Molekulárně genetické metody pro diagnostiku dědičných chorob

Metody DNA technologie se používají k určení lokalizace mutantního genu v konkrétním chromozomu, který je zodpovědný za vznik určitých forem dědičných patologií. Vzhledem k tomu, že gen je úsek DNA a genová mutace je poškození primární struktury DNA (mutací se rozumí všechny změny v sekvenci DNA bez ohledu na jejich lokalizaci a vliv na životaschopnost jedince), je možné sondováním preparátů metafázových chromozomů pacienta s dědičným onemocněním stanovit lokalizaci patologického genu. Molekulárně genetické metody vytvářejí možnosti pro diagnostiku onemocnění na úrovni pozměněné struktury DNA a umožňují nám určit lokalizaci dědičných poruch. Molekulárně genetické metody dokáží identifikovat mutace spojené s nahrazením i jedné báze.

Nejdůležitější fází identifikace genu je jeho izolace. DNA lze izolovat z jakéhokoli typu tkáně a buněk obsahujících jádra. Fáze izolace DNA zahrnují: rychlou lýzu buněk, odstranění fragmentů buněčných organel a membrán centrifugací, enzymatickou destrukci proteinů a jejich extrakci z roztoku za použití fenolu a chloroformu, koncentraci molekul DNA srážením v ethanolu.

V genetických laboratořích se DNA nejčastěji izoluje z krevních leukocytů, k čemuž se pacientovi odebere 5–20 ml žilní krve do sterilní zkumavky s roztokem antikoagulantu (heparin). Poté se leukocyty separují a zpracovávají podle výše uvedených kroků.

Další fází přípravy materiálu pro výzkum je „rozřezání“ DNA na fragmenty v oblastech s striktně specifickou sekvencí bází, které se provádí pomocí bakteriálních enzymů - restrikčních endonukleáz (restrikčních enzymů). Restrikční enzymy rozpoznávají specifické sekvence 4-6, méně často 8-12 nukleotidů v dvouvláknové molekule DNA a dělí ji na fragmenty v místech těchto sekvencí, nazývané restrikční místa. Počet výsledných restrikčních fragmentů DNA je určen četností výskytu restrikčních míst a velikost fragmentů je určena povahou rozložení těchto míst podél délky původní molekuly DNA. Čím častěji se restrikční místa nacházejí, tím kratší jsou fragmenty DNA po restrikci. V současné době je známo více než 500 různých typů restrikčních enzymů bakteriálního původu a každý z těchto enzymů rozpoznává svou vlastní specifickou nukleotidovou sekvenci. V budoucnu lze restrikční místa použít jako genetické markery DNA. Fragmenty DNA vzniklé v důsledku restrikce lze seřadit podle délky elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, a tak stanovit jejich molekulovou hmotnost. DNA v gelu se obvykle identifikuje specifickým barvením (obvykle ethidiumbromidem) a pozorováním gelu v procházejícím ultrafialovém světle. Místa lokalizace DNA jsou zbarvena červeně. U lidí však při zpracování DNA několika restrikčními enzymy vzniká tolik fragmentů různé délky, že je nelze oddělit elektroforézou, tj. není možné vizuálně identifikovat jednotlivé fragmenty DNA na elektroforéze (dosáhne se rovnoměrného barvení po celé délce gelu). Proto se k identifikaci požadovaných fragmentů DNA v takovém gelu používá hybridizační metoda se značenými DNA sondami.

Jakýkoli jednovláknový segment DNA nebo RNA je schopen vazby (hybridizace) s komplementárním řetězcem, přičemž guanin se vždy váže na cytosin a adenin na thymin. Takto vzniká dvouvláknová molekula. Pokud je jednovláknová kopie klonovaného genu označena radioaktivní značkou, získá se sonda. Sonda je schopna najít komplementární segment DNA, který je pak snadno identifikován pomocí autoradiografie. Radioaktivní sonda přidaná do preparátu natažených chromozomů umožňuje lokalizaci genu na specifickém chromozomu: pomocí DNA sondy lze během Southern blottingu identifikovat specifické oblasti. K hybridizaci dochází, pokud testovaný úsek DNA obsahuje normální gen. V případě, že je přítomna abnormální nukleotidová sekvence, tj. odpovídající struktury chromozomu obsahují mutantní gen, k hybridizaci nedojde, což umožňuje určit lokalizaci patologického genu.

Pro získání DNA sond se používá metoda klonování genů. Podstata metody spočívá v tom, že fragment DNA odpovídající genu nebo úseku genu se vloží do klonovací částice, obvykle bakteriálního plazmidu (prstencová extrachromozomální DNA přítomná v bakteriálních buňkách a nesoucí geny rezistence na antibiotika), a poté se rozmnoží bakterie s plazmidem s vloženým lidským genem. Díky syntetickým procesům v plazmidu lze získat miliardy kopií lidského genu nebo jeho úseku.

Výsledné kopie DNA, značené radioaktivní značkou nebo fluorochromy, se poté používají jako sondy k hledání komplementárních sekvencí mezi studovaným souborem molekul DNA.

V současné době existuje mnoho různých typů metod využívajících DNA sondy k diagnostice genových mutací.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]