová, NGF, BDNF, NT3, NT4, přírodní laminin a myší heparin. Původní linie lidských nervových kmenových buněk (K048) byla udržována in vitro po dobu dvou let a vydržela 85 pasáží bez změn proliferačních a diferenciačních vlastností při zachování normálního diploidního karyotypu. Nedispergované neurosféry z pasáží 19–55 (týdny 38–52) byly naneseny na poly-D-lysin a laminin a poté ošetřeny výše uvedenými faktory v různých koncentracích, kombinacích a sekvencích. Kombinace bazického FGF, heparinu a lamininu (zkráceně FHL) poskytla jedinečný účinek. Po jednom dni kultivace embryonálních nervových kmenových buněk v médiu FHL s nebo bez Shh-N (kombinace Shh-N + FHL ve zkratce SFHL) byla pozorována rychlá proliferace velkých planárních buněk. Všechny ostatní jednodenní protokoly (jako je základní FGF + laminin) naopak vedly k omezenému radiálnímu šíření vřetenovitě tvarovaných buněk a tyto buňky neopouštěly jádro neurosfér. Po 6 dnech aktivace a následných 10 dnech diferenciace v médiu obsahujícím B27 byly na okraji sfér aktivovaných FHL detekovány velké multipolární neuronům podobné buňky. V ostatních skupinách protokolů zůstala většina neuronům podobných buněk malá a bipolární nebo unipolární. Imunocytochemická analýza ukázala, že malé (

Autoři dále zjistili, že aktivace FHL nebo SFHL in vitro sama o sobě nevede k tvorbě zralých neuronů, a pokusili se zjistit, zda jsou kmenové buňky preformované FHL nebo SFHL schopné diferenciace na cholinergní neurony po transplantaci do CNS dospělých krys. Za tímto účelem byly aktivované buňky injikovány do neurogenní zóny (hipokampu) a do několika neneurogenních zón, včetně prefrontální kůry, střední membrány a míchy dospělých krys. Implantované buňky byly sledovány pomocí vektoru CAO-^^p. Je známo, že OCP značí buněčnou ultrastrukturu i buněčné procesy (molekulární úroveň) bez úniku a lze jej přímo vizualizovat. Neurální kmenové buňky značené OCP si navíc zachovávají profil neuronální a gliové diferenciace identický s profilem netransformovaných kmenových buněk embryonálního mozku.

Jeden až dva týdny po implantaci 5 x 10⁴ ^{aktivovaných} a značených nervových kmenových buněk byly tyto buňky nalezeny v míše nebo mozku potkanů, přičemž OCD+ buňky se nacházely převážně v blízkosti místa injekce. Migrační a integrační procesy byly pozorovány již jeden měsíc po transplantaci. Migrační limity se lišily v závislosti na místě injekce: při injekci do prefrontálního kortexu se OCD+ buňky nacházely 0,4–2 mm od místa injekce, zatímco v případě implantace do střední membrány, hipokampu nebo míchy migrovaly buňky na mnohem delší vzdálenosti – až 1–2 cm. Transplantované buňky byly lokalizovány ve vysoce organizovaných strukturách CNS, včetně frontálního kortexu, střední membrány, hipokampu a míchy. Neuronální elementy značené OCD byly viditelné již v prvním týdnu po transplantaci a jejich počet se významně zvýšil měsíc po operaci. Stereologická analýza ukázala vyšší míru přežití implantovaných buněk v různých strukturách mozku ve srovnání s míchou.

Je známo, že ve většině tkání dospělého savčího organismu je zachována populace regionálních kmenových buněk, jejichž transformace do zralých buněk je regulována specifickými tkáňovými faktory. Proliferace kmenových buněk, diferenciace progenitorových buněk a tvorba neuronálních fenotypů specifických pro danou mozkovou strukturu in vivo jsou v mnohem větší míře exprimovány v embryonálním mozku, což je dáno přítomností vysokých koncentrací morfogenetických faktorů lokálního mikroprostředí - neurotrofinů BDNF, NGF, NT3, NT4/5 a růstových faktorů FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Kde se nacházejí nervové kmenové buňky?

Bylo zjištěno, že nervové kmenové buňky exprimují gliový kyselý fibrilární protein, který je mezi zralými buňkami nervové linie zachován pouze na astrocytech. Astrocytické buňky proto mohou být rezervou kmenových buněk ve zralé CNS. Neurony pocházející z GFAP-pozitivních prekurzorů byly skutečně identifikovány v čichových bulbech a gyrus dentatus, což je v rozporu s tradičními představami o progenitorové roli radiální glie, která v dospělosti v gyrus dentatus GFAP neexprimuje. Je možné, že v CNS existují dvě populace kmenových buněk.

Otázka lokalizace kmenových buněk v subventrikulární zóně také zůstává nejasná. Podle některých autorů tvoří ependymální buňky v kultuře sférické klony, které nejsou pravými neurosférami (jako klony subependymálních buněk), protože jsou schopny diferenciace pouze na astrocyty. Na druhou stranu, po fluorescenčním nebo virovém značení ependymálních buněk je marker detekován v buňkách subependymální vrstvy a čichových bulbů. Takto značené buňky in vitro tvoří neurosféry a diferencují se na neurony, astrocyty a oligodendrocyty. Kromě toho bylo prokázáno, že asi 5 % buněk v ependymu exprimuje kmenové markery - nestin, Notch-1 a Mussashi-1. Předpokládá se, že mechanismus asymetrické mitózy je spojen s nerovnoměrným rozložením membránového receptoru Notch-1, v důsledku čehož tento zůstává na membráně dceřiné buňky lokalizované v ependymální zóně, zatímco mateřská buňka migrující do subependymální vrstvy je o tento receptor zbavena. Z tohoto hlediska lze subependymální zónu považovat za sběrač progenitorových prekurzorů neuronů a gliových buněk vytvořených z kmenových buněk ependymální vrstvy. Podle jiných autorů se v kaudálních částech subventrikulární zóny tvoří pouze gliové buňky a zdrojem neurogeneze jsou buňky rostrálně-laterální části. Ve třetí variantě je přední a zadní části subventrikulární zóny laterálních komor přidělen ekvivalentní neurogenní potenciál.

Čtvrtá varianta organizace kmenové rezervy v centrálním nervovém systému se jeví jako výhodnější, podle níž se v subventrikulární zóně rozlišují tři hlavní typy nervových progenitorových buněk - A, B a C. A-buňky exprimují časné neuronální markery (PSA-NCAM, TuJl) a jsou obklopeny B-buňkami, které jsou identifikovány jako astrocyty expresí antigenů. C-buňky, které nemají antigenní vlastnosti neuronů ani glie, mají vysokou proliferační aktivitu. Autor přesvědčivě prokázal, že B-buňky jsou prekurzory A-buněk a de novo neuronů čichových bulbů. Během migrace jsou A-buňky obklopeny vlákny nervových progenitorových buněk, což se významně liší od migračního mechanismu postmitotických neuroblastů podél radiální glie v embryonálním mozku. Migrace končí v čichových bulbech mitotickým dělením A i B buněk, jejichž deriváty jsou začleněny do vrstev granulárních buněk a do glomerulární vrstvy čichové zóny mozku.

Vyvíjející se embryonální mozek postrádá diferencované ependymální buňky a stěny komor obsahují proliferující kmenové buňky germinální a subventrikulární zóny komor, kudy migrují primární neuro- a glioblasty. Na základě toho se někteří autoři domnívají, že subependymální oblast zralého mozku obsahuje redukovanou embryonální germinální nervovou tkáň sestávající z astrocytů, neuroblastů a neidentifikovaných buněk. Pravé nervové kmenové buňky tvoří méně než 1 % buněk v germinální zóně laterální stěny komor. Částečně z tohoto důvodu a také v souvislosti s údaji, že astrocyty subependymální zóny jsou prekurzory nervových kmenových buněk, není vyloučena možnost transdiferenciace astrocytárních gliových elementů se získáním neuronálních fenotypových charakteristik.

Hlavní překážkou konečného řešení problému lokalizace nervových kmenových buněk in vivo je nedostatek specifických markerů pro tyto buňky. Z praktického hlediska jsou nicméně velmi zajímavé zprávy o izolaci nervových kmenových buněk z oblastí CNS, které neobsahují subependymální zóny - třetí a čtvrtá komora předního mozku, páteřní kanál hrudní a bederní oblasti míchy. Zvláště důležitá je skutečnost, že poranění míchy zvyšuje proliferaci ependymálních kmenových buněk centrálního kanálu s tvorbou progenitorových buněk migrujících a diferencujících se do astrocytů gliomesodermální jizvy. Kromě toho byly v nepoškozené míše dospělých krys nalezeny také prekurzorové buňky astro- a oligodendrocytů.

Literární data tak přesvědčivě prokazují přítomnost regionální kmenové rezervy v CNS dospělých savců, včetně člověka, jejíž regeneračně-plastická kapacita je bohužel schopna zajistit pouze procesy fyziologické regenerace s tvorbou nových neuronálních sítí, ale neodpovídá potřebám reparativní regenerace. To klade úkol hledat možnosti, jak zvýšit kmenové zdroje CNS exogenními prostředky, což je neřešitelné bez jasného pochopení mechanismů formování CNS v embryonálním období.

Dnes víme, že během embryonálního vývoje jsou kmenové buňky neurální trubice zdrojem tří typů buněk - neuronů, astrocytů a oligodendrocytů, tj. neurony a neuroglie vznikají z jediné prekurzorové buňky. Diferenciace ektodermu do shluků nervových progenitorových buněk začíná pod vlivem produktů proneurálních genů rodiny bHLH a je blokována expresí derivátů receptorových transmembránových proteinů genů rodiny Notch, které omezují determinaci a časnou diferenciaci nervových prekurzorových buněk. Ligandy receptorů Notch jsou zase transmembránové proteiny Delta sousedních buněk, díky jejichž extracelulární doméně dochází k přímým mezibuněčným kontaktům s indukční interakcí mezi kmenovými buňkami.

Další implementace programu embryonální neurogeneze není o nic méně složitá a zdá se, že by měla být druhově specifická. Výsledky studií neuroxenotransplantace však naznačují, že kmenové buňky mají výrazný evoluční konzervatismus, díky kterému jsou lidské nervové kmenové buňky schopny migrovat a vyvíjet se po transplantaci do mozku potkanů.

Je známo, že CNS savců má extrémně nízkou kapacitu reparativní regenerace, která se vyznačuje absencí jakýchkoli známek vzniku nových buněčných elementů ve zralém mozku, které by nahradily neurony odumřelé v důsledku poranění. V případě transplantace neuroblastů se však tyto nejen uchytí, proliferují a diferencují, ale jsou také schopny integrovat se do mozkových struktur a funkčně nahradit ztracené neurony. Při transplantaci komitovaných neuronálních progenitorových buněk byl terapeutický účinek výrazně slabší. Bylo prokázáno, že takové buňky mají nízkou kapacitu migrace. Neuronální progenitorové buňky navíc nereprodukují architekturu neuronových sítí a nejsou funkčně integrovány do mozku příjemce. V tomto ohledu se aktivně studují otázky reparativně-plastické regenerace během transplantace neformovaných multipotentních nervových kmenových buněk.

Ve studii M. Aleksandrovové a kol. (2001) byly v první verzi experimentů příjemci pohlavně zralé samice potkanů a dárci 15denní embrya. Příjemcům byl odebrán řez okcipitální kůry mozku a do dutiny byla transplantována mechanicky suspendovaná tkáň presumptivní embryonální kůry obsahující multipotentní kmenové buňky ventrikulární a subventrikulární oblasti. Ve druhé verzi experimentů byly nervové kmenové buňky 9týdenního lidského embrya transplantovány do mozku pohlavně zralých potkanů. Autoři izolovali kousky tkáně z periventrikulární oblasti embryonálního mozku, umístili je do živného média F-12 a opakovaným pipetováním získali buněčnou suspenzi, kterou poté kultivovali ve speciálním médiu NPBM s přídavkem růstových faktorů - FGF, EGF a NGF. Buňky byly pěstovány v suspenzní kultuře do vytvoření neurosfér, které byly dispergovány a znovu zasazeny do kultury. Po 4 pasážích s celkovou kultivační dobou 12-16 dnů byly buňky použity k transplantaci. Příjemci byla desetidenní mláďata potkanů a pohlavně zralé dvouměsíční krysy kmene Wistar, kterým byly do laterální mozkové komory bez imunosuprese injekčně podány 4 μl suspenze lidských nervových kmenových buněk. Výsledky práce ukázaly, že disociované buňky ventrikulární a subventrikulární zóny embryonálního anláže mozkové kůry potkanů pokračovaly ve svém vývoji během alotransplantace do zralého mozku, tj. faktory mikroprostředí diferencovaného mozku příjemce neblokovaly růst a diferenciaci nervových kmenových buněk embrya. V raných stádiích po transplantaci multipotentní buňky pokračovaly v mitotickém dělení a aktivně migrovaly z transplantační oblasti do mozkové tkáně příjemce. Transplantované embryonální buňky s obrovským migračním potenciálem byly nalezeny téměř ve všech vrstvách mozkové kůry příjemce podél transplantační dráhy a v bílé hmotě. Délka migrační dráhy nervových buněk byla vždy výrazně kratší (až 680 μm) než délka gliových elementů (až 3 mm). Krevní cévy a vláknité struktury mozku sloužily jako strukturální vektory pro migraci astrocytů, což bylo zaznamenáno i v jiných studiích.

