Krvetvorné kmenové buňky z pupečníkové krve

Pupečníková krev je dobrým zdrojem hematopoetických kmenových buněk z hlediska proliferačního potenciálu a repopulačních schopností hematopoetických buněk. Opakovaně bylo prokázáno, že v době narození obsahuje pupečníková krev dostatečně velký počet slabě vázaných hematopoetických progenitorových buněk. Někteří autoři se domnívají, že výhodou transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve je absence nutnosti hledat dárce kompatibilního s HLA antigeny. Podle jejich názoru nezralost imunitního systému novorozence způsobuje sníženou funkční aktivitu imunokompetentních buněk, a v důsledku toho nižší výskyt závažné reakce štěpu proti hostiteli než u transplantace kostní dřeně. Zároveň míra přežití transplantovaných buněk z pupečníkové krve není nižší než u buněk kostní dřeně, a to ani v případě použití menšího počtu HSC podávaných na 1 kg tělesné hmotnosti pacienta. Podle našeho názoru však otázky optimálního počtu transplantovaných buněk pupečníkové krve potřebných pro efektivní uchycení v těle příjemce, jejich imunologická kompatibilita a řada dalších aspektů problému transplantace hematopoetických kmenových buněk pupečníkové krve vyžadují serióznější analýzu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Získání hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve

Postup získávání hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve vyžaduje její odběr ihned po narození dítěte a jeho oddělení od placenty, když je placenta in utero nebo ex utero, a také během císařského řezu, ale i ex utero. Bylo prokázáno, že pokud se doba od okamžiku porodu do oddělení novorozence od placenty zkrátí na 30 sekund, objem získané pupečníkové krve se zvýší v průměru o 25-40 ml. Pokud se tento postup provede později, ztratí se stejné množství krve. Bylo zjištěno, že časné oddělení dítěte od placenty nemá pro novorozence žádné negativní důsledky.

Ruský výzkumný ústav hematologie a transfuziologie vyvinul efektivní a nízkonákladové technologie pro získávání pupečníkové krve jak při normálním porodu ((70,2+25,8) ml), tak při císařském řezu ((73,4+25,1) ml). Byla navržena metoda pro separaci pupečníkové krve s dostatečně vysokým výtěžkem jaderných a mononukleárních buněk - (83,1+9,6) a (83,4+14,1) %. Byla vylepšena metoda kryokonzervace pupečníkové krve, která zajišťuje vysokou konzervaci mononukleárních buněk a CFU-GM - (96,8+5,7) a (89,6+22,6) %. Byla stanovena účinnost drenážní metody pro odběr pupečníkové krve pomocí kontejneru Kompoplast-300 (Rusko). Autoři provedli odběr pupečníkové krve bezprostředně po narození dítěte a jeho oddělení od placenty, za podmínek umístění placenty in utero nebo ex utero. Před punkcí pupeční žíly byla pupeční šňůra jednou ošetřena 5% jodovou tinkturou a poté dvakrát 70% ethylalkoholem. Krev spontánně odtekla spojovacími hadičkami do nádobky. Odběr netrval déle než 10 minut. Průměrný objem 66 vzorků pupečníkové krve odebraných drenáží byl (72+28) ml a počet leukocytů v průměrném celkovém objemu vzorku byl (1,1+0,6) x 107. Při analýze pupečníkové krve na sterilitu (bakteriální kontaminace, HIV-1, viry hepatitidy B a C, syfilis a cytomegalovirová infekce) byly protilátky IgG proti viru hepatitidy C detekovány pouze v jednom vzorku. V jiné studii byla placenta ihned po porodu umístěna plodovou plochou dolů na speciální rám, pupeční šňůra byla ošetřena 5% roztokem jódu a 75% ethylalkoholem. Pupeční žíla byla drenována pomocí jehly z transfuzního systému (G16). Krev do nádobky tekla spontánně. Průměrný objem takto odebrané krve byl (55+25) ml. V práci G. Koglera a kol. (1996) byla pupečníková krev odebrána uzavřenou metodou a byly získány velké objemy krve - v průměru (79+26) ml. Autoři poznamenávají, že z 574 vzorků pupečníkové krve obsahovalo asi 7 % méně než 40 ml krve, což neumožňuje jejich použití k transplantaci. K. Isoyama a kol. (1996) při odběru pupečníkové krve aktivní exfuzí pomocí injekčních stříkaček získali průměrně 69,1 ml krve (objem pupečníkové krve se pohyboval od 15 do 135 ml). Nakonec se A. Abdel-Mageed PI a kol. (1997) podařilo získat průměrně 94 ml pupečníkové krve (od 56 do 143 ml) katetrizací pupečníkové žíly.

Pro snížení rizika iatrogenní infekce a kontaminace mateřskými sekrety byl vyvinut uzavřený systém odběru krve, založený na široce používaném transfuzním systému společnosti Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), obsahující 62,5 ml CPDA (citrát-fosfát-dextróza s adeninem) jako antikoagulancium. Technologie získávání materiálu má prvořadý význam pro přípravu vysoce kvalitního vzorku z hlediska objemu, obsahu a čistoty buněčné suspenze. Z existujících metod odběru pupečníkové krve, které se konvenčně dělí na uzavřené, polootevřené a otevřené systémy, by měla být upřednostněna první metoda, protože uzavřený systém významně snižuje riziko mikrobiální kontaminace materiálu, stejně jako kontaminace buněčné suspenze mateřskými buňkami.

A. Nagler a kol. (1998) provedli srovnávací analýzu účinnosti všech tří systémů pro odběr pupečníkové krve. V první variantě byl postup proveden v uzavřeném systému exfoliací krve přímo do nádoby. Ve druhé variantě byla pupečníková krev získána aktivní exfuzí krve pomocí stříkačky MP1 s následným propláchnutím placentárních žil a současným odtokem krve do nádoby (otevřená metoda). Ve třetí variantě byla krev odebrána v polootevřeném systému aktivním odběrem pomocí stříkaček a propláchnutím pupečníkovou tepnou se současným odtokem do nádoby. V první variantě autoři získali pupečníkovou krev v objemu (76,4+32,1) ml s obsahem leukocytů (10,5+3,6) x 10⁶ ^v 1 ml krve. Ve druhé variantě byly odpovídající ukazatele (174,4+42,8) ml a (8,8+3,4) x 10⁶ ^/ ml; ve třetím - (173,7+41,3) ml a (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Nejčastější infekce vzorků pupečníkové krve byla pozorována při použití otevřeného systému. Byla zjištěna přímá korelace mezi hmotností placenty a objemem odebrané krve - se zvyšující se hmotností placenty se zvyšuje množství odebrané krve.

