Mezenchymální kmenové buňky

Mezi regionálními kmenovými buňkami zaujímají zvláštní místo mezenchymální kmenové buňky (MSC), jejichž deriváty tvoří stromální matrix všech orgánů a tkání lidského těla. Priorita ve výzkumu MSC patří zástupcům ruské biologické vědy.

V polovině minulého století byla v laboratoři A. Friedensteina poprvé izolována homogenní kultura multipotentních stromálních kmenových buněk kostní dřeně. Mezenchymální kmenové buňky připojené k substrátu si dlouhodobě udržovaly vysokou intenzitu proliferace a v kulturách s nízkou hustotou výsevu po fixaci na substrátu tvořily klony buněk podobných fibroblastům, které neměly fagocytární aktivitu. Ukončení proliferace MSC skončilo jejich spontánní diferenciací in vitro na buňky kostí, tuku, chrupavky, svalů nebo pojivové tkáně. Další studie umožnily stanovit osteogenní potenciál buněk podobných fibroblastům stromatu kostní dřeně různých druhů savců, stejně jako jejich aktivitu při tvorbě kolonií. Experimenty in vivo ukázaly, že hetero- i ortotopická transplantace buněk podobných fibroblastům tvořících kolonie vede k tvorbě kostí, chrupavek, fibromyalgie a tukové tkáně. Vzhledem k tomu, že se stromální kmenové buňky kostní dřeně vyznačují vysokou schopností sebeobnovy a mnohostrannou diferenciací v rámci jedné buněčné linie, nazývají se multipotentní mezenchymální progenitorové buňky.

Je třeba poznamenat, že za 45 let základního výzkumu mezenchymálních kmenových buněk byly vytvořeny reálné podmínky pro využití jejich derivátů v klinické praxi.

Dnes není pochyb o tom, že všechny tkáně lidského těla vznikají z kmenových buněk různých buněčných linií v důsledku procesů proliferace, migrace, diferenciace a zrání. Až donedávna se však věřilo, že kmenové buňky v dospělém organismu jsou tkáňově specifické, tj. schopné produkovat linie specializovaných buněk pouze těch tkání, ve kterých se nacházejí. Tento koncepční postoj byl vyvrácen fakty transformace hematopoetických kmenových buněk nejen do buněčných elementů periferní krve, ale také do oválných buněk jater. Kromě toho se ukázalo, že nervové kmenové buňky jsou schopny dát vzniknout jak neuronům, tak gliovým elementům, stejně jako časně komitovaným liniím hematopoetických progenitorových buněk. Mezenchymální kmenové buňky, které obvykle produkují buněčné elementy kostí, chrupavek a tukové tkáně, jsou zase schopny transformace do nervových kmenových buněk. Předpokládá se, že v procesu růstu, fyziologické a reparativní regenerace tkání se z tkáňově nespecifických kmenových rezerv generují nekomitované progenitorové buňky. Například reparace svalové tkáně může být realizována díky migraci mezenchymálních kmenových buněk z kostní dřeně do kosterních svalů.

Ačkoli taková křížová zaměnitelnost kmenových buněk není uznávána všemi výzkumníky, možnost klinického využití mezenchymálních kmenových buněk jako zdroje pro transplantaci buněk a buněčného vektoru genetické informace již nikým nezpochybňována, stejně jako multipotence stromálních kmenových buněk kostní dřeně, které lze relativně snadno izolovat a rozmnožovat v kultivaci in vitro. Zároveň se ve vědecké literatuře nadále objevují zprávy o potenciální pluripotenci stromálních kmenových buněk kostní dřeně. Jako důkaz jsou uváděny výzkumné protokoly, ve kterých se pod vlivem specifických induktorů transdiferenciace MSC transformují na nervové buňky, kardiomyocyty a hepatocyty. Někteří vědci však mají vážné pochybnosti o možnosti opakované aktivace a exprese genů od období rané embryogeneze. Zároveň všichni chápou, že pokud se najdou podmínky pro rozšíření multipotence mezenchymálních kmenových buněk na pluripotenci embryonálních kmenových buněk (ESC), automaticky se vyřeší mnoho etických, morálních, náboženských a právních problémů v regenerativní plastické medicíně. Navíc, jelikož se v tomto případě zdrojem regeneračního kmenového potenciálu stávají autologní stromální buňky pacienta, je tím vyřešen i problém imunitního odmítnutí buněčného transplantátu. Blízká budoucnost ukáže, jak realistické tyto vyhlídky jsou.