Dříve se věřilo, že akumulace značených astrocytů v oblasti poškození mozkové kůry příjemce může souviset s tvorbou gliové bariéry mezi tkáněmi transplantátu a příjemcem. Studie struktury kompaktně umístěných buněčných transplantátů však ukázala, že jejich cytoarchitektura je charakterizována chaosem, bez vrstevnatého rozložení transplantovaných buněk. Stupeň uspořádanosti transplantovaných neuronů se blížil stupni uspořádanosti normálních buněk mozkové kůry pouze při absenci gliové bariéry mezi tkáněmi dárce a příjemce. Jinak byla struktura transplantovaných buněk atypická a samotné neurony podléhaly hypertrofii. Pomocí neuroimunochemické typizace transplantovaných buněk byly v transplantátech nalezeny inhibiční GABA-ergní neurony a detekována exprese proteinů PARV, CALB a NPY. Zralý mozek si tak zachovává faktory mikroprostředí schopné podporovat proliferaci, migraci a specifickou diferenciaci nervových multipotentních buněk.

V kultuře lidských kmenových buněk izolovaných z periventrikulární oblasti mozku 9týdenních embryí M. Aleksandrova a kol. (2001) zjistili ve čtvrté pasáži velké množství nestin-pozitivních multipotentních buněk, z nichž některé již prošly in vitro diferenciací a vyvíjely se podle neuronálního typu, což odpovídalo výsledkům studií jiných autorů. Po transplantaci do mozku dospělých potkanů se kultivované lidské kmenové buňky mitoticky dělily a migrovaly do tkáně xenogenního mozku příjemce. V buněčných transplantacích autoři pozorovali dvě populace buněk - malou a větší. Ty migrovaly jak v parenchymu, tak podél vláknitých struktur mozku příjemce na nevýznamné vzdálenosti - do 300 μm. Největší rozsah migrační dráhy (až 3 mm) byl charakteristický pro malé buňky, z nichž některé se diferencovaly na astrocyty, což bylo stanoveno pomocí monoklonálních protilátek proti GFAP. Oba typy buněk byly nalezeny ve stěně laterální komory, což naznačuje, že transplantované buňky vstoupily do rostrálního migračního traktu. Astrocytické deriváty nervových kmenových buněk z lidí i potkanů migrovaly převážně krevními kapilárami a vláknitými strukturami mozku příjemce, což se shoduje s údaji jiných autorů.

Analýza diferenciace lidských kmenových buněk in vivo s použitím monoklonálních protilátek proti GFAP, CALB a VIM odhalila tvorbu astrocytů i neuronů. Na rozdíl od buněk v transplantacích potkanů bylo mnoho lidských kmenových buněk vimentin-pozitivních. V důsledku toho některé z lidských multipotentních buněk neprošly diferenciací. Titíž autoři následně prokázali, že lidské nervové kmenové buňky transplantované bez imunosuprese přežívají v mozku potkanů 20 dní po transplantaci bez známek imunitní agrese ze strany gliových elementů zralého mozku.

Bylo zjištěno, že i nervové kmenové buňky drozofily se uchytí a diferencují v mozku taxonu tak vzdáleného hmyzu, jako je krysa. Správnost autorova experimentu je nepochybná: transgenní linie drozofily obsahovaly geny pro lidské neurotrofické faktory NGF, GDNF, BDNF, vložené do vektoru CaSper pod promotor tepelného šoku drozofily, takže tělesná teplota savců automaticky vyvolávala jejich expresi. Autoři identifikovali buňky drozofily pomocí produktu bakteriálního genu galaktosidázy pomocí histochemického barvení X-Gal. Kromě toho se ukázalo, že nervové kmenové buňky drozofily specificky reagují na neurotrofické faktory kódované lidskými geny: při xenotransplantaci buněk transgenní linie drozofily obsahující gen gdnf se syntéza tyrosinhydroxylázy v jejích diferencujících se nervových kmenových buňkách prudce zvýšila a buňky s genem ngf aktivně produkovaly acetylcholinesterázu. Xenotransplantát indukoval podobné genově závislé reakce v alotransplantátu embryonální nervové tkáně transplantované společně s ním.

Znamená to, že specifická diferenciace nervových kmenových buněk je indukována druhově nespecifickými neurotrofickými faktory? Podle výsledků autorů měly neurotrofické faktory produkující xenografty specifický vliv na osud alograftů, které se v tomto případě vyvíjely intenzivněji a byly 2–3krát větší než alografty zavedené do mozku bez přidání xenograftů. V důsledku toho mají xenograftové buňky obsahující geny pro neurotrofiny, zejména gen kódující lidský neurotrofický faktor odvozený z gliových buněk (GDNF), druhově nespecifický vliv na vývoj alograftu, podobný účinku odpovídajícího neurotrofinu. Je známo, že GDNF zvyšuje přežití dopaminergních neuronů v embryonálním středním mozku potkanů a zvyšuje metabolismus dopaminu těmito buňkami a indukuje diferenciaci buněk pozitivních na tyrozinhydroxylázu, čímž zvyšuje růst axonů a zvětšuje velikost těla neuronální buňky. Podobné účinky jsou pozorovány také v kultivovaných dopaminergních neuronech středního mozku potkanů.

Aktivní migrace lidských nervových kmenových buněk je pozorována po xenotransplantaci do mozku dospělých potkanů. Je známo, že proces migrace a diferenciace nervových kmenových buněk je řízen sadou speciálních genů. Iniciační migrační signál prekurzorové buňce k zahájení diferenciace je dán proteinovým produktem protoonkogenu c-ret spolu s GDNF. Další signál pochází z genu mash-1, který řídí volbu cesty buněčného vývoje. Specifická reakce diferencujících se buněk navíc závisí také na a-receptoru ciliárního neurotrofického faktoru. Vzhledem ke zcela odlišné genetické konstituci xenogenních lidských nervových kmenových buněk a mozkových buněk recipientního potkanů je tedy nutné uznat nejen druhovou nespecificitnost neurotrofických faktorů, ale také nejvyšší evoluční konzervatismus genů zodpovědných za specifickou diferenciaci elementů nervových kmenových buněk.

Budoucnost ukáže, zda bude xenotransplantace embryonálního neuromateriálu možná v neurochirurgické praxi léčby neurodegenerativních patologických procesů způsobených narušením syntézy myelinu oligodendrocyty. Mezitím jsou nejintenzivněji řešenými otázkami neurotransplantace ty, které souvisejí se získáváním alogenních nervových kmenových buněk z embryonálního nebo zralého mozku v kultuře s jejich následnou řízenou diferenciací na neuroblasty nebo specializované neurony.

Transplantace nervových kmenových buněk

Pro stimulaci proliferace a diferenciace nervových kmenových buněk dospělého organismu lze transplantovat embryonální nervovou tkáň. Je možné, že kmenové buňky embryonální nervové tkáně přinesené s alograftem mohou samy podléhat proliferaci a diferenciaci. Je známo, že po poranění míchy dochází k regeneraci nervových vodičů prodloužením poškozených axonů a kolaterálním pučením axonů nepoškozených výběžků motorických neuronů. Hlavními faktory, které brání regeneraci míchy, jsou tvorba jizvy pojivové tkáně v oblasti poškození, dystrofické a degenerativní změny centrálních neuronů, deficit NGF a přítomnost produktů rozpadu myelinu v oblasti poškození. Bylo prokázáno, že transplantace různých typů buněk do poškozené míchy - fragmentů sedacího nervu dospělých zvířat, embryonální okcipitální kůry, hipokampu, míchy, Schwannových buněk, astrocytů, mikroglií, makrofágů, fibroblastů - podporuje regeneraci poškozených axonů pučením a umožňuje nově vytvořeným axonům růst zónou poranění míchy. Experimentálně bylo prokázáno, že transplantace embryonální nervové tkáně do oblasti poranění míchy působením neurotrofických faktorů urychluje růst poškozených axonů, zabraňuje tvorbě gliové jizvy a rozvoji dystrofických a degenerativních procesů v centrálních neuronech, zatímco buňky transplantované embryonální nervové tkáně přežívají v míše, integrují se s přilehlými tkáněmi a podporují růst axonů v oblasti poranění s tvorbou dendritických synapsí na spinálních neuronech.

Tato oblast regenerativně-plastické medicíny zaznamenala na Ukrajině největší rozvoj díky práci vědeckého týmu vedeného V. I. Tsymbaljukem. V první řadě se jedná o experimentální studie účinnosti transplantace embryonální nervové tkáně u poranění míchy. Během autotransplantace periferního nervu autoři pozorovali nejvýraznější destruktivní změny v distální zóně švu, kde byly 30. den po operaci kombinovány s reparativními procesy. Během alotransplantace byl morfofunkční stav implantovaného nervu 30. den charakterizován výraznou destrukcí s tukovou degenerací a amyloidózou na pozadí fokální zánětlivé infiltrace lymfoidních buněk s převažující atrofií Schwannových buněk. Transplantace embryonální nervové tkáně ve větší míře přispěla k obnovení vodivosti míchy, zejména u zvířat, která podstoupila operaci během prvních 24 hodin po poranění: na pozadí snížení intenzity zánětlivých a destruktivních procesů, hypertrofie a hyperplazie proteiny syntetizujících a energii produkujících ultrastrukturálních prvků spinálních neuronů byla pozorována hypertrofie a hyperplazie oligodendrocytů, amplituda svalového akčního potenciálu byla obnovena o 50 % a rychlost vedení impulsu o 90 %. Při hodnocení účinnosti transplantace embryonální nervové tkáně v závislosti na transplantační zóně bylo zjištěno, že nejlepší výsledky byly pozorovány při zavedení štěpu přímo do zóny poranění míchy. Při úplné transekci míchy byla transplantace embryonální nervové tkáně neúčinná. Dynamické studie ukázaly, že optimální dobou pro provedení transplantace embryonální nervové tkáně je prvních 24 hodin po poranění míchy, zatímco provedení operace v období výrazných sekundárních ischemicko-zánětlivých změn, ke kterým dochází 2. až 9. den po poranění, by mělo být považováno za nevhodné.

Je známo, že těžké traumatické poranění mozku vyvolává silnou a prodlouženou aktivaci lipidové peroxidace v počátečních a středních stádiích posttraumatického období, a to jak v poškozené mozkové tkáni, tak v celém těle, a také narušuje procesy energetického metabolismu v poraněném mozku. Za těchto podmínek transplantace embryonální nervové tkáně do oblasti traumatického poranění podporuje stabilizaci procesů lipidové peroxidace a zvyšuje potenciál antioxidačního systému mozku a celého těla, posiluje jeho antiradikálovou ochranu 35.–60. den posttraumatického období. Ve stejném období po transplantaci embryonální nervové tkáně se normalizují energetický metabolismus a procesy oxidativní fosforylace v mozku. Kromě toho bylo prokázáno, že první den po experimentálním traumatickém poranění mozku se impedance tkáně poraněné hemisféry snižuje o 30–37 %, kontralaterální o 20 %, což naznačuje rozvoj generalizovaného mozkového edému. U zvířat, která podstoupila transplantaci embryonální nervové tkáně, došlo k involuci edému výrazně rychleji - již sedmý den dosáhla průměrná hodnota impedance tkání poraněné hemisféry 97,8 % kontrolní úrovně. Navíc úplné obnovení hodnot impedance 30. den bylo zaznamenáno pouze u zvířat, která podstoupila transplantaci embryonální nervové tkáně.

Odumírání některých neuronů v mozku po těžkém kraniocerebrálním poranění je jednou z hlavních příčin posttraumatických komplikací. Obzvláště citlivé na poranění jsou neurony integrujícího se dopaminergního a noradrenergního systému středního mozku a prodloužené míchy. Pokles hladiny dopaminu ve striopallidálním komplexu a mozkové kůře významně zvyšuje riziko vzniku motorických a duševních poruch, epileptiformních stavů a snížení produkce dopaminu v hypotalamu může být příčinou četných vegetativních a somatických poruch pozorovaných v pozdním posttraumatickém období. Výsledky studií provedených u experimentálního kraniocerebrálního poranění naznačují, že transplantace embryonální nervové tkáně pomáhá obnovit hladiny dopaminu v poraněné mozkové hemisféře, dopaminu a norepinefrinu v hypotalamu a zvýšit hladiny norepinefrinu a dopaminu ve středním mozku a prodloužené míše. Kromě toho se v důsledku transplantace embryonální nervové tkáně do poraněné hemisféry mozku pokusných zvířat normalizuje procentuální poměr fosfolipidů a zvyšuje se obsah mastných kyselin (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Tato data potvrzují stimulaci regeneračně-plastických procesů transplantovanou embryonální nervovou tkání a naznačují reparačně-trofický účinek transplantátu na mozek příjemce jako celek.