Po odběru pupečníkové krve následuje fáze separace - izolace mononukleárních buněk a purifikace buněčné suspenze z erytrocytů. V experimentálních podmínkách se jaderné buňky izolují sedimentací s methylcelulózou během lýzy erytrocytů chloridem amonným. Methylcelulóza by se však neměla používat pro klinické účely, protože ztráty hematopoetických kmenových buněk na ní dosahují 50-90 %. Lýza erytrocytů se v klinické praxi také téměř neprovádí kvůli velkým objemům pracovního roztoku, ačkoli procento izolace jaderných buněk s fenotypem CD34+, stejně jako progenitorových buněk s funkcí CFU-GM a CFU-GEMM tímto způsobem, je výrazně vyšší. Je hlášen vznik nového prostředku pro izolaci mononukleárních buněk v hustotním gradientu, roztoku buyant density (BDS72). Tato látka má následující fyziologické parametry: pH - 7,4, osmolalita - 280 mOsm/kg, hustota - 1,0720 g/ml. Podle autorů lze s jeho pomocí izolovat až 100 % CD34-pozitivních buněk a odstranit 98 % erytrocytů. BDS72 se však v klinické praxi zatím nepoužívá.

V schválených metodách izolace jaderných buněk z pupečníkové krve se obvykle používá 10% roztok hydroxyethylškrobu nebo 3% roztok želatiny. Účinnost sedimentace erytrocytů a izolace jaderných buněk je v obou případech přibližně stejná. Pokud se však jako sedimentační činidlo použije želatina, je možné získat o něco větší množství CFU-GM než při použití hydroxyethylškrobu. Předpokládá se, že rozdíly v účinnosti izolace CFU-GM jsou způsobeny různými rychlostmi sedimentace jednotlivých frakcí jaderných buněk nebo schopností molekul hydroxyethylškrobu absorbovat se na povrchu receptorů hematopoetických buněk a tím blokovat jejich citlivost na faktory stimulující kolonie používané při kultivaci CFU-GM in vitro. Nicméně oba sedimentátory mohou být vhodné pro izolaci jaderných buněk při vytváření velkých bank pupečníkové krve.

Metody separace a kryokonzervace pupečníkové krve se v zásadě neliší od metod používaných při práci s hematopoetickými kmenovými buňkami periferní krve a kostní dřeně dospělých dárců. Při přípravě velkého množství vzorků pupečníkové krve pro její banky však musí být metody separace v první řadě nízkonákladové. Proto se bohužel v současné době pro klinické potřeby používají již osvědčené rutinní metody izolace a kryokonzervace buněk pupečníkové krve a účinnější, ale nákladnější metody zůstávají údělem experimentátorů.

Obecně byla schválena kritéria pro hodnocení počtu krvetvorných buněk a požadavky na vyšetření vzorků pupečníkové krve za účelem identifikace infekčních agens. Aby byla zajištěna bezpečnost transplantace krvetvorných buněk z pupečníkové krve, musí být všechny vzorky krve vyšetřeny především na hematogenně přenosné infekce a genetická onemocnění. Řada autorů doporučuje další speciální metody vyšetřování pupečníkové krve k diagnostice genetických onemocnění, jako je a-talasemie, srpkovitá anémie, deficit adenosindeaminázy, Brutonova agamaglobulinémie, Hurlerova a Ponterova choroba.

Dle doporučení L. Ticheliho a spoluautorů (1998) musí být každý vzorek pupečníkové krve testován na přítomnost jaderných buněk, CD34-pozitivních buněk a CFU-GM, musí být provedena HLA typizace a stanovení krevní skupiny dle ABO a jejího Rh faktoru. Dále musí být provedena bakteriologická kultivace, sérologické vyšetření na HIV a cytomegalovirovou infekci, HBsAg, virovou hepatitidu C, HTLY-I a HTLV-II (lidská T-buněčná leukémie), syfilis a toxoplazmózu. Polymerázová řetězová reakce na cytomegalovirus a HIV infekci je povinná.

Postup odběru pupečníkové krve musí být prováděn v přísném souladu se zásadami lékařské bioetiky. Před odběrem krve je nutné získat souhlas těhotné ženy s jeho provedením. Předběžný rozhovor s těhotnou ženou za účelem získání informovaného souhlasu se všemi manipulacemi, od odběru krve až po vyplnění dokumentace, provádějí pouze zdravotničtí pracovníci. V žádném případě není přípustné, aby kterýkoli z těchto postupů prováděl personál s biologickým, chemickým, farmaceutickým nebo jiným nelékařským vzděláním, a to z důvodu porušení zavedených norem bioetiky a lidských práv. V případě pozitivních testů na nosičství HBsAg, přítomnost protilátek proti patogenům hepatitidy C, HIV infekce a syfilisu se pupečníková krev neodebírá a vzorky již odebrané krve se odmítají a ničí. Je třeba poznamenat, že nosičství latentních infekcí u novorozenců je mnohem méně časté než u dospělých, proto je pravděpodobnost hematogenního přenosu a vzniku infekčních komplikací během infuzí krvetvorných buněk pupečníkové krve výrazně nižší než v případě použití kostní dřeně dospělého dárce k transplantaci.

Důležitým aspektem klinického využití pupečníkové krve je hodnocení transplantace, které je založeno na stanovení množství hematopoetických kmenových buněk ve vzorku pupečníkové krve a dávek buněk potřebných k transplantaci. V současné době dosud nebyly vyvinuty standardy pro optimální množství buněk pupečníkové krve potřebných k transplantaci. Neexistuje obecně přijímaný názor ani na takové rutinní parametry, jako je počet CD34-pozitivních buněk a CFU-GM. Někteří autoři hodnotí potenciál hematopoetických buněk analýzou dlouhodobých kultur se stanovením obsahu jednotek tvořících kolonie společných pro granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocyty - CFU-GEMM.

V klinickém prostředí však standardní hodnocení transplantace pupečníkové krve obvykle zahrnuje pouze stanovení počtu jaderných nebo mononukleárních buněk.

Skladování hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve

V technologii skladování hematopoetických buněk pupečníkové krve existují i určité problémy. Při kryokonzervaci hematopoetických kmenových buněk je pro dosažení optimálního režimu mrazení nutné co nejvíce zmenšit objem pupečníkové krve a také předem odstranit erytrocyty, aby se zabránilo hemolýze a riziku vzniku reakce inkompatibility s erytrocytárními antigeny (ABO, Rh). Pro tyto účely jsou vhodné různé metody izolace jaderných buněk. Na počátku 90. let minulého století byla nejrozšířenější metodou izolace jaderných buněk v hustotním gradientu na bázi Ficollu s hustotou 1,077 g/ml nebo Percollu s hustotou 1,080 g/ml. Separace pupečníkové krve v hustotním gradientu umožňuje izolaci převážně mononukleárních buněk, ale vede k významným ztrátám hematopoetických progenitorových buněk - až 30-50 %.