[ 1 ], [ 2 ]

Využití mezenchymálních kmenových buněk v medicíně

V klinické praxi je použití derivátů mezenchymálních kmenových buněk primárně spojeno s obnovou tkáňových defektů, které se vyskytují při rozsáhlých a hlubokých termických kožních lézích. V preklinické fázi bylo provedeno experimentální posouzení proveditelnosti použití alogenních mezenchymálních kmenových buněk podobných fibroblastům k léčbě hlubokých popálenin. Bylo prokázáno, že mezenchymální kmenové buňky podobné fibroblastům z kostní dřeně tvoří v kultuře monovrstvu, což umožňuje jejich transplantaci za účelem optimalizace regeneračních procesů hlubokých popáleninových ran. Autoři poznamenávají, že embryonální fibroblasty mají podobnou vlastnost, ale jejich klinické použití je omezeno stávajícími etickými a právními problémy. Hluboká termická popálenina s poškozením všech vrstev kůže byla modelována na krysách Wistar. Plocha popáleniny činila 18-20 % celkového povrchu kůže. První experimentální skupinu tvořili krysy s hlubokou termickou popáleninou a transplantací alogenních mezenchymálních kmenových buněk podobných fibroblastům. Druhou skupinu tvořila zvířata s hlubokou termickou popáleninou a transplantací alogenních embryonálních fibroblastů. Třetí skupinu reprezentovaly kontrolní krysy s hlubokou termickou popáleninou, které nepodstoupily buněčnou terapii. Suspenze fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastů byla aplikována na povrch popáleninové rány pomocí pipety v množství 2 x 10⁴ ^.buňky 2. den po modelaci popáleniny a odstranění vzniklého nekrotického strupu. Po transplantaci buněk byl povrch popáleniny zakryt gázovým ubrouskem navlhčeným izotonickým roztokem chloridu sodného s gentamicinem. Buňky kostní dřeně byly odebrány za účelem získání MSC s jejich následnou indukcí do linie fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk z dospělých potkanů Wistar z femuru. Embryonální fibroblasty byly získány z plic 14-17denních embryí. Embryonální fibroblasty a buňky kostní dřeně pro získání MSC byly předběžně kultivovány v Petriho miskách při teplotě 37 °C v CO2 inkubátoru, v atmosféře s 5 % CO2 a 95% vlhkostí. Embryonální fibroblasty byly kultivovány po dobu 4-6 dnů, přičemž tvorba monovrstvy MSC vyžadovala 14 až 17 dnů. Následně byly MSC kryokonzervovány jako výchozí materiál pro fibroblastům podobné mezenchymální kmenové buňky, které byly získány rozmrazením a kultivací MSC po dobu 4 dnů. Počet vytvořených fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk byl více než 3krát vyšší než počet embryonálních fibroblastů vytvořených během stejného kultivačního období. Pro identifikaci transplantovaných buněk v popáleninových ranách ve fázi kultivace byl jejich genom značen pomocí virového kyvadlového vektoru založeného na rekombinantním adenoviru typu V nesoucím gen 1ac-2 kódující ß-galaktosidázu E. coli. Živé buňky v různých časech po transplantaci byly imunohistochemicky detekovány v kryořezech s přídavkem substrátu X-Gal, který poskytuje charakteristické modrozelené barvení. V důsledku dynamického vizuálního, planimetrického a histologického hodnocení stavu popáleninové rány bylo zjištěno, že již 3. den po transplantaci buněk se ve vybraných skupinách objevují významné rozdíly v průběhu hojení rány. Tento rozdíl se stal obzvláště výrazným 7. den po transplantaci buněk. U zvířat první skupiny, kterým byly transplantovány fibroblastům podobné mezenchymální kmenové buňky, rána získala rovnoměrně intenzivní růžovou barvu, granulační tkáň se rozrostla po celé ploše až na úroveň epidermis a povrch popáleniny se výrazně zmenšil. Kolagenní film vytvořený na povrchu rány se poněkud ztenčil, ale nadále pokrýval celou plochu popáleniny. U zvířat druhé skupiny, kterým byly transplantovány embryonální fibroblasty, granulační tkáň vzrostla až na úroveň epidermis okrajů rány, ale pouze místy, zatímco plazmorea z rány byla intenzivnější než v 1. skupině a původně vytvořený kolagenní film prakticky zmizel. U zvířat, která nedostala buněčnou terapii, byla 7. den popáleninová rána bledá, s jamkami, s nekrotickou tkání pokrytou fibrinem. Plazmorea byla zaznamenána na celém povrchu popáleniny. Histologicky u zvířat 1. a 2. skupiny byl zaznamenán pokles buněčné infiltrace a rozvoj cévní sítě.a tyto známky počínajícího regeneračního procesu byly výraznější u krys 1. skupiny. V kontrolní skupině byly pozorovány známky buněčné infiltrace rány, histologický obraz nově vytvořených cév chyběl. 15. až 30. den pozorování byla plocha popáleninového povrchu u zvířat 1. skupiny výrazně menší než u krys ostatních skupin a granulační povrch byl více vyvinutý. U zvířat 2. skupiny se plocha popáleninového povrchu také zmenšila ve srovnání s velikostí popáleninových ran u krys kontrolní skupiny, což se stalo v důsledku marginální epitelizace. V kontrolní skupině zůstal popáleninový povrch místy bledý s řídkými granulacemi, objevily se na něm cévní hvězdičky, byly přítomny ostrůvky fibrinózního plaku, po celém povrchu popáleniny pokračovala mírná plazmorea a na některých místech zůstal obtížně oddělitelný strup. Celkově se u zvířat 3. skupiny také zmenšila velikost rány, ale okraje rány zůstaly podlomené.