Zvláštní pozornost si zaslouží klinické zkušenosti personálu Neurochirurgického ústavu A. P. Romodanova Akademie lékařských věd Ukrajiny s transplantací embryonální nervové tkáně u mozkové obrny, což je extrémně složitá patologii s těžkou motorickou dysfunkcí. Klinické formy mozkové obrny závisí na úrovni poškození integrálních struktur zodpovědných za regulaci svalového tonusu a tvorbu motorických stereotypů. V současné době existuje dostatek důkazů, které podporují skutečnost, že patologické změny v striopalidálně-thalamokortikálním systému motorické kontroly hrají důležitou roli v poruchách motorických funkcí a svalového tonusu. Striopalidální článek tohoto systému vykonává kontrolní funkci prostřednictvím nigrostriatální produkce dopaminu. Přímá cesta k realizaci talamokortikální kontroly začíná od neuronů putamenu, je zprostředkována kyselinou gama-aminomáselnou (GABA) a substancí P a je promítána přímo do motorické zóny vnitřního segmentu globus pallidus a substantia nigra. Nepřímá dráha, jejíž účinek je realizován za účasti GABA a enkefalinu, vychází z neuronů putamenu a ovlivňuje jádra bazálních ganglií prostřednictvím sekvence spojení zahrnujících zevní segment globus pallidus a subthalamické jádro. Poruchy vodivosti přímé dráhy způsobují hypokinezi, zatímco snížení vodivosti struktur nepřímé dráhy vede k hyperkinezi s odpovídajícími změnami svalového tonusu. Integrita GABAergních vodivých drah na různých úrovních systému motorické kontroly a integrace dopaminergních spojení na úrovni putamenu jsou nezbytné pro regulaci thalamokortikálních interakcí. Nejčastějším projevem motorické patologie u různých forem mozkové obrny je porušení svalového tonusu a s tím úzce související změna reflexní svalové aktivity.

Transplantace embryonální nervové tkáně u mozkové obrny vyžaduje důkladnou analýzu povahy poškození mozkových struktur. Na základě stanovení hladin dopaminu a GABA v subarachnoidálním mozkomíšním moku autoři podrobně popsali úroveň narušení integrace funkčních mozkových struktur, což umožnilo objektivizovat výsledky chirurgického zákroku a korigovat opakované neurotransplantace. Embryonální nervová tkáň (materiál z potratu 9týdenního embrya) byla transplantována do parenchymu kůry precentrálních závitů mozkových hemisfér v závislosti na závažnosti atrofických změn. V pooperačním období nebyly pozorovány žádné komplikace ani zhoršení stavu pacientek. Pozitivní dynamika byla zaznamenána u 63 % pacientek se spastickými formami, u 82 % dětí s atonicko-estetickou formou a pouze u 24 % pacientek se smíšenou formou onemocnění. Byl zjištěn negativní vliv vysoké úrovně neurosenzibilizace s přítomností autoprotilátek proti neurospecifickým proteinům na výsledky operace. Transplantace embryonální nervové tkáně se ukázala jako neúčinná u pacientů ve věku 8-10 let a starších, stejně jako v případech těžkého hyperkinetického syndromu a epilepsie. Klinicky se účinnost transplantace embryonální nervové tkáně u pacientů se spastickou formou dětské mozkové obrny projevila tvorbou nových statomotorických dovedností a volních pohybů s korekcí patologického motorického stereotypu a snížením stupně spasticity, patologických postojů a postojů. Autoři se domnívají, že pozitivní efekt transplantace embryonální nervové tkáně je výsledkem normalizačního účinku na funkční aktivitu supraspinálních struktur zapojených do regulace posturálního tonusu a volních pohybů. Zároveň jsou pozitivní klinické účinky transplantace embryonální nervové tkáně doprovázeny poklesem obsahu neurotransmiterů v subarachnoidálním mozkomíšním moku, což naznačuje obnovení integrálních interakcí postižených mozkových struktur.

Existuje ještě jedna závažná forma neurologické patologie - apalický syndrom, jehož problém léčby bohužel zdaleka není vyřešen. Apalický syndrom je polyetiologický subakutní nebo chronický stav, který vzniká v důsledku závažných organických lézí centrálního nervového systému (hlavně mozkové kůry) a je charakterizován rozvojem panapraxie a panagnosie s relativně zachovanou funkcí segmentálně-kmenových úseků a formací limbicko-retikulárního komplexu mozku. Následné studie (od 1 roku do 3 let) ukázaly, že apalický syndrom není konečnou diagnózou přetrvávajícího poškození nervového systému u dětí, ale transformuje se buď do organické demence, nebo do chronického vegetativního stavu. Na oddělení restorativní neurochirurgie Neurochirurgického ústavu A. P. Romodanova Akademie lékařských věd Ukrajiny podstoupilo 21 pacientů s následky apalického syndromu transplantaci embryonální nervové tkáně. V celkové anestezii byl korunkovým vrtákem vytvořen otvor v oblasti nejvýraznějších atrofických změn odhalených počítačovou tomografií nebo magnetickou rezonancí a v případě difúzní atrofie šedé nebo bílé hmoty byl transplantát zaveden do precentrálního a centrálního gyru mozku. Po otevření dura mater byly pomocí speciálního zařízení intrakortikálně implantovány kousky tkáně ze senzomotorické kůry 8-9týdenních embryí. Počet implantovaných vzorků tkáně se pohyboval od 4 do 10, což bylo dáno velikostí otvoru a velikostí lokálních změn v mozkové hmotě. Na rozdíl od jiných typů patologií se autoři u apalického syndromu snažili implantovat co nejvíce embryonální tkáně do nejpřístupnějších oblastí mozku. Dura mater byla zašita a provedena plastická operace defektu lebky. Během operace se u všech pacientů objevily významné změny jak v kůře (atrofie, absence závitů, změna barvy a pulzace mozkové hmoty), tak i v mozkových plenách (ztluštění tvrdé pleny mozkové, významné ztluštění arachnoideální membrány s přítomností vlastních cév, srůst membrán s podkladovou mozkovou hmotou). Tyto změny byly výraznější u pacientů s anamnézou zánětlivých mozkových lézí. U pacientů, kteří prodělali hypoxii CNS, převládaly difúzní atrofické změny v mozkové hmotě, zejména v kůře, se zvětšením subarachnoidálního prostoru, bez významných změn v mozkových plenách. Polovina pacientů měla zvýšené krvácení do měkkých tkání, kostí a mozkové hmoty. Po operacích se v průběhu šesti měsíců až tří let stav zlepšil u 16 pacientů a u pěti pacientů zůstal nezměněn. Pozitivní dynamika byla pozorována jak v motorické, tak v mentální sféře. Svalový tonus se snížil u deseti pacientů, u 11 pacientů se zvýšila motorická aktivita (snížení parézy,(zlepšila se koordinace pohybů), u pěti dětí se významně zvýšila manipulační schopnost horních končetin. U čtyř pacientů se snížila frekvence a závažnost epileptických záchvatů a u jednoho dítěte se během celého sledovacího období po operaci nevyskytly žádné záchvaty. U dvou dětí se snížila agrese, u dvou pacientů s těžkými bulbárními poruchami se zlepšil akt polykání, dvě děti byly schopny samostatně žvýkat již 2 týdny po operaci. Byl zaznamenán pokles závažnosti duševních poruch, devět dětí se po operaci zklidnilo, u sedmi pacientů se zlepšil spánek a pozornost. Tři pacienti s následky apalického syndromu začali rozpoznávat své rodiče, jeden - plnit pokyny, dva - vyslovovat slova, u tří se snížil stupeň dysartrie. Autoři poznamenávají, že znatelné zlepšení stavu pacientů začíná 2 měsíce po operaci, maxima dosahuje do 5-6 měsíců, poté se tempo zlepšení zpomaluje a do konce roku se proces stabilizuje u 50 % pacientů. Pozitivní efekt neurotransplantace sloužil jako základ pro opakovanou operaci u šesti pacientů s následky apalického syndromu, ale na druhé hemisféře mozku. Technika a metody druhé transplantace byly shodné s těmi u první operace, ale klinický efekt druhé operace byl nižší, ačkoli po prvním ani druhém chirurgickém zákroku nevznikly žádné závažné komplikace. Podle autorů je mechanismus terapeutického účinku neurotransplantace spojen s neurotrofickým účinkem transplantované embryonální nervové tkáně, která obsahuje velké množství růstových, hormonálních a dalších biologicky aktivních látek stimulujících reparaci poškozených neuronů a plastickou reorganizaci mozkové tkáně příjemce. Možný je také aktivační účinek na aktivitu nervových buněk, které byly dříve morfologicky zachovány, ale v důsledku onemocnění ztratily svou funkční aktivitu. Právě rychlý neurotrofický účinek může vysvětlit zlepšení bulbárních funkcí u některých dětí již na konci prvního nebo druhého týdne po operaci. Předpokládá se, že kromě toho se do třetího nebo čtvrtého měsíce vytvoří morfofunkční spojení mezi transplantátem a mozkem hostitele, kterým neurotransplantát nahrazuje funkce odumřelých mozkových buněk, což je substrát pro zlepšení motorických i psychických funkcí pacientů. Dvě děti byly schopny samostatně žvýkat již 2 týdny po operaci. Byl zaznamenán pokles závažnosti duševních poruch, devět dětí se po operaci zklidnilo, u sedmi pacientů se zlepšil spánek a pozornost. Tři pacienti s následky apalického syndromu začali rozpoznávat své rodiče, jeden - plnit pokyny, dva - vyslovovat slova.U tří se stupeň dysartrie snížil. Autoři poznamenávají, že znatelné zlepšení stavu pacientů začíná 2 měsíce po operaci, dosahuje maxima do 5-6 měsíců, poté se tempo zlepšení zpomaluje a do konce roku se proces u 50 % pacientů stabilizuje. Pozitivní efekt neurotransplantace sloužil jako základ pro opakovanou operaci u šesti pacientů s následky apalického syndromu, ale na druhé hemisféře mozku. Technika a metoda druhé transplantace byly shodné s technikou první operace, ale klinický efekt druhé operace byl nižší, ačkoli po prvním ani druhém chirurgickém zákroku nedošlo k žádným závažným komplikacím. Podle autorů je mechanismus terapeutického účinku neurotransplantace spojen s neurotrofickým účinkem transplantované embryonální nervové tkáně, která obsahuje velké množství růstových, hormonálních a dalších biologicky aktivních látek stimulujících reparaci poškozených neuronů a plastickou reorganizaci mozkové tkáně příjemce. Možný je také aktivační účinek na aktivitu nervových buněk, které byly dříve morfologicky zachovány, ale v důsledku onemocnění ztratily svou funkční aktivitu. Právě rychlý neurotrofický efekt může vysvětlit zlepšení bulbárních funkcí u některých dětí již na konci prvního nebo druhého týdne po operaci. Předpokládá se, že spolu s tím se do třetího nebo čtvrtého měsíce vytvářejí morfofunkční spojení mezi transplantátem a mozkem hostitele, kterými neurotransplantát nahrazuje funkce odumřelých mozkových buněk, což je substrát pro zlepšení motorických i psychických funkcí pacientů. Dvě děti byly schopny samostatně žvýkat již 2 týdny po operaci. Byl zaznamenán pokles závažnosti duševních poruch, devět dětí se po operaci zklidnilo, u sedmi pacientů se zlepšil spánek a pozornost. Tři pacienti s následky apalického syndromu začali rozpoznávat své rodiče, jeden - plnit pokyny, dva - vyslovovat slova, u tří se snížil stupeň dysartrie. Autoři poznamenávají, že znatelné zlepšení stavu pacientů začíná 2 měsíce po operaci, maxima dosahuje do 5-6 měsíců, poté se tempo zlepšení zpomaluje a do konce roku se proces stabilizuje u 50 % pacientů. Pozitivní efekt neurotransplantace sloužil jako základ pro opakovanou operaci u šesti pacientů s následky apalického syndromu, ale na druhé hemisféře mozku. Technika a metoda druhé transplantace byly shodné s první operací, ale klinický efekt druhé operace byl nižší, ačkoli po prvním ani druhém chirurgickém zákroku nedošlo k žádným závažným komplikacím. Podle autorů,Mechanismus terapeutického účinku neurotransplantace je spojen s neurotrofickým účinkem transplantované embryonální nervové tkáně, která obsahuje velké množství růstových, hormonálních a dalších biologicky aktivních látek stimulujících reparaci poškozených neuronů a plastickou reorganizaci mozkové tkáně příjemce. Možný je také aktivační účinek na aktivitu nervových buněk, které byly dříve morfologicky zachovány, ale v důsledku onemocnění ztratily svou funkční aktivitu. Právě rychlý neurotrofický účinek může vysvětlit zlepšení bulbárních funkcí u některých dětí již na konci prvního nebo druhého týdne po operaci. Předpokládá se, že spolu s tím se do třetího nebo čtvrtého měsíce vytvářejí morfofunkční spojení mezi transplantátem a mozkem hostitele, kterými neurotransplantát nahrazuje funkce odumřelých mozkových buněk, což je substrát pro zlepšení motorických i psychických funkcí pacientů, ačkoli po prvním ani druhém chirurgickém zákroku nevznikly žádné závažné komplikace. Podle autorů je mechanismus terapeutického účinku neurotransplantace spojen s neurotrofickým účinkem transplantované embryonální nervové tkáně, která obsahuje velké množství růstových, hormonálních a dalších biologicky aktivních látek stimulujících reparaci poškozených neuronů a plastickou reorganizaci mozkové tkáně příjemce. Možný je také aktivační účinek na aktivitu nervových buněk, které byly dříve morfologicky zachovány, ale v důsledku onemocnění ztratily svou funkční aktivitu. Právě rychlý neurotrofický účinek může vysvětlit zlepšení bulbárních funkcí u některých dětí již na konci prvního nebo druhého týdne po operaci. Předpokládá se, že spolu s tím do třetího nebo čtvrtého měsíce dochází k navázání morfofunkčních spojení mezi transplantátem a mozkem hostitele, kterými neurotransplantát nahrazuje funkce odumřelých mozkových buněk, což je substrát pro zlepšení motorických i psychických funkcí pacientů, ačkoli po prvním ani druhém chirurgickém zákroku nevznikly žádné závažné komplikace. Podle autorů je mechanismus terapeutického účinku neurotransplantace spojen s neurotrofickým účinkem transplantované embryonální nervové tkáně, která obsahuje velké množství růstových, hormonálních a dalších biologicky aktivních látek stimulujících reparaci poškozených neuronů a plastickou reorganizaci mozkové tkáně příjemce. Možný je i aktivační účinek na aktivitu nervových buněk, které byly dříve morfologicky zachovány, ale v důsledku onemocnění ztratily svou funkční aktivitu.Právě rychlý neurotrofický efekt může vysvětlit zlepšení bulbárních funkcí u některých dětí již na konci prvního nebo druhého týdne po operaci. Předpokládá se, že spolu s tím se do třetího nebo čtvrtého měsíce vytvářejí morfofunkční spojení mezi transplantátem a mozkem hostitele, kterými neurotransplantát nahrazuje funkce odumřelých mozkových buněk, což je substrát pro zlepšení motorických i psychických funkcí pacientů.