Sedimentační účinnost hydroxyethylškrobu v procesu izolace krvetvorných buněk pupečníkové krve je hodnocena různě. Někteří autoři poukazují na nízkou kvalitu separace touto metodou, zatímco jiní výzkumníci naopak ze všech možných metod upřednostňují izolaci HSC pupečníkové krve za použití 6% roztoku hydroxyethylškrobu. Zároveň je zdůrazňována vysoká účinnost sedimentace krvetvorných buněk, která podle některých údajů dosahuje 84 % až 90 %.

Zastánci jiného úhlu pohledu se domnívají, že prakticky všechny frakcionační metody jsou spojeny s velkými ztrátami jaderných buněk a navrhují separaci provádět centrifugací, přičemž pupečníková krev se rozdělí na 3 frakce: erytrocyty, leukocytární prstenec a plazmu. Izolací buněk tímto způsobem autoři zjistili, že obsah mononukleárních buněk, časných hematopoetických progenitorových buněk a buněk s imunofenotypem CD34+ nakonec činil 90, 88 a 100 % počáteční úrovně. Podobné hodnoty pro nárůst buněk pupečníkové krve purifikovaných touto metodou získali i jiní výzkumníci: po sedimentaci bylo izolováno 92 % jaderných buněk, 98 % mononukleárních buněk, 96 % CD34-pozitivních buněk a 106 % jednotek tvořících kolonie.

Koncem 90. let 20. století se želatina široce používala jako sedimentační činidlo. V klinické praxi se želatina k izolaci hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve používá od roku 1994. Při použití 3% roztoku želatiny dosahuje účinnost izolace jaderných buněk 88–94 %. Rozsáhlé využití želatiny při vytváření banky pupečníkové krve potvrdilo její výhody oproti jiným sedimentačním činidlům. Srovnávací analýza účinnosti všech výše uvedených metod izolace jaderných buněk za podmínek jejich postupného použití na každém z testovaných vzorků pupečníkové krve prokázala, že 3% roztok želatiny je optimálním sedimentačním činidlem z hlediska výtěžku mononukleárních buněk s fenotypem CD34+/CD45+, stejně jako z hlediska počtu CFU-GM a CFU-GEMM. Metody využívající gradient hustoty Ficoll, stejně jako použití hydroxyethylškrobu a methylcelulózy, byly výrazně méně účinné, přičemž ztráty hematopoetických buněk dosáhly 60 %.

Rozšíření objemů transplantací kmenových buněk z pupečníkové krve je spojeno nejen s vývojem metod pro jejich získávání, ale i skladování. Existuje mnoho problémů přímo souvisejících s přípravou pupečníkové krve k dlouhodobému skladování a výběrem optimální technologie pro kryokonzervaci jejích vzorků. Mezi ně patří otázky proveditelnosti provádění separačních postupů, použití různých kryokonzervačních médií a aplikace metod pro přípravu rozmrazených buněk k transplantaci. Transport vzorků nativní pupečníkové krve se často provádí z oblastí vzdálených od hematologických center. V tomto ohledu vyvstává problém přijatelných dob skladování pupečníkové krve od okamžiku jejího získání do zahájení kryokonzervace, což má zvláštní význam při vytváření bank pupečníkové krve.

Studie funkční aktivity hematopoetických buněk v pupečníkové krvi po dlouhodobém skladování (až 12 let) v tekutém dusíku ukázala, že přibližně 95 % hematopoetických buněk během tohoto období neztrácí svou vysokou proliferační kapacitu. V práci S. Yurasova a spoluautorů (1997) bylo prokázáno, že skladování pupečníkové krve při pokojové teplotě (22 °C) nebo při 4 °C po dobu 24 a 48 hodin významně nesnižuje životaschopnost hematopoetických buněk, která činí 92, respektive 88 % původní úrovně. Pokud se však doba skladování prodlouží na tři dny, počet životaschopných jaderných buněk v pupečníkové krvi výrazně klesá. Současně jiné studie ukázaly, že při skladování po dobu 2–3 dnů při 22 nebo 4 °C trpí především životaschopnost zralých granulocytů, nikoli hematopoetických buněk.

Životaschopnost hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve může být negativně ovlivněna složkami systémů pro odběr pupečníkové krve. Analýza vlivu různých antikoagulancií, jejichž mechanismus účinku je dán vazbou iontů vápníku (ACD, EDTA, XAPD-1), na hematopoetické progenitorové buňky za podmínek skladování pupečníkové krve po dobu 24 až 72 hodin, odhalila jejich negativní vliv na životaschopnost jaderných buněk. V tomto ohledu autoři doporučují používat PBS (roztok fosfátového pufru) s přídavkem nativního heparinu bez konzervační látky v koncentraci 20 U/ml, což podle jejich názoru umožňuje prodloužit dobu skladování nefrakcionované pupečníkové krve na 72 hodin a zachovává funkční aktivitu jednotek tvořících kolonie. Studie bezpečnosti CFU-GM a CFU-G však ukázala, že doba skladování pupečníkové krve před kryokonzervací by neměla překročit devět hodin. V tomto případě by samozřejmě měla platit zásada, že v případě protichůdných údajů by měla být použita minimální doporučená doba skladování pupečníkové krve a co nejdříve by mělo být zahájeno programované zmrazení izolovaných buněk.

Při zmrazování hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve se jako kryoprotektant obvykle používá 10% roztok DMSO. Kromě výrazného kryoprotektivního účinku má však dimethylsulfoxid v takové koncentraci také přímý cytotoxický účinek, a to i při minimální expozici hematopoetických buněk z pupečníkové krve. Pro snížení cytotoxického účinku DMSO se používá nulová expoziční teplota, zvyšuje se rychlost všech manipulací a po rozmrazení vzorků pupečníkové krve se provádí několik promytí.

Od roku 1995 Institut hematologie a transfuziologie Akademie lékařských věd Ukrajiny rozvíjí vědecký směr zaměřený na komplexní studium pupečníkové krve jako alternativního zdroje hematopoetických kmenových buněk. Zejména byly vyvinuty nové technologie pro nízkoteplotní kryokonzervaci hematopoetických buněk nefrakcionované a frakcionované pupečníkové krve. Jako kryoprotektant se používá nízkomolekulární lékařský polyvinylpyrrolidon. Metoda kryokonzervace nefrakcionované pupečníkové krve je založena na originální technologii pro předpřípravu buněk k zmrazení a metodě speciálního zpracování buněčné suspenze bezprostředně před transplantací.

Jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících úroveň funkční aktivity kryokonzervovaných hematopoetických kmenových buněk je rychlost ochlazování buněčné suspenze, zejména během fáze krystalizace. Softwarový přístup k řešení problému rychlosti a doby zmrazování poskytuje velké možnosti pro vytváření jednoduchých a vysoce účinných metod kryokonzervace, bez nutnosti promývání buněčné suspenze od kryoprotektorů před transplantací.