Během srovnávací studie rychlosti hojení ran s použitím fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastů, stejně jako bez použití buněčné terapie, bylo tedy zaznamenáno zrychlení rychlosti hojení popáleninového povrchu v důsledku transplantace fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastů. V případě použití alogenních fibroblastům podobných mezenchymálních kmenových buněk však byla rychlost hojení ran vyšší než při transplantaci embryonálních fibroblastů. To se projevilo zrychlením změny fází regeneračního procesu - zkrátily se doby buněčné infiltrace, zvýšila se rychlost růstu cévní sítě a také se zvýšila tvorba granulační tkáně.

Výsledky dynamické planimetrie naznačují, že míra spontánního hojení popáleninové rány (bez použití buněčné terapie) byla nejnižší. 15. a 30. den po transplantaci alogenních mezenchymálních kmenových buněk podobných fibroblastům byla míra hojení ran vyšší než po transplantaci embryonálních fibroblastů. Histochemická metoda pro detekci beta-galaktosidázy ukázala, že po transplantaci mezenchymálních kmenových buněk podobných fibroblastům a embryonálních fibroblastů zůstávají transplantované buňky životaschopné na povrchu i v hloubce regenerujících se ran po celou dobu sledování. Autoři se domnívají, že vyšší míra regenerace popáleninové rány s použitím mezenchymálních kmenových buněk podobných fibroblastům je způsobena uvolňováním biologicky aktivních faktorů stimulujících růst těmito buňkami během procesu zrání.