Experimentálně byl studován vliv transplantace embryonální nervové tkáně na reorganizaci interneuronálních propojení. Autoři zkoumali vzorce obnovy intermodulárních axonálních spojení v oblasti mechanického poškození mozkové kůry u bílých krys s transplantací a bez transplantace embryonální nervové tkáně za použití fluorescenční lipofilní značky DIL (1,1-dioktadecyl-3,3,33'-tetramethylindokarbokyanin perchlorát) a konfokálního laserového skenování. Bylo zjištěno, že zavedení embryonální nervové tkáně do oblasti poškození zajišťuje růst axonů, které se po průchodu transplantátem spojí s přilehlou mozkovou tkání, zatímco bez transplantace embryonální nervové tkáně je oblast poškození nepřekonatelnou překážkou pro rostoucí axony. V této práci byla provedena transplantace embryonálního (15.-17. den gestace) neokortexu. Výsledky získané autory jsou dalším důkazem ve prospěch aktivního vlivu transplantace embryonální nervové tkáně na posttraumatickou reorganizaci interneuronálních vztahů sousedních strukturních a funkčních modulů mozkové kůry. Transplantace embryonální nervové tkáně zajišťuje částečné obnovení spojení mezi poškozenými oblastmi mozkové kůry vytvořením příznivých podmínek pro růst axonů v zóně působení neurotrofických faktorů transplantátu. Existence takového efektu byla experimentálně prokázána a v literatuře je diskutována jako důkaz vysokých plastických schopností poškozeného mozku pohlavně dospělých zvířat. V tomto ohledu je transplantace buněk v současné době považována za optimální terapeutickou strategii pro obnovení funkce poškozeného lidského CNS.

Data získaná autory o účinnosti využití embryonální nervové tkáně mozku jako exogenního transplantačního média pro růst axonů potvrzují perspektivy cíleného vytváření komunikačních vazeb mezi intaktními sousedními oblastmi mozku. Práce zabývající se studiem vlivu transplantace nervové tkáně na dynamiku funkčních parametrů centrálního nervového systému se jeví jako relevantní. Úkolem práce bylo zkoumat vliv transplantace embryonálního locus coeruleus (LC) na morfofunkční indexy neuronů LC a pohybovou aktivitu příjemců. Příjemci byly samice potkanů kmene Wistar a dárci 18denní embrya potkanů stejné linie. Transplantace embryonální LC byla provedena do dutiny třetí mozkové komory. Histologicky bylo u 75 % příjemců zjištěno uchycení štěpu. V případech uchycení štěpu přiléhal štěp ke stěně komory, vyplňoval 1/5-2/5 jejího lumen a byl životaschopný. 1 a 6 měsíců po operaci transplantovaná nervová tkáň podle svých morfologických charakteristik reprezentovala struktury, které by vznikly během jejich normálního ontogenetického vývoje, tj. struktury LC. Data získaná autory naznačují, že u zvířat, kterým byl transplantován embryonální úpon LC, se mění dynamická aktivita a zvyšuje se matrixová aktivita chromatinu jader buněk LC. V důsledku toho se zesiluje aktivita neuronů vlastních LC, ale funkčně aktivní je i vštěpovaný transplantát. Je známo, že tzv. lokomotorická oblast středního mozku se prakticky shoduje s lokalizací LC. Autoři se domnívají, že základem změny motorické aktivity recipientních krys je aktivace buněk LC, a to jak vlastních, tak transplantovaných, s uvolněním velkého množství norepinefrinu, a to i v segmentech míchy. Předpokládá se tedy, že zvýšení motorické aktivity za podmínek transplantace LC do intaktního mozku zvířat je způsobeno přítomností funkčně aktivního transplantátu integrovaného s mozkem příjemce a přispívajícího k aktivaci lokomotorické aktivity u krys.

Dále bylo prokázáno, že transplantované neuroepiteliální buňky embryonálních rudimentů neokortexu a míchy přežívají a diferencují se na neuroblasty, mladé a zralé neurony během 1-2 měsíců po jejich transplantaci do poškozeného sedacího nervu dospělých krys. Při studiu dynamiky vývoje NADPH-pozitivních neuronů embryonálních rudimentů neokortexu a míchy krys v heterotopických alograftech (15denní embryo krys) bylo na podélných řezech sedacími nervy recipientních krys zjištěno uchycení 70 až 80 % neurograftů, což záviselo na době pozorování. V štěpech se týden po operaci začaly tvořit uni- a bipolární neuroblasty se zaoblenými světlými jádry a jedním nebo dvěma jadérky, což bylo doprovázeno tvorbou shluků. Autoři mezi neuroblasty neprokázali buňky obsahující NADPH diaforázu (NADPH-d). Po 7 dnech byly NADPH-pozitivní pouze buněčné elementy cév - kapilární endotelové buňky v tloušťce transplantátu, stejně jako endotelové buňky a buňky hladkého svalstva cév sedacího nervu příjemce. Vzhledem k tomu, že v buňkách hladkého svalstva cév dochází k indukci NO syntázy (NOS) pod vlivem IL-1, autoři spojují výskyt NADPH-pozitivních buněk hladkého svalstva v cévách sedacího nervu s přítomností IL-1 syntetizovaného v poškozených nervových kmenech. Je známo, že neurogeneze za podmínek transplantace embryonálních mozkových rudimentů probíhá synchronně s vývojem neuronů in situ. Výsledky morfologických studií naznačují, že diferenciace některých nervových elementů transplantátů sedm dní po transplantaci odpovídá diferenciaci buněk v podobných částech mozku novorozených potkanů. Za podmínek heterotopické transplantace do periferního nervu tedy transplantované embryonální nervové buňky vykazují schopnost syntetizovat NADPH-d. V tomto případě se v transplantacích míchy nachází více neuronů obsahujících NADPH-d než v transplantacích neokortexu, ale syntéza oxidu dusnatého začíná v transplantovaných neuronech později než během vývoje in situ. V CNS obratlovců se NOS-pozitivní buňky objevují již v prenatálním období. Předpokládá se, že NO podporuje tvorbu synaptických spojení ve vyvíjejícím se mozku a přítomnost NOS-pozitivních nervových aferentních vláken, která zajišťují syntézu NO v mozečkových neuroblastech, stimuluje migraci a diferenciaci neuronů, díky čemuž se tvoří normální cytoarchitektura mozku. V tektu byla stanovena důležitá role NO v synapsogenezi - NOS-pozitivní se ukázaly pouze ty neurony, které měly synaptická spojení s buňkami sítnice.

Je známo, že oxid dusnatý je jedním z regulátorů mozkové aktivity, kde se tvoří z argininu pod vlivem NO syntázy, která má diaforázovou aktivitu. V centrálním nervovém systému je NO syntetizován v endotelových buňkách cév, mikrogliích, astrocytech a neuronech různých částí mozku. Po traumatickém poranění mozku, stejně jako během hypoxie a ischemie, je pozorován nárůst počtu neuronů obsahujících NO, který je jedním z regulátorů průtoku krve mozkem. Vzhledem ke schopnosti NO indukovat synapsogenezi je obzvláště zajímavé studium tvorby buněk obsahujících NO v podmínkách neurotransplantace na pozadí traumatického poškození nervové tkáně příjemce.

Neméně důležité je studium vlivu neurotransplantace na podmíněný reflexní stereotyp chování. V experimentech zaměřených na studium vlivu intracerebrální a distanční (mezi CII a CIII) transplantace embryonální tkáně locus coeruleus (17.-19. den gestace) na paměťové procesy a obsah katecholaminů u potkanů s destrukcí frontotemporálního neokortexu bylo prokázáno, že elektrolytické poškození frontotemporálního kortexu mozku narušuje stereotyp podmíněného reflexního emočního vyhýbání se (paměť), oslabuje fyziologickou aktivitu, snižuje obsah norepinefrinu v zóně koagulovaného neokortexu, ale zvyšuje jeho hladinu v hypotalamu, kde je pozorován pokles koncentrace adrenalinu, i když jeho množství v krvi a nadledvinách se zvyšuje.

V důsledku intracerebrální transplantace embryonální tkáně locus coeruleus se u 81,4 % zvířat obnoví stereotyp podmíněného reflexu emoční vyhýbací reakce, narušený elektrolytickým poškozením frontotemporálních oblastí mozkové kůry, normalizuje se obsah adrenalinu v retikulární formaci středního mozku, hypotalamu a neokortexu a jeho hladina v hipokampu se dokonce zvyšuje, což je spojeno se snížením koncentrace adrenalinu v krvi.

Vzdálená transplantace embryonální tkáně locus coeruleus nejen obnovuje narušený stereotyp podmíněného reflexu emoční vyhýbací reakce u potkanů s elektrolytickým poškozením frontotemporální kůry, ale také zvyšuje obsah norepinefrinu a adrenalinu, zejména v hypotalamu, krvi, nadledvinách a srdci. Předpokládá se, že je to způsobeno vaskularizací transplantátu, pronikáním neurotransmiterů do krevního oběhu, jejich průchodem hematoencefalickou bariérou a aktivací mechanismů zpětného vychytávání adrenalinu a norepinefrinu typy vychytávání 1, 2, 3. Autoři se domnívají, že dlouhodobou stabilizaci hladiny norepinefrinu za podmínek uchycení a fungování transplantátu lze považovat za fenomén jeho progresivního uvolňování v minimálních dávkách neurony locus coeruleus.