Nejnebezpečnějšími fázemi pro životaschopnost buněk během jejich přípravy jsou fáze přímého zmrazování a rozmrazování. Při zmrazování krvetvorných buněk může být jejich významná část zničena v okamžiku přechodu mezibuněčného média z kapalné do pevné fáze - krystalizace. Pro snížení procenta buněčné smrti se používají kryoprotektory, jejichž mechanismy účinku a kryoprotektivní účinnost jsou dostatečně popsány ve vědecké literatuře.

Slibným směrem pro optimalizaci metod kryokonzervace buněk kostní dřeně a pupečníkové krve je kombinace nízkých koncentrací několika kryoprotektorů s různými mechanismy účinku v jednom roztoku, například DMSO působícího na intracelulární úrovni a hydroxyethylškrobu nebo albuminu, které mají extracelulární ochranný účinek.

Pro kryokonzervaci buněk pupečníkové krve se tradičně používá 20% roztok DMSO, který se za stálého mechanického míchání v ledové lázni pomalu přilévá do buněčné suspenze, dokud se nedosáhne stejného poměru (1:1) objemu kryoprotektantu a buněčné suspenze. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu je 10 %. Buněčná suspenze se poté ochladí v programované kryogenní jednotce rychlostí GS/min na -40 °C, načež se rychlost chlazení zvýší na 10 °C/min. Po dosažení -100 °C se nádoba s buněčnou suspenzí umístí do tekutého dusíku (-196 °C). Při této technice kryokonzervace dosahuje zachování funkčně aktivních mononukleárních buněk po rozmrazení 85 % původní úrovně.

Modifikace metod kryokonzervace jsou zaměřeny na snížení koncentrace DMSO přidáním hydroxyethylškrobu (konečné koncentrace dimethylsulfoxidu a hydroxyethylškrobu jsou 5 %, respektive 6 %). Vysoká účinnost takové kombinace kryoprotektorů je pozorována při zmrazení suspenze myeloidních buněk, a to při neméně cytoprotekci než při použití pouze 10% roztoku dimethylsulfoxidu. Počet životaschopných jaderných buněk dosáhl 96,7 % počáteční úrovně a jejich funkční aktivita, odhadnutá počtem CFU-GM, byla 81,8 %.

Při použití roztoku dimethylsulfoxidu v koncentracích od 5 do 10 % v kombinaci se 4% hydroxyethylškrobem (konečná koncentrace) bylo zjištěno, že bezpečnost CD34-pozitivních buněk v těchto rozmezích dimethylsulfoxidu zůstává prakticky nezměněna. Současně, když koncentrace dimethylsulfoxidu klesne z 5 na 2,5 %, je pozorována masivní smrt buněk pupečníkové krve - počet životaschopných buněčných jednotek klesá z 85,4 na 12,2 %. I další autoři dospěli k závěru, že právě 5 a 10% roztoky dimethylsulfoxidu (v autorově verzi - v kombinaci s autologním sérem) poskytují cytoprotekci s maximální účinností během kryokonzervace HSC pupečníkové krve. Kromě toho je zaznamenána vysoká konzervace postupně zmrazených a rozmrazených buněk v případě kombinace 5 nebo 10% dimethylsulfoxidu se 4% roztokem hydroxyethylškrobu, zejména při kontrolované rychlosti chlazení GS/min. V jiné studii byl použit kryoprotektivní roztok sestávající ze tří složek - DMSO, purifikovaného lidského albuminu a média RPMI v poměru 1:4:5, který byl přidán do buněčné suspenze v poměru stejných objemů (konečná koncentrace dimethylsulfoxidu byla 5 %). Po rozmrazení ve vodní lázni při teplotě +4 GS překročila konzervace CFU-GM 94 %.

Někteří autoři doporučují pro kryokonzervaci používat nefrakcionovanou pupečníkovou krev, protože během procesu odstraňování červených krvinek se ztrácí značné množství hematopoetických buněk. V této variantě se k ochraně mononukleárních buněk před škodlivými účinky kryokrystalizace používá 10% roztok dimethylsulfoxidu. Zmrazování se provádí konstantní rychlostí chlazení GS/min na -80 °C, po které se suspenze buněk pupečníkové krve ponoří do tekutého dusíku. Tato metoda zmrazování vede k částečné lýze červených krvinek, takže vzorky krve nevyžadují frakcionaci. Po rozmrazení se buněčná suspenze promyje od volného hemoglobinu a dimethylsulfoxidu v roztoku lidského albuminu nebo v autologním krevním séru pacienta a použije se k transplantaci.

Zachování hematopoetických progenitorových buněk po rozmrazení nefrakcionované pupečníkové krve je sice vyšší než u frakcionované pupečníkové krve, nicméně vzhledem ke kryostatitě některých erytrocytů mohou vzniknout vážné posttransfuzní problémy v důsledku transfuze erytrocytů nekompatibilních s ABO. Kromě toho se výrazně zvyšuje objem skladované nefrakcionované krve. Z klinického hlediska je stále výhodnější kryokonzervace hematopoetických buněk pupečníkové krve dříve izolovaných a purifikovaných z jiných buněčných frakcí.

Zejména byla vyvinuta metoda kryokonzervace frakcionovaných buněk pupečníkové krve, která umožňuje odstranění erytrocytů ve fázi přípravy k zmrazení, při níž se jako součást plazma-náhradního roztoku „Stabiloz“ používá 6% roztok hydroxyethylškrobu. Po rozmrazení je takto získaná buněčná suspenze připravena ke klinickému použití bez dalších manipulací.

V současné době tedy existuje mnoho poměrně účinných metod kryokonzervace pupečníkové krve. Jejich zásadní rozdíl spočívá v tom, že vzorky krve se zmrazují nefrakcionované nebo se ve fázi přípravy podrobují separaci na buněčné frakce a připravují se jaderné buňky bez příměsi erytrocytů.

Transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve

Koncem 80. a začátkem 90. let 20. století bylo zjištěno, že pupečníková krev, která poskytuje plodu během těhotenství podporu života, má vysoký obsah hematopoetických kmenových buněk. Relativní jednoduchost získávání buněk pupečníkové krve a absence zjevných etických problémů přispěly k využití kmenových buněk z pupečníkové krve v praktické medicíně. První úspěšná transplantace pupečníkové krve dítěti s Fanconiho anémií sloužila jako výchozí bod pro rozšíření objemu transplantací kmenových buněk z pupečníkové krve a vytvoření systému pro její ukládání. V celosvětovém systému bank pupečníkové krve je největší Newyorské centrum placentární krve, které je v rozvaze amerického Národního institutu zdraví. Počet uložených vzorků pupečníkové krve v této bance se blíží 20 000. Roste také počet příjemců (většinou dětí), kteří podstoupili úspěšnou transplantaci. Podle amerického ministerstva zdravotnictví již přesahuje období bez relapsu po transplantaci příjemců transplantované pupečníkové krve 10 let.

