Molekulární genetické metody pro diagnostiku dědičných onemocnění

Metody DNA technologie se používají k určení lokalizace v určitém chromozómu mutantního genu odpovědného za vznik některých forem dědičných patologií. Vzhledem k tomu, gen je segment DNA a mutace genu - poškození primární struktury DNA (mutace se rozumí všechny změny v sekvenci DNA, bez ohledu na jejich umístění a vlivu na jednotlivé životaschopnost), pak sondáž přípravky chromosomů v metafázi pacientů dědičné onemocnění, možné stanovit lokalizace patologického genu. Metody molekulární genetiky vytvářejí příležitosti pro diagnostiku nemocí na úrovni změněné struktury DNA, umožňují zjistit lokalizaci dědičných poruch. Molekulární genetické metody mohou odhalit mutace spojené s nahrazením i jedné báze.

Nejdůležitějším stupněm identifikace genu je jeho izolace. DNA může být izolována z jakéhokoliv typu jádra a buněk obsahujících jádra. Kroky izolaci DNA zahrnují rychlé lýze buněk odstřeďováním s odstraněním fragmenty buněčných organel a membrán, enzymatickou destrukci proteinů a jejich extrakce z roztoku s fenolem a chloroformem, koncentrace DNA vysrážením v ethanolu.

Genetické laboratoře DNA se často izoluje z krevních leukocytů, pro které je pacient odebraných 5-20 ml žilní krev do sterilní zkumavky s roztokem antikoagulantu (heparin). Leukocyty se pak oddělí a zpracují podle kroků uvedených výše.

V další fázi přípravy materiálu na studii - DNA „cut“ na fragmenty na místech s přísně specifickou sekvencí bází se provádí pomocí bakteriálních enzymů - restrikčních endonukleáz (restrikčních enzymů). Restrikční enzymy rozeznávají specifické sekvence 4-6, alespoň 8-12 nukleotidů do molekuly dvouřetězcové DNA a jeho rozdělit na fragmenty těchto sekvencí lokalizaci míst nazývají restrikční místa. Počet produkoval restrikční fragmenty DNA určena frekvencí výskytu restrikčních míst a fragmenty o velikosti - povaze rozložení těchto míst podél délky původní molekuly DNA. Čím častěji se nacházejí restrikční místa, tím kratší jsou fragmenty DNA po omezení. V současné době je známo více než 500 různých typů restrikčních enzymů bakteriálního původu a každý z těchto enzymů rozpoznává svou specifickou sekvenci nukleotidů. V budoucnu mohou být restrikční místa použity jako genetické markery DNA. Vzniklé restrikční fragmenty DNA lze třídit podle délky elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, a tak může být určena jejich molekulové hmotnosti. Obvykle se pro detekci DNA v gelu používaného specifického barvení (obvykle ethidiumbromidem) a zobrazení gelu v procházejícím světle ultrafialové. Lokalizace lokalizace DNA mají červenou barvu. Naproti tomu se při zpracování několika DNA restrikční endonukleázy vytvořeny tak mnoho fragmenty různé délky, které se nedaří být odděleny elektroforézou, že není možné vizuálně identifikovat jednotlivé fragmenty DNA se elektroforegramu (vyrobeného rovnoměrné zabarvení po celé délce gelu). Pro identifikaci požadovaných fragmentů DNA v takovém gelu se proto používá hybridizační metoda s označenými DNA sondami.

Každý segment jednořetězcové DNA nebo RNA je schopen vázat (hybridizaci) s komplementárním řetězcem, s guanin je vždy spojena s cytosin, adenin s thyminu. Toto je tvorba dvojvláknové molekuly. Pokud je jednovláknová kopie klonovaného genu značena radioaktivním štítkem, získá se sonda. Sonda je schopna najít komplementární segment DNA, který je pak snadno identifikován radioautografií. Radioaktivní sonda přidaná k léku roztažených chromozomů umožňuje, aby byl gen lokalizován na určitém chromozomu: určité DNA vzorky mohou být identifikovány pomocí sondy DNA v Southern blottingu. Hybridizace nastane, pokud testovací část DNA obsahuje normální gen. V případě, že existuje abnormální sekvence nukleotidů, tj. Odpovídající chromozomů struktury obsahují mutantní gen, nedojde hybridizace, který umožňuje určit lokalizaci abnormálního genu.

Pro získání DNA sondy se používá metoda klonování genů. Podstata metody spočívá v tom, že fragment DNA odpovídající každý gen nebo oblasti genu vloženého do klonovacího částice, obvykle bakteriální plasmid (kruhové extrachromozomální DNA přítomné v bakteriálních buňkách a nesoucí geny rezistence na antibiotika), a pak se bakterie které mají plazmid se zabudovaným lidským genem, se množí. Díky syntézním procesům v plazmidu je možné získat miliardy kopií lidského genu nebo jeho místa.

Dále jsou jako sondy použity kódy DNA značené radioaktivní značkou nebo fluorochromy pro hledání komplementárních sekvencí mezi skupinami studovaných molekul DNA.

V současnosti existuje mnoho druhů metod, které používají DNA sondy pro diagnostiku genových mutací.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],