Pozitivní klinické účinky transplantace embryonální nervové tkáně mohou být také způsobeny schopností této tkáně ovlivňovat procesy vaskulárního neoplazie, na jejichž regulaci se přímo podílejí růstové faktory a cytokiny. Vaskulogeneze je aktivována angiogenními růstovými faktory - vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem (VEGF), FGF, PDGF a TGF, které jsou syntetizovány během ischemie, jež působí jako iniciační moment angiogeneze. Bylo prokázáno, že k vyčerpání vaskulárního růstového potenciálu dochází během procesu stárnutí organismu, což hraje významnou roli v patogenezi onemocnění, jako je ischemická choroba srdeční a obliterující ateroskleróza dolních končetin. Tkáňová ischemie se rozvíjí i u mnoha dalších onemocnění. Zavedení angiogenních faktorů do ischemických zón (terapeutická angiogeneze) stimuluje růst cév v ischemických tkáních a zlepšuje mikrocirkulaci v důsledku rozvoje kolaterálního oběhu, což následně zvyšuje funkční aktivitu postiženého orgánu.

VEGF a FGF jsou považovány za nejslibnější pro klinické využití. Výsledky prvních randomizovaných studií byly povzbudivé, zejména pokud byly správně zvoleny optimální dávky a způsoby podávání angiogenních faktorů. V tomto ohledu bylo provedeno experimentální hodnocení angiogenní aktivity extraktu izolovaného z lidské embryonální mozkové tkáně. V práci byl použit materiál z potratu získaný ve dvacátém týdnu těhotenství a zpracovaný podle metody I. Macioga a kol. (1979) v modifikaci IC ANRF. Tento lék je analogem „dodatku pro růst endoteliálních buněk“ („Sigma“) a je přirozenou směsí lidských angiogenních faktorů, která zahrnuje VEGF a FGF. Experimenty byly provedeny na krysách s modely ischemie zadních končetin a tkáně myokardu. Na základě studia aktivity alkalické fosfatázy u experimentálních zvířat, kterým byl podán extrakt z embryonální nervové tkáně, bylo zjištěno zvýšení počtu kapilár na jednotku plochy myokardu - a to jak v podélných, tak v příčných řezech srdce. Angiogenní aktivita přípravku se projevila jak přímým podáním do ischemické zóny, tak i v případě systémového (intramuskulárního) podání, které vedlo ke snížení průměrné plochy postinfarktové jizvy.

U jakékoli varianty transplantace embryonální nervové tkáně je nesmírně důležité správně zvolit gestační věk transplantovaného embryonálního materiálu. Srovnávací analýza účinnosti buněčných preparátů z embryonálního ventrálního mesencefalonu 8-, 14- a 16-17denních embryí potkanů tři měsíce po intrastriatální neurotransplantaci zralým potkanům s parkinsonismem v automatizovaném testu motorické asymetrie indukované apomorfinem odhalila významně vyšší účinnost buněčných preparátů CNS z 8denních embryí a nejnižší účinnost z 16-17denní embryonální nervové tkáně. Získaná data korelovala s výsledky histomorfologické analýzy, zejména s velikostí transplantátů, závažností gliové reakce a počtem dopaminergních neuronů v nich.

Rozdíly v terapeutickém účinku embryonálních buněk nervové tkáně mohou být spojeny jak se stupněm nezralosti a angažovanosti samotných buněk, tak s jejich odlišnými reakcemi na růstové faktory uvolňované v oblasti indukovaného poškození dopaminergních neuronů. Zejména vliv EGF a FGF2 na vývoj telencefalických nervových kmenových buněk in vivo se projevuje v různých fázích embryogeneze. Neuroepiteliální buňky 8,5 dne starých myších embryí, pokud jsou kultivovány in vitro v bezsérovém médiu, proliferují v přítomnosti FGF2, ale nikoli EGF, na který reagují pouze populace kmenových buněk izolovaných z mozku embryí v pozdějších fázích vývoje. Zároveň nervové kmenové buňky proliferují v reakci na každý z těchto mitogenů a aditivně zvyšují růst v případě přidání EGF a FGF2 do kultury s nízkou hustotou výsevu buněk. EGF-reaktivní nervové kmenové buňky ze zárodečných zón 14,5denních myších embryí jsou považovány za lineární potomky FGF-reaktivních nervových kmenových buněk, které se poprvé objevují po 8,5 dnech gestace. Potenciální fenotyp nervových kmenových a progenitorových buněk závisí na komplexním vlivu jejich mikroprostředí. Imunofenotypizace nervových buněk z periventrikulární a hipokampální zón 8-12- a 17-20týdenních lidských embryí průtokovou cytofluorometrií odhalila významnou variabilitu spojenou jak s gestačním věkem, tak s individuálními konstitučními rysy dárcovského biomateriálu. Pokud jsou tyto nervové progenitorové buňky kultivovány v selektivním bezsérovém médiu s EGF, FGF2 a NGF, neurosféry se tvoří rychlostí, která významně závisí na gestačním věku. Buňky z různých částí mozku 5-13 týdnů starých lidských embryí si při krátké kultivaci s FGF2 v monovrstvé kultuře na lamininovém substrátu za přítomnosti stopových množství růstových faktorů udržují proliferaci po dobu 6 týdnů s vysokým procentem nestin-pozitivních buněk na pozadí spontánní tvorby buněk s markery všech tří linií nervové diferenciace. Buňky izolované z mesencefalonu lidského embrya v gestačním období přesahujícím 13 týdnů proliferují pod vlivem EGF a také tvoří neurosféry. Synergického efektu bylo dosaženo použitím kombinace EGF a FGF2. Nejintenzivnější proliferace nervových kmenových buněk s tvorbou neurosfér je pozorována při kultivaci tkáně mozkové kůry 6-8 týdnů starých lidských embryí za přítomnosti EGF2, IGF1 a 5% koňského séra na substrátu s fibronektinem.

Je třeba poznamenat, že otázky týkající se gestačního věku a úseku embryonální CNS, jehož tkáň je vhodnější použít pro účely neurotransplantace, zůstávají otevřené. Odpovědi na ně je třeba hledat v neurogenezi vyvíjejícího se mozku, která pokračuje po celé prenatální období - v době, kdy epitel neurální trubice tvoří vícevrstvou strukturu. Předpokládá se, že zdrojem kmenových buněk a nových neuronů je radiální glia, sestávající z protáhlých buněk s dlouhými výběžky radiálně směřujícími vzhledem ke stěně mozkových váčků a kontaktujícími vnitřní povrch komor a vnější piální povrch mozkové stěny. Dříve byla radiální glia obdařena pouze funkcí neuronálního traktu, podél kterého migrují neuroblasty z ventrální oblasti do povrchových úseků, a byla jí také přiřazena kosterní role v procesu formování správné laminární organizace kůry. Dnes je zjištěno, že s postupujícím vývojem se radiální glia transdiferencuje na astrocyty. Významná část u savců je redukována bezprostředně po narození, nicméně u těch živočišných druhů, u kterých je radiální glia zachována až do dospělosti, dochází k neurogenezi aktivně v postnatálním období.

V kultuře radiální gliové buňky z embryonálního neokortexu hlodavců tvořily neurony a gliové buňky, přičemž neurony se převážně tvořily ve 14. až 16. dni gestačního věku embryonálního vývoje (období maximální intenzity neurogeneze v mozkové kůře myší a potkanů). 18. den embryogeneze se diferenciace posunula směrem k tvorbě astrocytů s významným poklesem počtu nově vytvořených neuronů. In situ značení radiálních gliových buněk pomocí GFP umožnilo detekovat asymetrické dělení značených buněk v dutině mozkových váčků 15. až 16. dne starých embryí potkanů s výskytem dceřiných buněk s imunologickými a elektrofyziologickými charakteristikami neuroblastů. Je pozoruhodné, že podle výsledků dynamických pozorování vznikající neuroblasty využívají mateřskou buňku radiálních gliových buněk pro migraci na povrch pialy.

Endogenním markerem radiální glie je intermediární filamentní protein nestin. Pomocí metody fluorescenčního flow sortingu buněk značených retrovirem asociovaným s GFP a exprimovaných pod kontrolou nestinu bylo prokázáno, že kmenové buňky gyrus dentatus a hilus lidského hipokampu (materiál byl získán během operací epilepsie) exprimují nestin. Patří tedy k radiální glii, která je u lidí, stejně jako u jiných savců, zachována pouze v gyrus dentatus.

Zároveň je účinnost transplantace buněk určena nejen vysokou životaschopností dárcovských buněk, jejich diferenciačním potenciálem a schopností nahradit defektní buňky, ale především jejich směrovanou migrací. Plná funkční integrace transplantovaných buněk závisí na jejich migrační schopnosti - bez narušení cytoarchitektury mozku příjemce. Vzhledem k tomu, že radiální glia v postnatálním období prochází téměř úplnou redukcí, bylo nutné zjistit, jak se dárcovské buňky mohou u dospělých příjemců přesunout z transplantační zóny do místa poškození mozku. Existují dvě varianty migrace buněk do CNS, které nezávisí na radiální glii: fenomén tangenciální migrace neboli pohyb neuroblastů během vývoje mozkové kůry kolmý k síti radiální glie, a také migrace „v řadě“ nebo „podél řetězce“. Zejména migrace nervových progenitorových buněk z rostrální subventrikulární zóny do čichového bulbu probíhá jako sekvence těsně sousedících buněk obklopených gliovými buňkami. Předpokládá se, že tyto buňky využívají partnerské buňky jako migrační substrát a hlavním regulátorem těchto mezibuněčných interakcí je PSA-NCAM (polysialylovaná adhezní molekula nervových buněk). Neuronální migrace proto nemusí nutně vyžadovat účast radiální glie nebo již existujících axonálních spojení. Extraradiální forma pohybu buněk v „řetězci“ podél rostrálního migračního traktu se zachovává po celý život, což naznačuje reálnou možnost cíleného doručení transplantovaných nervových progenitorových buněk do zralého nervového systému.

Existuje hypotéza o přítomnosti linie kmenových buněk v ontogenezi mozku, podle níž je v raných fázích vývoje mozku kmenová buňka neuroepiteliální buňka, která se při svém zrání transdiferencuje do radiální glie. V dospělosti roli kmenových buněk plní buňky, které mají vlastnosti astrocytů. Navzdory řadě kontroverzních bodů (rozpory ohledně kmenových buněk hipokampu, stejně jako hlubokých částí mozku, které nemají vrstevnatou kůru a vyvíjejí se z thalamických tuberkul, kde radiální glie chybí), jasná a jednoduchá koncepce konzistentní změny fenotypu kmenových buněk v průběhu ontogeneze vypadá velmi atraktivně.

Vliv faktorů mikroprostředí na determinaci a následnou diferenciaci neuronálně diferencovaných buněk byl jasně prokázán transplantací zralých kmenových buněk míchy potkanů do různých oblastí zralého nervového systému. Při transplantaci kmenových buněk do gyrus dentatus nebo do oblasti neuronální migrace v čichových bulbech byla pozorována aktivní migrace transplantovaných buněk s tvorbou četných neuronů. Transplantace kmenových buněk do míchy a oblasti Ammonova rohu vedla k tvorbě astrocytů a oligodendrocytů, zatímco transplantace do gyrus dentatus vedla k tvorbě nejen gliových buněk, ale také neuronů.

U dospělého potkana může počet dělících se buněk v gyrus dentatus dosáhnout několika tisíc za den - méně než 1 % z celkového počtu granulárních buněk. Neurony tvoří 50–90 % buněk, astocyty a další gliové elementy - asi 15 %. Zbývající buňky nemají antigenní vlastnosti neuronů a glie, ale obsahují antigeny endotelových buněk, což naznačuje úzký vztah mezi neurogenezí a angiogenezí v gyrus dentatus. Zastánci možnosti diferenciace endotelových buněk na neuronální prekurzorové buňky odkazují na schopnost endotelových buněk in vitro syntetizovat BDNF.

Rychlost samouskládání nervových obvodů je impozantní: během diferenciace migrují prekurzorové buňky granulárních buněk do gyrus dentatus a vytvářejí výběžky rostoucí směrem k SAZ zóně Ammonova rohu a tvořící synapse s pyramidálními glutamatergními a interkalárními inhibičními neurony. Nově vytvořené granulární buňky se integrují do stávajících nervových obvodů během 2 týdnů a první synapse se objevují již 4-6 dní po vzniku nových buněk. Častým podáváním BrdU nebo 3H-thymidinu (jedna z metod pro identifikaci dospělých kmenových buněk) dospělým zvířatům bylo v Ammonově rohu nalezeno velké množství značených neuronů a astrocytů, což naznačuje možnost tvorby nových neuronů nejen v gyrus dentatus, ale i v dalších částech hipokampu. Zájem o procesy dělení, diferenciace a buněčné smrti v gyrus dentatus hipokampu zralého mozku je dán také skutečností, že zde vytvořené neurony jsou lokalizovány v jedné z klíčových oblastí hipokampu, zodpovědné za procesy učení a paměti.