To není překvapivé, jelikož četné studie hematopoetického potenciálu pupečníkové krve ukázaly, že co se týče množství a kvality nejranějších kmenových buněk, nejenže není horší než kostní dřeň dospělého, ale v některých ohledech ji i převyšuje. Vyšší proliferační potenciál kmenových buněk pupečníkové krve je dán ontogenetickými vlastnostmi buněčné signalizace, přítomností receptorů pro specifické růstové faktory na HSC, schopností buněk pupečníkové krve autokrinně produkovat růstové faktory a velkou velikostí a délkou telomer.

Genomické a fenotypové charakteristiky hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve tedy předurčují vysoce kvalitní uchycení transplantátu s vysokým potenciálem pro obnovení hematopoézy dárce v těle příjemce.

Výhody hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve

Mezi skutečné výhody použití krvetvorných buněk z pupečníkové krve k transplantaci oproti jiným zdrojům krvetvorných buněk stojí za zmínku prakticky nulové riziko pro zdraví dárce (pokud nepočítáme placentu jako takovou) a absence potřeby celkové anestezie. Použití pupečníkové krve rozšiřuje možnosti transplantace buněk díky částečně HLA-kompatibilním transplantátům (nekompatibilita od jednoho do tří antigenů). Byla vyvinuta metoda dlouhodobého skladování krvetvorných buněk z pupečníkové krve v zmrazeném stavu, která zvyšuje pravděpodobnost získání vzácných HLA typů a zkracuje dobu hledání HLA-kompatibilního transplantátu pro alogenní transplantaci. Zároveň se výrazně snižuje riziko vzniku některých latentních infekcí přenášených přenosnými cestami. Navíc díky možnosti použití buněk z pupečníkové krve k autologní transplantaci vzniká levná forma biologického životního pojištění.

Vzhledem k malým objemům krve, které lze z placenty odebrat (v průměru ne více než 100 ml), se však do popředí dostává problém získání maximálního možného množství krve z pupečníkové žíly při striktním dodržování podmínky minimálního rizika bakteriální kontaminace odebraných vzorků pupečníkové krve.

Primitivní hematopoetické buňky z pupečníkové krve se obvykle identifikují na základě přítomnosti glykofosfoproteinu CD34 na jejich povrchu, stejně jako na základě jejich funkčních vlastností studiem klonogenity nebo tvorby kolonií in vitro. Srovnávací analýza ukázala, že v pupečníkové krvi a kostní dřeni je maximální obsah CD34-pozitivních buněk v mononukleární frakci 1,6 %, respektive 5,0 %, maximální hladina jednotek tvořících kolonie v subpopulaci CD34+ buněk je 80 %, respektive 25 %, celková účinnost klonování CD34+ buněk je 88 %, respektive 58 %, maximální obsah buněk tvořících kolonie s vysokým proliferačním potenciálem (HPP-CFC v populaci CD34+) je 50 %, respektive 6,5 %. Je třeba dodat, že účinnost klonování buněk CD34+CD38 a schopnost reagovat na stimulaci cytokiny jsou také vyšší u hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve.

Kombinace fenotypových antigenů Thy-1, CD34 a CD45RA potvrzuje vysoký proliferační potenciál hematopoetických buněk pupečníkové krve a exprese těchto tří antigenů na povrchu buněk pupečníkové krve naznačuje jejich příslušnost ke kmenovým buňkám. Dále bylo zjištěno, že pupečníková krev obsahuje buňky s fenotypem CD34+, které nemají markery lineární diferenciace. Hladina buněčných subpopulací s fenotypovým profilem CD34+/Lin v pupečníkové krvi je asi 1 % z celkového počtu CD34-pozitivních buněk. Hematopoetické progenitorové buňky z pupečníkové krve dávají vznik jak lymfoidní buněčné linii, tak pluripotentní myeloidní sérii lineární buněčné diferenciace, což rovněž naznačuje jejich příslušnost ke kmenovým buňkám.

Jak již bylo zmíněno, významné rozdíly mezi kostní dření a pupečníkovou krví spočívají v množství hematopoetických buněk použitých k transplantaci získaných během jednoho odběrového postupu. Pokud je během transplantace kostní dřeně ztráta buněčné hmoty během separace, kryokonzervace, rozmrazování a testování přijatelná v rozmezí 40-50 %, pak u pupečníkové krve jsou takové ztráty buněk velmi významné, protože pokud se použije nedostatečné množství HSC, transplantace se může ukázat jako neúčinná. Podle G. Koglera a kol. (1998) mohou být u transplantace buněk s tělesnou hmotností příjemce 10 kg potenciálními transplantáty všechny vzorky pupečníkové krve (celkový počet odebraných vzorků pupečníkové krve je 2098), s tělesnou hmotností 35 kg - 67 % a pouze 25 % vzorků může zajistit účinnou transplantaci u pacientů s tělesnou hmotností 50-70 kg. Tato klinická situace naznačuje potřebu optimalizace a zlepšení účinnosti stávajících metod odběru, reprodukce a skladování buněk pupečníkové krve. Proto se v současné době v literatuře široce diskutuje o otázkách standardizace metod sběru, testování, separace a kryokonzervace pupečníkové krve pro vytváření krevních bank, jejím využití v klinické praxi a také o stanovení podmínek a postupů uchovávání hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Využití hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve v medicíně

^{Z pupečníkové krve je obvykle možné izolovat až 10⁶} hematopoetických kmenových buněk, zřídka více. V tomto ohledu zůstává dodnes otevřená otázka, zda je takové množství hematopoetických buněk z pupečníkové krve dostatečné k obnovení hematopoézy u dospělého příjemce. Názory na tuto záležitost se rozcházejí. Někteří badatelé se domnívají, že takové množství je zcela dostatečné pro transplantaci dětem, ale příliš malé pro transplantaci dospělému, pro kterého je optimálním množstvím podání (7-10) x 10⁶ ^CD34 -pozitivních buněk na 1 kg tělesné hmotnosti - průměrně 7 x 10⁶ ^na transplantaci. Z těchto výpočtů vyplývá, že jeden vzorek pupečníkové krve obsahuje 700krát méně hematopoetických kmenových buněk, než je potřeba pro jednu transplantaci dospělému pacientovi. Takové kvantitativní hodnocení se však provádí analogicky s počtem transfuzovaných buněk kostní dřeně a vůbec nezohledňuje ontogenetické rysy hematopoézy.