V klinické praxi se k léčbě popáleninových ran používá také transplantace auto- nebo alogenních keratinocytů a alogenních fibroblastů. Je třeba poznamenat, že chirurgická léčba dětí s rozsáhlými hlubokými popáleninami je složitý úkol vzhledem k vysoké traumatické povaze a opakovaným chirurgickým zákrokům, významné krevní ztrátě a různým reakcím na použitá infuzní média. Hlavní obtíže při provádění plastických operací kůže u rozsáhlých hlubokých popálenin s plochou přesahující 40 % povrchu těla jsou způsobeny závažností stavu obětí a nedostatkem zdrojů dárcovské kůže. Použití síťovaných transplantátů s vysokým koeficientem perforace problém neřeší, protože buňky vytvořené po perforaci epitelizují velmi pomalu a samotné kožní laloky často lýzují nebo vysychají. Krytí popáleninových ran, jako je xenoskin, kadaverózní alografty, syntetické filmové krytí, není vždy dostatečně účinné, proto se vyvíjejí nové metody krytí povrchů popálenin vrstvami kultivovaných keratinocytů a fibroblastů. Zejména byla navržena metoda krytí popáleninových povrchů pomocí kultivovaných alofibroblastů, které po transplantaci mají výrazný stimulační účinek na proliferaci epidermocytů zachovaných v ráně u hraničních popálenin, stejně jako keratinocytů v septech síťovaných transplantátů. Práce L. Budkeviche a spoluautorů (2000) prezentuje výsledky použití této metody k léčbě popálenin u dětí. Studie zahrnovala 31 dětí s tepelným traumatem ve věku od 1 roku do 14 let. U tří dětí byla celková plocha popáleninových ran stupně IIIA-B - IV 40 %, u 25 50-70 %, u dalších tří 71-85 % povrchu těla. Časná chirurgická nekrektomie byla kombinována s transplantací kultivovaných alofibroblastů a autodermoplastikou. První fáze léčby zahrnovala excizi nekrotických tkání, druhá fáze transplantaci kultivovaných alofibroblastů na nosných filmech a třetí fáze (48 hodin po transplantaci kultivovaných alofibroblastů) zahrnovala odstranění matrix a autodermoplastiku kožními laloky s poměrem perforace 1:4. Tři pacienti přijatí na kliniku s těžkým popáleninovým onemocněním měli kultivované alofibroblasty transplantované na granulující rány. Transplantace kultivovaných alofibroblastů byla provedena jednou u 18 dětí, dvakrát u 11 dětí a třikrát u dvou pacientů. Plocha povrchu rány pokrytá buněčnou kulturou se pohybovala od 30 do 3500 cm2. Účinnost kultivovaných alofibroblastů byla hodnocena celkovým procentem uchycení kožního štěpu, dobou hojení popálenin a počtem úmrtí v důsledku těžkého tepelného traumatu. Uchycení štěpu bylo úplné u 86 % pacientů. Částečné neuchycení kožních štěpů bylo zaznamenáno u 14 % případů. Navzdory léčbě zemřelo šest (19,3 %) dětí. Celková plocha poškození kůže se u nich pohybovala od 40 do 70 % povrchu těla.Transplantace kultivovaných alofibroblastů nebyla u žádného pacienta spojena s úmrtností při popáleninovém poranění.

Autoři při analýze výsledků léčby poznamenávají, že dříve hluboké termické poškození kůže pokrývající 35-40 % povrchu těla bylo považováno za neslučitelné se životem (u mladších dětí - do 3 let - jsou kritické hluboké popáleniny pokrývající 30 % povrchu těla, u starších dětí - přes 40 % povrchu těla). Při provádění chirurgické nekrektomie s transplantací kultivovaných alofibroblastů a následnou autodermoplastikou kožními laloky s vysokým koeficientem perforace zůstávají popáleniny IIIB - IV stupně kritické, ale v současné době existují v mnoha případech vyhlídky na záchranu života i takových obětí. Chirurgická nekrektomie v kombinaci s transplantací kultivovaných alofibroblastů a autodermoplastikou u dětí s hlubokými popáleninami se ukázala jako zvláště účinná u pacientů s rozsáhlými kožními lézemi s nedostatkem dárcovských míst. Aktivní chirurgická taktika a transplantace kultivovaných alofibroblastů přispívají k rychlé stabilizaci celkového stavu těchto pacientů, snížení počtu infekčních komplikací popáleninové choroby, vytvoření příznivých podmínek pro uchycení transplantátů, zkrácení doby obnovy ztracené kůže a doby hospitalizace a snížení četnosti smrtelných následků u pacientů s rozsáhlými popáleninami. Transplantace kultivovaných alofibroblastů s následnou autodermoplastikou kožními laloky tak umožňuje zotavení u dětí s těžkými popáleninami, které byly dříve považovány za odsouzené k zániku.

Obecně se uznává, že primárním cílem léčby popálenin je co nejúplnější a nejrychlejší obnova poškozené kůže, aby se zabránilo toxickým účinkům, infekčním komplikacím a dehydrataci. Výsledky použití kultivovaných buněk do značné míry závisí na připravenosti samotné popáleninové rány k transplantaci. V případech transplantace kultivovaných keratinocytů na povrch rány po chirurgické nekrektomii se průměrně uchytí 55 % (podle plochy) transplantovaných buněk, zatímco u granulujících ran se míra uchycení snižuje na 15 %. Úspěšná léčba rozsáhlých hlubokých popálenin kůže proto vyžaduje v první řadě aktivní chirurgickou taktiku. V případě popáleninových ran IIIB-IV stupně je povrch popáleniny okamžitě zbaven nekrotické tkáně, aby se snížila intoxikace a snížil se počet komplikací popáleninové choroby. Použití takové taktiky je klíčem ke zkrácení doby od okamžiku popálení do uzavření ran a délky pobytu pacientů s rozsáhlými popáleninami v nemocnici a také významně snižuje počet úmrtí.