Dnes je tedy prokázáno, že nervové progenitorové buňky pocházejí z buněk subependymální zóny laterální komory dospělých hlodavců. Migrují podél rostrální migrační dráhy tvořené podélně orientovanými astrogliálními buňkami do čichového bulbu, kde jsou uloženy ve vrstvě granulárních buněk a diferencují se na neurony této struktury. Migrace progenitorových nervových buněk byla detekována v rostrální migrační dráze dospělých opic, což naznačuje možnost tvorby nových neuronů v čichovém bulbu primátů. Nervové kmenové buňky byly izolovány z čichového bulbu dospělého člověka a přeneseny do linií, jejichž klonované buňky se diferencují na neurony, astrocyty a oligodendrocyty. Kmenové buňky byly nalezeny v hipokampu zralého mozku krys, myší, opic a lidí. Nervové kmenové buňky subgranulární zóny dentátové fascie jsou zdrojem progenitorových buněk migrujících do mediálních a laterálních končetin hipokampu, kde se diferencují na zralé granulární buňky a gliové elementy. Axony de novo vytvořených neuronů dentátní fascie jsou sledovány až do pole CA3, což naznačuje účast nově vytvořených neuronů na realizaci funkcí hipokampu. V asociačních oblastech neokortexu dospělých opic byly nalezeny neuronální progenitorové buňky migrující ze subventrikulární zóny. Ve vrstvě VI neokortexu mozku myši jsou nové pyramidální neurony detekovány 2–28 týdnů po indukovaném poškození a smrti nativních neuronů této vrstvy v důsledku migrace dříve dormantních progenitorových buněk subventrikulární zóny. Realita postnatální neurogeneze v lidském mozku je konečně doložena dvojnásobným nárůstem počtu kortikálních neuronů, který pokračuje během prvních 6 let po narození.

Pro praktickou buněčnou transplantologii má nemalý význam otázka regulace procesů reprodukce a diferenciace nervových kmenových a progenitorových buněk. Nejdůležitějšími faktory potlačujícími proliferaci nervových progenitorových buněk jsou glukokortikoidy, které prudce snižují počet dělení, zatímco odstranění nadledvin naopak počet mitóz významně zvyšuje (Gould, 1996). Je pozoruhodné, že morfogeneze gyrus dentatus u hlodavců je nejintenzivnější během prvních dvou týdnů postnatálního vývoje v období absence reakce na stres na pozadí prudkého poklesu produkce a sekrece steroidních hormonů kůry nadledvin. Kortikosteroidy inhibují migraci granulárních buněk - nové neurony se neusazují v granulární vrstvě gyrus dentatus, ale zůstávají v hilu. Předpokládá se, že jsou současně narušeny procesy tvorby synaptických spojení. Ochrana buněk před takovou „steroidní agresí“ se provádí minimální expresí mineralokortikoidních a glukokortikoidních receptorů na proliferujících granulárních buňkách nejen během vývoje gyrus dentatus, ale i u dospělých zvířat. Ze všech neuronů mozku se však právě neurony hipokampu vyznačují nejvyšším obsahem glukokortikoidních receptorů, což způsobuje stresový účinek na hipokampus. Psychoemoční stres a stresové situace inhibují neurogenezi a chronický stres prudce snižuje schopnost zvířat získávat nové dovednosti a učit se. Výraznější negativní vliv chronického stresu na neurogenezi je zcela pochopitelný, vezmeme-li v úvahu převážně dormantní stav nervových kmenových buněk. Při imobilizaci březích krys (pro hlodavce - extrémně silný stresový faktor) bylo zjištěno, že prenatální stres také způsobuje pokles počtu buněk v gyrus dentatus a významně inhibuje neurogenezi. Je známo, že glukokortikoidy se podílejí na patogenezi depresivních stavů, jejichž morfologickým ekvivalentem je inhibice neurogeneze, patologická reorganizace neuronů a interneuronálních spojení a smrt nervových buněk. Na druhou stranu antidepresivní chemoterapeutika aktivují tvorbu neuronů de novo, což potvrzuje souvislost mezi procesy tvorby nových neuronů v hipokampu a rozvojem deprese. Estrogeny mají významný vliv na neurogenezi, jejíž účinky jsou opačné než působení glukokortikosteroidů a spočívají v podpoře proliferace a životaschopnosti nervových progenitorových buněk. Je třeba poznamenat, že estrogeny významně zvyšují schopnost učení u zvířat. Někteří autoři spojují cyklické změny v počtu granulárních buněk a jejich nadměrný počet u samic s vlivem estrogenů.

Je známo, že neurogeneze je řízena EGF, FGF a BDNF, avšak mechanismy vlivu vnějších signálů z mitogenů a růstových faktorů na kmenové buňky nebyly dostatečně prozkoumány. Bylo zjištěno, že PDGF in vitro udržuje neuronální směr diferenciace progenitorových buněk a ciliární neurotrofický faktor (CNTF), stejně jako trijodthyronin, stimuluje tvorbu převážně gliových elementů - astrocytů a oligodendrocytů. Hypofyzární adenylátcyklázu aktivující protein (PACAP) a vazoaktivní intestinální peptid (VIP) aktivují proliferaci nervových progenitorových buněk, ale zároveň inhibují procesy diferenciace dceřiných buněk. Opioidy, zejména v případě jejich dlouhodobé expozice, významně inhibují neurogenezi. Opioidní receptory však nebyly identifikovány v kmenových buňkách a nervových progenitorových buňkách gyrus dentatus (jsou přítomny v diferencujících se neuronech embryonálního období), což nám neumožňuje posoudit přímé účinky opioidů.

Potřeby praktické regenerativně-plastické medicíny donutily výzkumníky věnovat zvláštní pozornost studiu pluri- a multipotence kmenových buněk. Implementace těchto vlastností na úrovni regionálních kmenových buněk dospělého organismu by v budoucnu mohla zajistit produkci potřebného transplantačního materiálu. Výše bylo ukázáno, že epigenetická stimulace nervových kmenových buněk umožňuje získat proliferující buňky již preformované podle nervových fenotypů, což omezuje jejich počet. V případě využití totipotentních vlastností embryonální kmenové buňky dochází k proliferaci do dosažení dostatečného počtu buněk dříve než k nervové diferenciaci a rozmnožené buňky se snadno převedou na nervový fenotyp. Pro získání nervových kmenových buněk se ESC izolují z vnitřní buněčné hmoty blastocysty a kultivují se za povinné přítomnosti LIF, který zachovává jejich totipotenci a schopnost neomezeného dělení. Poté se indukuje nervová diferenciace ESC pomocí kyseliny retinové. Transplantace výsledných nervových kmenových buněk do striata poškozeného chinolinem a 6-hydroxydopaminem je doprovázena jejich diferenciací na dopaminergní a serotonergní neurony. Po injekci do komor embryonálního mozku potkana migrují nervové progenitorové buňky odvozené z ESC do různých oblastí mozku příjemce, včetně kortexu, striata, septa, thalamu, hypotalamu a mozečku. Buňky zbývající v dutině komor tvoří epiteliální struktury připomínající neurální trubici, stejně jako jednotlivé ostrůvky neneurální tkáně. V mozkovém parenchymu embrya příjemce transplantované buňky produkují tři hlavní typy buněk nervového systému. Některé z nich mají protáhlé apikální dendrity, pyramidální buněčná těla a bazální axony vyčnívající do corpus callosum. Astrocyty dárcovského původu rozšiřují výběžky do blízkých kapilár a oligodendrocyty úzce kontaktují myelinové mufy a podílejí se na tvorbě myelinu. Neurální progenitorové buňky získané z ESC in vitro jsou tedy schopny řízené migrace a regionální diferenciace adekvátní signálům mikroprostředí, čímž poskytují mnoha oblastem vyvíjejícího se mozku neurony a glii.

Někteří autoři zvažují možnost de- a transdiferenciace regionálních kmenových buněk dospělého organismu. Nepřímé potvrzení dediferenciace buněk v kultuře s rozšířením jejich potenciálu poskytují data o štěpení myších nervových kmenových buněk v červené kostní dřeni s následným vývojem buněčných linií z nich, které vedou k funkčně aktivním buňkám periferní krve. Kromě toho transplantace geneticky značených (LacZ) neurosférických buněk získaných ze zralého nebo embryonálního mozku do mozku ozářených myší s potlačenou hematopoézou vedla nejen k tvorbě nervových derivátů z kmenových buněk, ale také způsobila generování krevních buněk, což naznačuje pluripotenci nervových kmenových buněk, realizovanou mimo mozek. Nervová kmenová buňka je tedy schopna diferenciace na krevní buňky pod vlivem signálů z mikroprostředí kostní dřeně s předběžnou transformací na hematopoetickou kmenovou buňku. Na druhou stranu, při transplantaci hematopoetických kmenových buněk kostní dřeně do mozku byla prokázána jejich diferenciace pod vlivem mikroprostředí mozkové tkáně na gliové a nervové buňky. Diferenciační potenciál nervových a hematopoetických kmenových buněk tedy není omezen tkáňovou specificitou. Jinými slovy, faktory lokálního mikroprostředí, odlišné od faktorů charakteristických pro tkáně mozku a kostní dřeně, jsou schopny změnit směr diferenciace těchto buněk. Bylo prokázáno, že nervové kmenové buňky zavedené do žilního systému ozářených myší vytvářejí populace myeloidních, lymfoidních a nezralých hematopoetických buněk ve slezině a kostní dřeni. In vitro byl stanoven vliv morfogenetických proteinů kostní dřeně (BMP) na přežití a diferenciaci nervových kmenových buněk, který, stejně jako v raných fázích embryogeneze, určuje jejich vývoj v nervovém nebo gliovém směru. V kulturách nervových kmenových buněk z 16denních embryí potkanů BMP indukují tvorbu neuronů a astroglií, zatímco v kulturách kmenových buněk odvozených z perinatálního mozku se tvoří pouze astrocyty. BMP navíc potlačují tvorbu oligodendrocytů, které se in vitro objevují pouze po přidání antagonisty BMP nogginu.

Transdiferenciační procesy nejsou druhově specifické: lidské hematopoetické kmenové buňky kostní dřeně transplantované do striata dospělých potkanů migrují do bílé hmoty zevního pouzdra, ipsi- a kontralaterálního neokortexu, kde tvoří astrocytům podobné buněčné elementy (Azizi et al., 1998). Pokud jsou kmenové buňky kostní dřeně alotransplantovány do laterální komory novorozených myší, lze migraci hematopoetických kmenových buněk vysledovat až do struktur předního mozku a mozečku. Ve striatu a molekulární vrstvě hipokampu se migrované buňky transformují na astrocyty a v čichovém bulbu, vnitřní vrstvě granulárních buněk mozečku a retikulární formaci mozkového kmene tvoří neuronům podobné buňky s pozitivní reakcí na neurofilamenta. Po intravenózním podání hematopoetických buněk dospělým myším byly v neokortexu, thalamu, mozkovém kmeni a mozečku detekovány mikro- a astrocyty značené GFP.

Kromě toho mohou mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně, které dávají vzniknout všem typům buněk pojivové tkáně, za určitých podmínek také podléhat neurální transdiferenciaci (připomeňme, že embryonálním zdrojem mezenchymu jsou buňky neurální lišty). Bylo prokázáno, že lidské a myší stromální buňky kostní dřeně kultivované in vitro v přítomnosti EGF nebo BDNF exprimují marker neurálních progenitorových buněk nestin a přidání různých kombinací růstových faktorů vede k tvorbě buněk s markery glie (GFAP) a neuronů (jaderný protein, NeuN). Značené syngenní mezenchymální kmenové buňky transplantované do laterální komory mozku novorozených myší migrují a lokalizují se v předním mozku a mozečku, aniž by narušily cytoarchitekturu mozku příjemce. Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně se diferencují na zralé astrocyty ve striatu a molekulární vrstvě hipokampu a osidlují čichový bulb, granulární vrstvy mozečku a retikulární formaci, kde se transformují na neurony. Lidské mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně jsou schopny diferenciace do makroglie in vitro a integrace do mozkových struktur potkanů po transplantaci. Přímá transplantace mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně do hipokampu dospělých potkanů je také doprovázena jejich migrací do mozkového parenchymu a neurogliální diferenciací.

Předpokládá se, že transplantace kmenových buněk kostní dřeně může rozšířit možnosti buněčné terapie onemocnění CNS charakterizovaných nadměrnou patologickou smrtí neuronů. Je však třeba poznamenat, že ne všichni výzkumníci uznávají fakt vzájemné transformace nervových a hematopoetických kmenových buněk, zejména in vivo, což je opět způsobeno absencí spolehlivého markeru pro posouzení jejich transdiferenciace a dalšího vývoje.