Zejména je ignorována skutečnost vyššího proliferačního potenciálu hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve ve srovnání s hematopoetickými progenitorovými buňkami z kostní dřeně. Výsledky studií potenciálu tvorby kolonií in vitro naznačují, že jedna dávka pupečníkové krve je schopna zajistit rekonstrukci hematopoézy dospělého příjemce. Na druhou stranu by se nemělo zapomínat, že počet kmenových buněk z pupečníkové krve klesá i během embryonálního vývoje: obsah CD34-pozitivních buněk v pupečníkové krvi lineárně klesá 5krát v období od 20. týdne (krev pro studii byla odebrána během předčasného ukončení těhotenství) do 40. týdne těhotenství (období fyziologického porodu), což je doprovázeno paralelní, trvale rostoucí expresí lineárních cytodiferenciačních markerů.

Vzhledem k absenci standardizovaného přístupu ke kvantitativnímu stanovení progenitorových buněk ve vzorcích pupečníkové krve pokračují debaty o optimální dávce hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve. Někteří výzkumníci se domnívají, že jako kritérium pro výběr vzorků pupečníkové krve lze použít počet jaderných buněk a mononukleárních buněk přepočítaný na tělesnou hmotnost příjemce, tj. jejich dávku. Někteří autoři se domnívají, že minimální kvantitativní prahová hodnota CD34+ buněk i pro autotransplantaci HSC je 2 x 106 ^/ kg. Zároveň zvýšení dávky hematopoetických buněk na 5 x 106 ^buněk /kg (pouze 2,5krát) již zajišťuje příznivější průběh časného posttransplantačního období, snižuje výskyt infekčních komplikací a zkracuje dobu preventivní antibiotické terapie.

Podle E. Gluckmana a kol. (1998) je v onkohematologii podmínkou úspěšné transplantace buněk pupečníkové krve zavedení alespoň 3,7 x 10 ⁷ jaderných buněk na 1 kg tělesné hmotnosti příjemce. Pokud se dávka hematopoetických kmenových buněk sníží na 1 x 10 ⁷ nebo méně jaderných buněk na 1 kg tělesné hmotnosti pacienta, riziko selhání transplantace a relapsu rakoviny krve prudce roste. Je třeba si uvědomit, že minimální počet progenitorových buněk nezbytný pro rychlé obnovení hematopoézy po alotransplantaci HSC je stále neznámý. Teoreticky toho lze dosáhnout pomocí jedné buňky, ale v klinické praxi transplantace kostní dřeně je rychlé a stabilní uchycení zaručeno transfuzí alespoň (1-3) x 10 ⁸ jaderných buněk na 1 kg tělesné hmotnosti pacienta.

Nedávná podrobná studie zaměřená na stanovení optimálního počtu HSC v onkohematologii zahrnovala pozorování pacientů ve třech skupinách, rozdělených v závislosti na obsahu CD34-pozitivních buněk v transplantovaném materiálu. Pacientům první skupiny bylo podáno (3-5) x 10⁶ ^buněk /kg. Dávka HSC u pacientů druhé skupiny byla (5-10) x 10⁶ ^buněk /kg a pacientům třetí skupiny bylo transplantováno více než 10 x 10⁶ ^CD34 + buněk/kg. Nejlepší výsledky byly pozorovány ve skupině příjemců, kteří obdrželi transplantaci s počtem CD34-pozitivních buněk rovným (3-5) x 10⁶ ^/ kg. Se zvýšením dávky transplantovaných buněk nad 5 x 10⁶ ^/ kg nebyly zjištěny statisticky významné výhody. V tomto případě je velmi vysoký obsah HSC v transplantátu (> 10 x 10⁶ ^/ kg) spojen s reinfuzí významného počtu zbytkových nádorových buněk, což vede k relapsu onemocnění. Přímý vztah mezi počtem transplantovaných alogenních progenitorových buněk a rozvojem reakce štěpu proti hostiteli nebyl stanoven.

Světové zkušenosti s transplantací pupečníkové krve potvrzují její vysoký repopulační potenciál. Míra uchycení transplantátu pupečníkové krve koreluje s počtem zavedených jaderných buněk. Nejlepších výsledků se dosahuje při transplantaci 3 x 10 ⁷ /kg, zatímco u kostní dřeně je tato dávka 2 x 10 ⁸ /kg. Podle údajů koordinačních center bylo na konci roku 2000 provedeno na celém světě 1200 transplantací buněk pupečníkové krve, převážně od příbuzných dárců (83 %). Je zřejmé, že pupečníková krev by měla být zvažována jako alternativa ke kostní dřeni pro transplantaci pacientům s hemoblastózami.

Zároveň neonatální povaha pupečníkové krve jako zdroje hematopoetické tkáně vzbuzuje optimismus vzhledem k přítomnosti funkčních rysů jejích HSC. Zároveň pouze klinické zkušenosti mohou odpovědět na otázku dostatečnosti jednoho vzorku pupečníkové krve k obnovení hematopoézy u dospělého příjemce s hematopoetickou aplázií. Transplantace buněk pupečníkové krve se používá v léčebných programech pro mnoho nádorových i nenádorových onemocnění: leukémie a myelodysplastické syndromy, non-Hodgkinův lymfom a neuroblastom, aplastická anémie, vrozené Fanconiho a Diamond-Blackfanovy anémie, deficit adheze leukocytů, Barrův syndrom, Guntherova choroba, Hurlerův syndrom, talasemie.

Imunologické aspekty transplantace hematopoetických buněk z pupečníkové krve si zaslouží pečlivou pozornost a samostatnou studii. Bylo prokázáno, že v případě transplantace kmenových buněk z pupečníkové krve od dárců s neúplnou HLA kompatibilitou jsou výsledky transplantace poměrně uspokojivé, což podle autorů naznačuje nižší imunoreaktivitu buněk z pupečníkové krve než kostní dřeně.

Detailní studie buněčného složení pupečníkové krve odhalila vlastnosti jak fenotypového spektra efektorových buněk imunitního systému, tak i jejich funkční aktivity, což umožnilo považovat pupečníkovou krev za zdroj HSC s relativně nízkým rizikem vzniku reakce „štěp proti hostiteli“. Mezi příznaky funkční nezralosti imunokompetentních buněk pupečníkové krve je třeba poznamenat nerovnováhu v produkci cytokinů a snížení citlivosti imunitní odpovědi na cytokiny. Výsledná inhibice aktivity cytotoxických lymfocytů je považována za faktor přispívající k tvorbě imunologické tolerance k transplantované hematopoetické tkáni. V populaci lymfocytů pupečníkové krve, na rozdíl od periferní krve a kostní dřeně dospělých dárců, převládají neaktivní, nezralé lymfocyty a supresorové buňky. To naznačuje sníženou připravenost T-lymfocytů pupečníkové krve k imunitní odpovědi. Důležitým rysem monocytární populace buněk pupečníkové krve je nízký obsah funkčně plnohodnotných a aktivních antigen prezentujících buněk.