První zprávy o úspěšném použití kultivovaných keratinocytů k pokrytí popáleninových povrchů se objevily na počátku 80. let 20. století. Následně byla tato manipulace prováděna s použitím vrstev kultivovaných keratinocytů, nejčastěji získaných z autobuněk, mnohem méně často z alokeratinocytů. Technologie autokeratinocytoplastiky však neumožňuje vytvoření buněčné banky a doba potřebná k vytvoření transplantátu keratinocytů o dostatečné ploše je dlouhá a činí 3–4 týdny. Během tohoto období prudce roste riziko vzniku infekčních a dalších komplikací popáleninové choroby, což výrazně prodlužuje celkovou dobu pobytu pacientů v nemocnici. Autokeratinocyty se navíc při transplantaci na granulující popáleninové rány prakticky neuchytí a vysoká cena speciálních růstových médií a biologicky aktivních stimulátorů růstu keratinocytů výrazně omezuje jejich klinické využití. Další biotechnologické metody, jako je kolagenoplastika, transplantace kryokonzervované xenokůže a použití různých biopolymerních povlaků, zvyšují účinnost léčby rozsáhlých povrchových, nikoli však hlubokých popálenin. Způsob pokrytí povrchu rány kultivovanými fibroblasty se zásadně liší v tom, že jako hlavní složka kultivované buněčné vrstvy se používají fibroblasty, nikoli keratinocyty.

Předpokladem pro vývoj metody byla data, že pericyty obklopující malé cévy jsou progenitorové mezenchymální buňky schopné transformace na fibroblasty, které produkují mnoho růstových faktorů a zajišťují hojení ran díky silnému stimulačnímu účinku na proliferaci a adhezi keratinocytů. Použití kultivovaných fibroblastů k uzavření povrchů ran okamžitě odhalilo řadu významných výhod této metody ve srovnání s použitím kultivovaných keratinocytů. Zejména získání fibroblastů v kultuře nevyžaduje použití speciálních živných médií a stimulantů růstu, což snižuje náklady na transplantaci více než 10krát ve srovnání s náklady na získání keratinocytů. Fibroblasty se snadno pasivují, během čehož částečně ztrácejí povrchové antigeny histokompatibility, což otevírá možnost použití alogenních buněk pro výrobu transplantátů a vytváření jejich bank. Doba potřebná k získání transplantátů připravených k použití v klinice se zkracuje ze 3 týdnů (u keratinocytů) na 1-2 dny (u fibroblastů). Primární kulturu fibroblastů lze získat kultivací buněk z fragmentů kůže odebraných během autodermoplastiky a hustota výsevu buněk pro získání subkultur lidských fibroblastů je pouze 20 x 10³ ^na 1 ^cm².