Transplantace kmenových buněk otevírá nové obzory pro buněčnou genovou terapii dědičné neurologické patologie. Genetická modifikace nervových kmenových buněk zahrnuje vložení genetických regulačních konstruktů, jejichž produkty interagují s proteiny buněčného cyklu v režimu automatické regulace. Transdukce takových genů do embryonálních progenitorových buněk se používá k množení nervových kmenových buněk. Většina geneticky modifikovaných buněčných klonů se chová jako stabilní buněčné linie, nevykazují žádné známky transformace in vivo ani in vitro, ale mají výraznou schopnost kontaktní inhibice proliferace. Po transplantaci se množené transfekované buňky integrují do tkáně příjemce bez narušení cytoarchitektury a bez nádorové transformace. Dárcovské nervové kmenové buňky nedeformují integrační zónu a rovnocenně soutěží o prostor s hostitelskými progenitorovými buňkami. Nicméně 2. až 3. den intenzita dělení transfektovaných buněk prudce klesá, což odpovídá kontaktní inhibici jejich proliferace in vitro. Embrya-příjemci transfektantů nervových kmenových buněk nemají abnormality ve vývoji centrálního nervového systému, všechny oblasti mozku, které jsou v kontaktu s transplantátem, se vyvíjejí normálně. Po transplantaci klony nervových kmenových buněk rychle migrují z injekční zóny a často přesahují odpovídající embryonální zóny podél rostrálního traktu, kde se adekvátně integrují s dalšími oblastmi mozku. Integrace geneticky modifikovaných klonů a transfekovaných buněčných linií nervových kmenových buněk do mozku hostitelského organismu je charakteristická nejen pro embryonální období: tyto buňky jsou implantovány do četných oblastí centrálního nervového systému plodu, novorozence, dospělého a dokonce i stárnoucího organismu příjemce a vykazují schopnost adekvátní integrace a diferenciace. Zejména po transplantaci do mozkové komory migrují transfekované buňky bez poškození hematoencefalické bariéry a stávají se integrálními funkčními buněčnými složkami mozkové tkáně. Dárcovské neurony tvoří vhodné synapse a exprimují specifické iontové kanály. Při zachování integrity hematoencefalické bariéry rozšiřují astroglie, derivát transfektovaných nervových kmenových buněk, výběžky do mozkových cév a oligodendrocyty odvozené od dárce exprimují myelinový bazický protein a myelinizují neuronální výběžky.

Kromě toho jsou nervové kmenové buňky transfekovány pro použití jako buněčné vektory. Takové vektorové genetické konstrukty poskytují in vivo stabilní expresi cizích genů zapojených do vývoje nervového systému nebo se používají k nápravě stávajících genetických defektů, protože produkty těchto genů jsou schopny kompenzovat různé biochemické abnormality centrálního nervového systému. Vysoká migrační aktivita transfekovaných kmenových buněk a adekvátní implantace do zárodečných zón různých oblastí vyvíjejícího se mozku nám umožňují doufat v úplnou obnovu dědičného deficitu buněčných enzymů. Při modelování syndromu ataxie-teleangiektázie (mutantní myší linie pg a pcd) Purkyňovy buňky mizí z mozečku experimentálních zvířat během prvních týdnů postnatálního vývoje. Bylo prokázáno, že zavedení nervových kmenových buněk do mozku těchto zvířat je doprovázeno jejich diferenciací na Purkyňovy buňky a granulární neurony. U mutantů pcd jsou poruchy koordinace pohybu částečně korigovány a intenzita tremoru je snížena. Podobné výsledky byly získány transplantací klonovaných lidských nervových kmenových buněk do primátů, u kterých byla degenerace Purkyňových buněk indukována pomocí onkonázy. Po transplantaci byly dárcovské nervové kmenové buňky nalezeny v granulární, molekulární a Purkyňových buněčných vrstvách mozečkového parenchymu. Genetická modifikace nervových progenitorových buněk proto může zajistit stabilní a závaznou modifikaci fenotypu, která je odolná vůči vnějším vlivům. To je zvláště důležité u patologických procesů spojených s vývojem faktorů u příjemce, které brání přežití a diferenciaci dárcovských buněk (např. během imunitní agrese).

Mukopolysacharidóza typu VII u lidí je charakterizována neurodegenerací a progresivní mentální retardací, která je u myší modelována deleční mutací v genu pro beta-glukuronidázu. Po transplantaci transfekovaných nervových kmenových buněk vylučujících beta-glukuronidázu do mozkových komor novorozených defektních recipientních myší se dárcovské buňky nacházejí nejprve v terminální zóně a poté se šíří po celém mozkovém parenchymu, čímž stabilně korigují integritu lysozomů v mozku mutantních myší. V modelu Tay-Sachsovy choroby poskytují retrovirem transdukované nervové kmenové buňky, když jsou in utero podány myším plodům a transplantovány novorozeným myším, účinnou expresi beta-podjednotky beta-hexosaminidázy u recipientů s mutací vedoucí k patologické akumulaci beta2-gangliosidu.

Dalším směrem regenerativní medicíny je stimulace proliferačního a diferenciačního potenciálu vlastních nervových kmenových buněk pacienta. Zejména nervové kmenové buňky sekretují NT-3 během hemisekce míchy a mozkové asfyxie u potkanů, exprimují NGF a BDNF v septu a bazálních gangliích, tyrosinhydroxylázy ve striatu, stejně jako reelin v mozečku a myelinový bazický protein v mozku.

Problematice stimulace neurogeneze však zjevně není věnována dostatečná pozornost. Několik studií naznačuje, že funkční zátěž nervových center zodpovědných za rozlišení pachů se odráží ve tvorbě nových neuronů. U transgenních myší s deficitem neuronálních adhezních molekul byl pokles intenzity neurogeneze a pokles počtu neuronů migrujících do čichových bulbů kombinován se zhoršením schopnosti rozlišovat pachy, ačkoli práh vnímání pachu a krátkodobá čichová paměť nebyly narušeny. Funkční stav buněk gyrus dentatus hraje důležitou roli v regulaci neurogeneze: oslabení účinku glutamátu na granulární buňky po destrukci entorhinální kůry podporuje proliferaci a diferenciaci neuronů a stimulace vláken perforantní dráhy (hlavního aferentního vstupu do hipokampu) způsobuje inhibici neurogeneze. Antagonisté NMDA receptorů aktivují procesy tvorby nových neuronů, zatímco agonisté naopak snižují intenzitu neurogeneze, což ve svém důsledku připomíná účinek glukokortikosteroidů. V literatuře se nacházejí protichůdné výsledky výzkumu: informace o experimentálně prokázaném inhibičním účinku excitačního neurotransmiteru glutamátu na neurogenezi jsou v rozporu s údaji o stimulaci proliferace progenitorových buněk a vzniku nových neuronů se zvýšením záchvatové aktivity v hipokampu zvířat s experimentálními kainovými a pilokarpinovými modely epilepsie. Zároveň v tradičním modelu epilepsie způsobené mnohočetnou subprahovou stimulací určité oblasti mozku (kindling) a charakterizované méně výraznou smrtí neuronů se intenzita neurogeneze zvyšuje pouze v pozdní fázi kindlingu, kdy je v hipokampu pozorováno poškození a smrt neuronů. Bylo prokázáno, že u epilepsie záchvatová aktivita stimuluje neurogenezi s abnormální lokalizací nových granulárních neuronů, z nichž mnohé se objevují nejen v gyrus dentatus, ale i v hilu. Takové neurony mají velký význam pro vývoj mechových vláken, protože jejich axony tvoří normálně chybějící reverzní kolaterály, které tvoří četné synapse se sousedními granulárními buňkami.

Použití regionálních nervových kmenových buněk otevírá nové perspektivy pro aplikaci buněčné transplantace v léčbě metabolických a genetických neurodegenerativních onemocnění, demyelinizačních onemocnění a posttraumatických poruch centrálního nervového systému. Před provedením náhradní buněčné transplantace podle jedné z metod se provádí ex vivo výběr a expanze požadovaného typu nervových progenitorových buněk s cílem jejich následného zavedení přímo do poškozené oblasti mozku. Terapeutický účinek je v tomto případě dán náhradou poškozených buněk nebo lokálním uvolňováním růstových faktorů a cytokinů. Tato metoda regeneračně-plastické terapie vyžaduje transplantaci dostatečně velkého počtu buněk s předem stanovenými funkčními charakteristikami.

Za vhodné by měly být považovány i další studie molekulárních charakteristik a regeneračně-plastického potenciálu zralých mozkových kmenových buněk, jakož i schopnosti regionálních kmenových buněk různého tkáňového původu transdiferencovat se. V současné době již probíhá screening antigenů hematopoetických kmenových buněk kostní dřeně se stanovením markerové kombinace buněk schopných transdiferenciace na progenitorové buňky nervových kmenových buněk (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Byly získány buňky, které in vitro tvoří neurosféry a po transplantaci do mozku novorozených imunodeficientních myší tvoří neurony. Pro buněčnou xenotransplantologii jsou zajímavé výsledky studií o možnosti křížové transplantace kmenových buněk u jedinců evolučně vzdálených taxonů. Výsledky implantace nervových kmenových buněk do oblasti mozkového nádoru zůstávají bez řádné interpretace: transplantované buňky aktivně migrují v celém objemu nádoru, aniž by překračovaly jeho hranice, a při zavedení buněk do intaktní části mozku je pozorována jejich aktivní migrace směrem k nádoru. Otázka biologického významu takové migrace zůstává otevřená.

Je třeba poznamenat, že úspěšná transplantace nervových kmenových buněk, stejně jako dalších nervových progenitorových buněk získaných z embryonálních kmenových buněk (ESC), je možná pouze při použití vysoce purifikovaných nervových progenitorových buněk, protože nediferencované embryonální kmenové buňky se při transplantaci dospělému imunokompetentnímu příjemci nevyhnutelně transformují na teratomy a teratokarcinomy. I minimální množství špatně diferencovaných buněk v suspenzi dárcovských buněk prudce zvyšuje tumorigenicitu transplantátu a nepřijatelně zvyšuje riziko vzniku nádoru nebo tvorby ne-neurální tkáně. Získání homogenních populací nervových progenitorových buněk je možné při použití buněk, které vznikají v určitých fázích normální embryogeneze, jako alternativního zdroje dárcovské tkáně. Další přístup zahrnuje pečlivou eliminaci nežádoucích buněčných populací pomocí liniově specifické selekce. Nebezpečné je také použití ESC pro neurotransplantaci po jejich nedostatečné expozici růstovým faktorům in vitro. V tomto případě nelze vyloučit selhání programu nervové diferenciace s tvorbou struktur vlastních neurální trubici.

Dnes je zcela zřejmé, že nervové kmenové buňky vykazují tropismus k patologicky změněným oblastem centrálního nervového systému a mají výrazný regeneračně-plastický efekt. Mikroprostředí v místě úmrtí buněk nervové tkáně modeluje směr diferenciace transplantovaných buněk, a tím doplňuje deficit specifických nervových elementů v zóně poškození CNS. U některých neurodegenerativních procesů vznikají neurogenní signály pro rekapitulaci neurogeneze a nervové kmenové buňky zralého mozku jsou schopny na tuto poučnou informaci reagovat. Četná experimentální data slouží jako jasná ilustrace terapeutického potenciálu nervových kmenových buněk. Intracisternální podání klonu nervových kmenových buněk zvířatům s ligací střední mozkové tepny (model ischemické cévní mozkové příhody) pomáhá zmenšit plochu a objem destruktivně změněné oblasti mozku, zejména v případě transplantace nervových kmenových buněk spolu s FGF2. Imunocytochemicky je pozorována migrace dárcovských buněk do ischemické zóny s jejich následnou integrací s intaktními mozkovými buňkami příjemce. Transplantace nezralých buněk myší neuroepiteliální linie MHP36 do mozku krys s experimentální cévní mozkovou příhodou zlepšuje senzomotorické funkce a zavedení těchto buněk do mozkových komor posiluje kognitivní funkce. Transplantace nervově preformovaných hematopoetických buněk lidské kostní dřeně krysám eliminuje dysfunkci mozkové kůry způsobenou ischemickým poškozením. V tomto případě xenogenní nervové progenitorové buňky migrují z místa injekce do zóny destruktivních změn v mozkové tkáni. Intrakraniální transplantace homologních buněk kostní dřeně při traumatickém poškození mozkové kůry u krys vede k částečnému obnovení motorických funkcí. Dárcovské buňky se uchytí, proliferují, podléhají nervové diferenciaci na neurony a astrocyty a migrují směrem k lézi. Po injekci do striata dospělých krys s experimentální cévní mozkovou příhodou klonované lidské nervové kmenové buňky nahrazují poškozené buňky CNS a částečně obnovují narušenou mozkovou funkci.