Nízká zralost efektorových buněk imunitního systému v pupečníkové krvi na jedné straně rozšiřuje indikace pro její použití v klinické praxi, protože tyto vlastnosti zajišťují snížení intenzity imunitního konfliktu mezi buňkami dárce a příjemce. Na druhé straně je však známa existence korelace mezi stupněm rozvoje reakce „štěp versus hostitel“ a protinádorovým účinkem transplantace, tj. rozvojem efektu „štěp versus leukémie“. V tomto ohledu byla provedena studie protinádorové cytotoxicity buněk pupečníkové krve. Získané výsledky naznačují, že navzdory skutečně oslabené reakci imunokompetentních buněk pupečníkové krve na stimulaci antigenem jsou primárně aktivovanými lymfocyty přirození zabijáci (NAB) a zabijácké buňky (KILLER-like), které se aktivně podílejí na mechanismech realizace protinádorové cytotoxicity. Kromě toho byly v pupečníkové krvi nalezeny subpopulace lymfocytů s fenotypy CD16+CD56+ a CD16"TCRa/p+. Předpokládá se, že tyto buňky v aktivované formě realizují reakci „štěp versus leukémie“.

V Onkologickém ústavu Akademie lékařských věd Ukrajiny byly pacientům s rakovinou s přetrvávající hematopoetickou hypoplazií v důsledku chemoterapie a radioterapie podávány kryokonzervované hematopoetické buňky z pupečníkové krve. U těchto pacientů transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve poměrně účinně obnovila utlumenou hematopoézu, o čemž svědčí přetrvávající zvýšení obsahu zralých formovaných elementů v periferní krvi a také zvýšení ukazatelů charakterizujících stav buněčné a humorální imunity. Stabilita repopulačního efektu po transplantaci hematopoetických buněk z pupečníkové krve umožňuje pokračování v radioterapii a chemoterapii bez přerušení léčby. Existují informace o vyšší účinnosti alotransplantace kmenových buněk z pupečníkové krve u onkohematologických pacientů: roční riziko relapsu nádorového onemocnění při jejich použití bylo 25 % oproti 40 % u pacientů s transplantovanou alogenní kostní dření.

Mechanismus účinku kryokonzervovaných kmenových buněk z pupečníkové krve by měl být považován za výsledek humorální stimulace hematopoézy příjemce, způsobené jedinečnou schopností neonatálních buněk autokrinně produkovat hematopoetické růstové faktory, a také za důsledek dočasného uchycení dárcovských buněk (o čemž svědčí spolehlivé zvýšení obsahu fetálního hemoglobinu v periferní krvi příjemců 7.–15. den po transfuzi ve srovnání s původními údaji). Absence posttransfuzních reakcí u příjemců pupečníkové krve je výsledkem relativní tolerance jejích imunokompetentních buněk a také kritériem spolehlivosti biologické adekvátnosti kryokonzervovaného materiálu.

Progenitorové buňky zabíjející T-lymfocyty z pupečníkové krve jsou schopné aktivace pod vlivem exogenní cytokinové stimulace, což se používá k vývoji nových ex vivo a in vivo metod pro indukci protinádorové cytotoxicity lymfoidních elementů transplantátu pro následnou imunoterapii. Kromě toho „nezralost“ genomu imunokompetentních buněk z pupečníkové krve umožňuje jejich využití ke zvýšení protinádorové aktivity pomocí metod molekulárního modelování.

Pupečníková krev dnes nachází široké uplatnění především v dětské hematologii. U dětí s akutní leukémií alotransplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve ve srovnání s alotransplantací kostní dřeně významně snižuje výskyt reakce štěpu proti hostiteli. To je však doprovázeno delším obdobím neutro- a trombocytopenie a bohužel i vyšší 100denní úmrtností po transplantaci. Delší doba obnovy hladin granulocytů a krevních destiček v periferní krvi může být způsobena nedostatečnou diferenciací jednotlivých subpopulací CD34-pozitivních buněk pupečníkové krve, o čemž svědčí nízká úroveň absorpce radioaktivního rodaminu a nízká exprese antigenů CD38 na jejich povrchu.

Zároveň transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve dospělým pacientům, provedená z důvodu absence jak kompatibilního nepříbuzného dárce kostní dřeně, tak i možnosti mobilizace autologních HSC, prokázala vysoké jednoleté přežití bez relapsu ve skupině pacientů mladších 30 let (73 %). Rozšíření věkového rozmezí příjemců (18–46 let) vedlo ke snížení přežití na 53 %.

Kvantitativní analýza buněk s fenotypem CD34+ v kostní dřeni a pupečníkové krvi odhalila jejich vyšší (3,5násobný) obsah v kostní dřeni, ale v pupečníkové krvi byla zaznamenána významná převaha buněk s fenotypovým profilem CD34+HLA-DR. Je známo, že krevní buňky s imunologickými markery CD34+HLA-DR proliferují aktivněji než buňky s imunofenotypem CD34+HLA-DR+, což bylo potvrzeno v experimentálních studiích růstu dlouhodobé kultury hematopoetických buněk in vitro. Primitivní buněčné prekurzory s fenotypem CD34+CD38 jsou obsaženy jak v pupečníkové krvi, tak v kostní dřeni, ale buňky pupečníkové krve se sadou markerů CD34+CD38 mají vyšší klonogenní aktivitu než hematopoetické buňky stejného fenotypu izolované z kostní dřeně dospělých dárců. Kromě toho buňky pupečníkové krve s imunofenotypem CD34+CD38 proliferují rychleji v reakci na stimulaci cytokiny (IL-3, IL-6, G-CSF) a v dlouhodobých kulturách produkují 7krát více kolonií než buňky kostní dřeně.

Banky kmenových buněk z pupečníkové krve

Pro správný rozvoj nové oblasti praktické medicíny - transplantace kmenových buněk z pupečníkové krve, stejně jako pro realizaci transplantací hematopoetických kmenových buněk z kostní dřeně, je nezbytná rozsáhlá síť krevních bank, které již byly vytvořeny v USA a Evropě. Domácí sítě bank pupečníkové krve sdružuje Asociace Netcord Bank. Účelnost vytvoření mezinárodní asociace bank pupečníkové krve je dána skutečností, že k provedení nepříbuzných transplantací je zapotřebí velké množství typovaných vzorků pupečníkové krve, což umožňuje výběr HLA-identického dárce. Pouze vytvoření systému bank s ukládáním vzorků krve různých HLA typů může skutečně vyřešit problém nalezení potřebného dárce. Organizace takového systému bank pupečníkové krve vyžaduje předběžné vypracování etických a právních norem, které jsou v současné době diskutovány na mezinárodní úrovni.

Aby bylo možné na Ukrajině vytvořit banky pupečníkové krve, je nutné vypracovat celou řadu předpisů a dokumentů.