Lidské nervové kmenové buňky se izolují převážně z embryonálního telencefalonu, který se vyvíjí mnohem později než kaudálněji umístěné části nervového kmene. Byla prokázána možnost izolace nervových kmenových buněk z míchy 43–137 dní starého lidského plodu, protože v přítomnosti EGF a FGF2 tyto buňky tvoří neurosféry a v raných pasážích vykazují multipotenci, diferencují se na neurony a astrocyty. Dlouhodobá kultivace nervových progenitorových buněk (déle než 1 rok) je však multipotenci zbavuje – takové buňky jsou schopny diferenciace pouze na astrocyty, tj. stávají se unipotentními. Regionální nervové kmenové buňky lze získat v důsledku parciální bulbectomie a po reprodukci v kultuře za přítomnosti LIF transplantovat stejnému pacientovi s neurodegenerativními změnami v jiných částech centrálního nervového systému. V klinice byla poprvé provedena substituční buněčná terapie s použitím nervových kmenových buněk k léčbě pacientů s cévní mozkovou příhodou doprovázenou poškozením bazálních ganglií mozku. V důsledku transplantace dárcovských buněk bylo zaznamenáno zlepšení klinického stavu většiny pacientů.

Někteří autoři se domnívají, že schopnost nervových kmenových buněk uchytit se, migrovat a integrovat se do různých oblastí nervové tkáně v případě poškození CNS otevírá neomezené možnosti buněčné terapie nejen lokálních, ale i rozsáhlých (mrtvice nebo asfyxie), multifokálních (roztroušená skleróza) a dokonce i globálních (většina dědičných metabolických poruch nebo neurodegenerativních demencí) patologických procesů. Pokud jsou klonované myší a lidské nervové kmenové buňky transplantovány recipientním zvířatům (myším a primátům) s degenerací dopaminergních neuronů v mezostriatálním systému vyvolanou zavedením methylfenyltetrapyridinu (model Parkinsonovy choroby) 8 měsíců před transplantací, donorové nervové kmenové buňky se integrují do CNS příjemce. O měsíc později jsou transplantované buňky lokalizovány bilaterálně podél středního mozku. Některé z výsledných neuronů dárcovského původu exprimují tyrosinhydrolázu bez známek imunitní reakce na transplantaci. U krys, kterým byl podán 6-hydroxydopamin (další experimentální model Parkinsonovy choroby), byla adaptace transplantovaných buněk na mikroprostředí v mozku hostitele určena podmínkami kultivace nervových kmenových buněk před jejich transplantací. Nervové kmenové buňky, rychle proliferující in vitro pod vlivem EGF, kompenzovaly deficit dopaminergních neuronů v poškozeném striatu účinněji než buňky z 28denních kultur. Autoři se domnívají, že je to způsobeno ztrátou schopnosti vnímat odpovídající diferenciační signály během procesu buněčného dělení nervových progenitorových buněk in vitro.

V některých studiích byly učiněny pokusy o zvýšení účinnosti vlivu na procesy reinervace poškozeného striata transplantací embryonálních buněk striata do této oblasti jako zdroje neurotrofických faktorů se současnou transplantací dopaminergních neuronů ventrálního mesencefalonu. Jak se ukázalo, účinnost neurotransplantace do značné míry závisí na způsobu zavedení embryonální nervové tkáně. V důsledku studií o transplantaci preparátů embryonální nervové tkáně do ventrikulárního systému mozku (aby se zabránilo poranění parenchymu striata) byly získány informace o jejich pozitivním vlivu na motorickou poruchu u parkinsonismu.

V jiných studiích však experimentální pozorování ukázala, že transplantace preparátů embryonální nervové tkáně ventrálního mesencefalonu obsahujících dopaminergní neurony do mozkové komory, stejně jako transplantace GABA-ergních embryonálních nervových elementů do striata potkanů s hemiparkinsonismem, nepodporuje obnovu narušených funkcí dopaminergního systému. Naopak imunocytochemická analýza potvrdila údaje o nízké míře přežití dopaminergních neuronů ventrálního mesencefalonu transplantovaných do striata potkanů. Terapeutický účinek intraventrikulární transplantace embryonální nervové tkáně ventrálního mesencefalonu byl realizován pouze za podmínky současné implantace preparátu embryonálních striatálních buněk do denervovaného striata. Autoři se domnívají, že mechanismus tohoto účinku je spojen s pozitivním trofickým účinkem GABA-ergních elementů embryonálního striata na specifickou dopaminergní aktivitu intraventrikulárních transplantátů ventrálního mesencefalonu. Výrazná gliová reakce v transplantátech byla doprovázena mírnou regresí parametrů apomorfinového testu. To zase korelovalo s obsahem GFAP v krevním séru, což přímo naznačovalo porušení propustnosti hematoencefalické bariéry. Na základě těchto údajů autoři dospěli k závěru, že hladina GFAP v krevním séru může být použita jako adekvátní kritérium pro posouzení funkčního stavu transplantátu a zvýšená propustnost hematoencefalické bariéry pro neurospecifické antigeny, jako je GFAP, je patogenetickým článkem ve vývoji selhání transplantátu v důsledku autoimunitního poškození nervové tkáně příjemce.

Z pohledu jiných výzkumníků je uchycení a integrace nervových kmenových buněk po transplantaci stabilní a celoživotní, protože dárcovské buňky se u příjemců nacházejí nejméně dva roky po transplantaci a bez významného poklesu jejich počtu. Pokusy vysvětlit to skutečností, že v nediferencovaném stavu nervové kmenové buňky neexprimují molekuly MHC třídy I a II na úrovni dostatečné k vyvolání imunitní odmítací reakce, lze považovat za pravdivé pouze ve vztahu k nízko diferencovaným nervovým prekurzorům. Ne všechny nervové kmenové buňky v mozku příjemce se však uchovávají v nezralém dormantním stavu. Většina z nich podléhá diferenciaci, během níž jsou molekuly MHC exprimovány v plném rozsahu.

Zejména nedostatečná účinnost použití intrastriatální transplantace preparátů embryonálního ventrálního mesencefalonu obsahujících dopaminergní neurony k léčbě experimentálního parkinsonismu je spojena s nízkou mírou přežití transplantovaných dopaminergních neuronů (pouze 5-20 %), která je způsobena reaktivní gliózou doprovázející lokální trauma mozkového parenchymu během transplantace. Je známo, že lokální trauma mozkového parenchymu a souběžná glióza vedou k narušení integrity hematoencefalické bariéry s uvolňováním antigenů nervové tkáně, zejména OCAR a neuron-specifického antigenu, do periferní krve. Přítomnost těchto antigenů v krvi může způsobit produkci specifických cytotoxických protilátek proti nim a rozvoj autoimunitní agrese.

V. Tsymbalyuk a spoluautoři (2001) uvádějí, že stále platí tradiční názor, podle kterého je centrální nervový systém imunologicky privilegovanou zónou izolovanou od imunitního systému hematoencefalickou bariérou. Ve svém přehledu literatury autoři citují řadu prací, které naznačují, že tento názor plně neodpovídá podstatě imunitních procesů v mozku savců. Bylo zjištěno, že značené látky zavedené do mozkového parenchymu se mohou dostat do hlubokých krčních lymfatických uzlin a po intracerebrální injekci antigenů se v těle tvoří specifické protilátky. Buňky krčních lymfatických uzlin reagují na takové antigeny proliferací, počínaje 5. dnem po injekci. Tvorba specifických protilátek byla také zjištěna při transplantaci kůže do mozkového parenchymu. Autoři přehledu uvádějí několik hypotetických cest pro transport antigenů z mozku do lymfatického systému. Jednou z nich je přechod antigenů z perivaskulárních prostorů do subarachnoidálního prostoru. Předpokládá se, že perivaskulární prostory lokalizované podél velkých mozkových cév jsou ekvivalentem lymfatického systému v mozku. Druhá cesta vede podél bílých vláken - přes ethmoidní kost do lymfatických cév nosní sliznice. Kromě toho existuje v tvrdé pleně mozkové rozsáhlá síť lymfatických cév. Nepropustnost hematoencefalické bariéry pro lymfocyty je také poměrně relativní. Bylo prokázáno, že aktivované lymfocyty jsou schopny produkovat enzymy, které ovlivňují propustnost struktur mozkového "imunitního filtru". Na úrovni postkapilárních venul pronikají aktivované T-helpery intaktní hematoencefalickou bariérou. Teze o absenci buněk v mozku, které reprezentují antigeny, neobstojí v kritice. V současné době je přesvědčivě prokázána možnost reprezentace antigenů v CNS alespoň třemi typy buněk. Zaprvé se jedná o dendritické buňky odvozené z kostní dřeně, které jsou lokalizovány v mozku podél velkých krevních cév a v bílé hmotě. Za druhé, antigeny jsou schopny prezentovat endotelové buňky mozkových cév a ve spojení s antigeny MHC podporují klonální růst T buněk specifických pro tyto antigeny. Za třetí, mikro- a astrogliální buňky fungují jako antigen prezentující činidla. Astrocyty se podílejí na tvorbě imunitní odpovědi v centrálním nervovém systému, získávají vlastnosti imunitních efektorových buněk a exprimují řadu antigenů, cytokinů a imunomodulátorů. Při inkubaci s γ-interferonem (γ-INF) astrogliální buňky in vitro exprimují antigeny MHC třídy I a II a stimulované astrocyty jsou schopny prezentace antigenu a udržování klonální proliferace lymfocytů.

Trauma mozkové tkáně, pooperační zánět, edém a fibrinové depozita doprovázející transplantaci embryonální nervové tkáně vytvářejí podmínky pro zvýšenou propustnost hematoencefalické bariéry s poruchou autotolerance, senzibilizací a aktivací CD3+CD4+ lymfocytů. Prezentaci auto- a aloantigenů provádějí astrocyty a mikrogliální buňky, které reagují na y-INF expresí molekul MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulačních molekul B7-1 (CD80) a B7-2 (CD86), jakož i sekrecí IL-1a, IL-ip a y-INF.

V důsledku toho lze skutečnost delšího přežití embryonální nervové tkáně po intracerebrální transplantaci než po jejím periferním podání jen stěží spojovat s absencí iniciace transplantační imunity. Navíc monocyty, aktivované lymfocyty (cytotoxické CD3+CD8+ a T-helper buňky) a jimi produkované cytokiny, stejně jako protilátky proti antigenům periferního transplantátu embryonální nervové tkáně, hrají v procesu jeho odmítnutí významnou roli. Nízká úroveň exprese molekul MHC v embryonální nervové tkáni má určitý význam pro vytváření podmínek pro delší rezistenci neurotransplantátů vůči imunitním procesům T-buněk. Proto se v experimentu imunitní zánět po transplantaci embryonální nervové tkáně do mozku rozvíjí pomaleji než po kožním štěpu. Nicméně po 6 měsících je pozorována úplná destrukce jednotlivých transplantátů nervové tkáně. V tomto případě jsou T-lymfocyty omezené antigeny MHC třídy II převážně lokalizovány v transplantační zóně (Nicholas a kol., 1988). Experimentálně bylo zjištěno, že během xenologické neurotransplantace prodlužuje deplece T-helperů (L3T4+), nikoli však cytotoxických T-lymfocytů (Lyt-2), přežití nervové tkáně potkanů v mozku myší příjemce. Odmítnutí neurotransplantátu je doprovázeno jeho infiltrací makrofágy a T-lymfocyty hostitele. V důsledku toho makrofágy hostitele a aktivované mikrogliální buňky fungují in situ jako imunostimulační buňky prezentující antigen a zvýšená exprese antigenů MHC třídy I dárce zvyšuje zabíjecí aktivitu cytotoxických T-lymfocytů příjemce.

Nemá smysl analyzovat četné spekulativní pokusy vysvětlit fakt odmítnutí neurotransplantátu reakcí imunitního systému příjemce na endotelové buňky nebo gliové elementy dárce, protože i čisté linie nervových progenitorových buněk jsou vystaveny imunitnímu útoku. Je pozoruhodné, že exprese Fas ligandů mozkovými buňkami, které se vážou na receptory apoptózy (molekuly Fas) na T lymfocytech infiltrujících mozek a indukují jejich apoptózu, hraje důležitou roli v mechanismech delšího přežití transplantátu v CNS, což je typický ochranný mechanismus transbariérových autoimunogenních tkání.

Jak správně poznamenávají V. Tsymbalyuk a spoluautoři (2001), transplantace embryonální nervové tkáně je charakterizována rozvojem zánětu za účasti buněk senzibilizovaných na mozkové antigeny a aktivovaných buněk, protilátek a také v důsledku lokální produkce cytokinů. Důležitou roli v tom hraje již existující senzibilizace organismu na mozkové antigeny, která probíhá během rozvoje onemocnění CNS a může být zaměřena na transplantační antigeny. Proto je skutečně dlouhodobého přežití histoinkompatibilních neurotransplantátů dosaženo pouze potlačením imunitního systému cyklosporinem A nebo zavedením monoklonálních protilátek do CD4+ lymfocytů příjemce.

Mnoho problémů neurotransplantace tak zůstává nevyřešených, včetně těch, které se týkají imunologické kompatibility tkání, a které lze vyřešit pouze po cíleném základním a klinickém výzkumu.