V první řadě se jedná o otázky standardizace metod odběru, frakcionace a mrazení pupečníkové krve. Je nutné regulovat pravidla odběru pupečníkové krve v porodnicích v souladu s požadavky lékařské etiky, stanovit minimální objem pupečníkové krve, který zajistí úspěšnou transplantaci. Je nutné porovnat a standardizovat různá kritéria pro hodnocení kvality a množství hematopoetických progenitorových buněk, stejně jako metody HLA typizace a diagnostické metody genetických a infekčních onemocnění, která mohou být přenášena během infuze buněk pupečníkové krve, a stanovit společná kritéria pro výběr zdravých dárců. Za zmínku stojí také otázka vytvoření oddělených skladovacích zařízení pro sérum, buňky a DNA získanou z pupečníkové krve.

Je naprosto nezbytné zorganizovat počítačovou síť dat o pupečníkové krvi, která by se propojila s registry dárců kostní dřeně. Pro další rozvoj buněčné transplantologie je nutné vyvinout speciální protokoly pro porovnávání výsledků transplantace pupečníkové krve a kostní dřeně od HLA-identických příbuzných a nepříbuzných dárců. Standardizace dokumentace, včetně informovaného souhlasu rodičů, jakož i informování matky nebo příbuzných o genetických a/nebo infekčních onemocněních zjištěných u dítěte, může pomoci vyřešit etické a právní problémy klinického využití buněk z pupečníkové krve.

Rozhodující podmínkou pro rozvoj buněčné transplantologie na Ukrajině bude přijetí Národního programu dárcovství kmenových buněk a rozvoj mezinárodní spolupráce s dalšími zeměmi prostřednictvím Světové asociace dárců dřeně (WMDA), Národního programu dárců dřeně USA (NMDP) a dalších registrů.

Shrneme-li dosud krátkou historii vývoje transplantace hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve, poznamenáváme, že první předpoklady o možnosti použití pupečníkové krve v klinických podmínkách, vyjádřené již na počátku 70. let, byly v 80. letech potvrzeny výsledky experimentálních studií na zvířatech a v roce 1988 byla provedena první transplantace hematopoetických buněk z pupečníkové krve člověku na světě, po níž se začala vytvářet globální síť bank pupečníkové krve. Za 10 let se počet pacientů s transplantovanými hematopoetickými buňkami z pupečníkové krve přiblížil 800. Mezi nimi byli pacienti s různými onemocněními nádorového (leukémie, lymfom, solidní nádory) i nenádorového (vrozené imunodeficience, anémie, onemocnění spojená s metabolickými poruchami) charakteru.

Obsah časných a commitovaných buněčných prekurzorů v pupečníkové krvi je vyšší než v periferní krvi dospělého. Co se týče počtu jednotek tvořících kolonie granulocytů a makrofágů a jejich proliferačního potenciálu, pupečníková krev i po zavedení růstových faktorů významně převyšuje periferní krev dospělých. V dlouhodobých buněčných kulturách in vitro byla zaznamenána větší proliferační aktivita a životaschopnost buněk pupečníkové krve než buněk kostní dřeně. Kritickými momenty při transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve jsou počet a hematopoetický potenciál jaderných buněk, přítomnost cytomegalovirové infekce, HLA kompatibilita dárce a příjemce, tělesná hmotnost a věk pacienta.

Transplantace kmenových buněk z pupečníkové krve by však měla být považována za alternativu transplantace kostní dřeně pro léčbu závažných onemocnění krve, zejména u dětí. Klinické problémy transplantace buněk z pupečníkové krve se postupně řeší – existují již poměrně účinné metody pro sběr, separaci a kryokonzervaci buněk z pupečníkové krve, zajišťují se podmínky pro vznik bank pupečníkové krve a zlepšují se metody testování jaderných buněk. 3% roztok želatiny a 6% roztok hydroxyethylškrobu by měly být považovány za optimální pro separaci při velkoobjemovém odběru hematopoetických kmenových buněk z pupečníkové krve při vytváření bank.

P. Perekhrestenko a spoluautoři (2001) správně poznamenávají, že transplantace kmenových buněk z pupečníkové krve by měla zaujmout své právoplatné místo v komplexu terapeutických opatření k překonání hematopoetických depresí různého původu, jelikož kmenové buňky z pupečníkové krve mají řadu významných výhod, mezi nimiž jsou nejdůležitější relativní jednoduchost jejich získávání, absence rizika pro dárce, nízká kontaminace neonatálních buněk viry a poměrně nízké náklady na transplantaci. Někteří autoři poukazují na to, že transplantace buněk z pupečníkové krve je méně často doprovázena komplikacemi spojenými s reakcí štěpu proti hostiteli než transplantace buněk kostní dřeně, což je podle jejich názoru způsobeno slabou expresí antigenů HLA-DR na buňkách pupečníkové krve a jejich nezralostí. Hlavní populací jaderných buněk v pupečníkové krvi jsou však T lymfocyty (CD3-pozitivní buňky), jejichž obsah je asi 50 %, což je o 20 % méně než v periferní krvi dospělého, ale fenotypové rozdíly v subpopulacích T buněk z těchto zdrojů jsou nevýznamné.

Mezi faktory přímo ovlivňující míru přežití při transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve stojí za zmínku věk pacientů (nejlepší výsledky jsou pozorovány u příjemců ve věku od jednoho do pěti let), včasná diagnóza onemocnění a forma leukémie (účinnost je výrazně vyšší u akutní leukémie). Velký význam má dávka jaderných buněk z pupečníkové krve, stejně jako jejich HLA kompatibilita s příjemcem. Není náhodou, že analýza klinické účinnosti transplantace HSC z pupečníkové krve v onkohematologii ukazuje nejlepší léčebné výsledky při použití příbuzných transplantací: jednoleté přežití bez relapsu v tomto případě dosahuje 63 %, zatímco u nepříbuzné transplantace - pouze 29 %.

Přítomnost velkého počtu kmenových buněk v pupečníkové krvi a vysoká repopulační kapacita neonatálních hematopoetických kmenových buněk tedy umožňuje jejich použití pro alogenní transplantaci u onkohematologických pacientů. Je však třeba poznamenat, že obnova hematopoézy po transplantaci hematopoetických buněk z pupečníkové krve je „natažená v čase“: obnovení obsahu neutrofilů v periferní krvi je obvykle pozorováno do konce 6. týdne a trombocytopenie obvykle mizí po 6 měsících. Kromě toho nezralost hematopoetických buněk z pupečníkové krve nevylučuje imunologické konflikty: těžká akutní a chronická reakce štěpu proti hostiteli je pozorována u 23 %, respektive 25 % příjemců. Recidivy akutní leukémie do konce prvního roku po transplantaci buněk z pupečníkové krve jsou zaznamenány u 26 % případů.

[ 10 ], [ 11 ]