Za účelem studia vlivu fibroblastů a jejich regulačních proteinů na proliferaci a diferenciaci keratinocytů byla provedena srovnávací analýza morfologie a proliferace keratinocytů na substrátech kolagenu typu I a III, stejně jako fibronektinu ve společné kultuře s lidskými fibroblasty. Lidské keratinocyty byly izolovány z fragmentů kůže pacientů s popáleninami, odebraných během autodermoplastiky. Hustota výsevu keratinocytů byla 50 x 10³ buněk na 1 cm². Klinická účinnost transplantace kultivovaných fibroblastů byla hodnocena u 517 pacientů. Všichni pacienti byli rozděleni do dvou skupin: Skupina 1 - dospělí s popáleninami IIA, B - IV stupně; Skupina 2 - děti s hlubokými popáleninami IIIB - IV stupně. Vyhodnocení dynamiky strukturní a funkční organizace monovrstvých kultur fibroblastů s ohledem na roli glykosaminoglykanů, fibronektinu a kolagenu v regeneračních procesech umožnilo autorům stanovit 3. den jako nejpříznivější období pro použití fibroblastových kultur k provedení transplantací. Studie vlivu fibroblastů na proliferaci a diferenciaci keratinocytů ukázala, že fibroblasty in vitro mají výrazný stimulační účinek, především na procesy adheze keratinocytů, čímž zvyšují počet připojených buněk a rychlost jejich fixace více než 2krát. Stimulace adhezních procesů je doprovázena zvýšením intenzity syntézy DNA a úrovně proliferace keratinocytů. Kromě toho se ukázalo, že přítomnost fibroblastů a jimi tvořené extracelulární matrix je nezbytnou podmínkou pro tvorbu tonofibrilárního aparátu keratinocytů, mezibuněčných spojení a v konečném důsledku pro diferenciaci keratinocytů a tvorbu bazální membrány. Při léčbě dětí s hlubokými popáleninami byla prokázána vysoká klinická účinnost transplantace kultury alofibroblastů, zejména ve skupině pacientů s rozsáhlými kožními lézemi v podmínkách deficitu dárcovského místa. Komplexní morfofunkční studie ukázala, že transplantované fibroblasty se vyznačují aktivní syntézou DNA, stejně jako kolagenu, fibronektinu a glykosaminoglykanů, které jsou součástí extracelulární matrix tvořené buňkami. Autoři poukazují na vysoké procento uchycení transplantovaných fibroblastů (až 96 %), prudké zkrácení doby jejich přijetí (do 24–48 hodin namísto 2–3 týdnů v případě použití keratinocytů), významné zrychlení epitelizace popáleninového povrchu a také významné snížení nákladů (až 10krát) na technologii pěstování transplantátu z fibroblastů ve srovnání s transplantací keratinocytů. Použití transplantace kultivovaných alofibroblastů umožňuje zachránit životy dětí s kritickými popáleninami – tepelným poškozením více než 50 % povrchu těla,což bylo dříve považováno za neslučitelné se životem. Je třeba poznamenat, že transplantací alogenních embryonálních fibroblastů se přesvědčivě prokázala nejen rychlejší regenerace ran a rekonvalescence pacientů s různým stupněm a oblastí popálenin, ale také významné snížení jejich úmrtnosti.

Autologní fibroblasty se používají i v tak složité oblasti plastické chirurgie, jako je rekonstrukční korekce poranění hlasivek. K tomuto účelu se obvykle používá bovinní kolagen, jehož doba účinku je omezena jeho imunogenitou. Jako cizí protein je bovinní kolagen citlivý na kolagenázu příjemce a může vyvolat imunitní reakce, pro snížení jejichž rizika byly vyvinuty technologie pro získání kolagenových preparátů zesítěných glutaraldehydem. Jejich výhodou je větší stabilita a nižší imunogenicita, která našla praktické uplatnění při odstraňování defektů a atrofie hlasivek. Injekce autologního kolagenu byly poprvé použity v roce 1995. Tato technika zajistila zachování primární struktury autologních kolagenních vláken, včetně intramolekulárních enzymaticky katalyzovaných zesíťovacích vazeb. Faktem je, že přirozená kolagenová vlákna jsou odolnější vůči destrukci proteázami než rekonstituovaný kolagen, ve kterém jsou telopeptidy štěpeny. Integrita telopeptidů je důležitá pro kvartérní strukturu kolagenních vláken a tvorbu zesíťovacích vazeb mezi sousedními molekulami kolagenu. Na rozdíl od preparátů z bovinního kolagenu autologní kolagen nezpůsobuje u příjemce imunitní reakce, ale není dostatečně účinný jako doplňující činidlo. Stabilní korekce lze dosáhnout lokální produkcí kolagenu transplantací autologních fibroblastů. Během studie účinnosti autologní transplantace fibroblastů v klinických podmínkách však byly identifikovány určité obtíže. V časném období po transplantaci fibroblastů byl klinický účinek slabší ve srovnání s účinkem po zavedení bovinního kolagenu. Při kultivaci autologních fibroblastů nelze vyloučit možnost transformace normálních fibroblastů na patologické, tzv. myofibroblasty, zodpovědné za rozvoj fibrózy a tvorbu jizev, o čemž svědčí kontrakce kolagenového gelu způsobená specifickou interakcí fibroblastů a kolagenních fibril. Kromě toho po sériovém pasážování in vitro fibroblasty ztrácejí schopnost syntetizovat proteiny extracelulární matrix.

Nyní však byla experimentálně vyvinuta metoda kultivace autologních lidských fibroblastů, která výše uvedené nedostatky eliminuje a nevede k onkogenní transformaci normálních fibroblastů. Autologní fibroblasty získané touto metodou se používají k obnově defektů v měkkých tkáních obličeje. Ve studii G. Kellera a kol. (2000) bylo ošetřeno 20 pacientů ve věku 37 až 61 let s vráskami a atrofickými jizvami. Kožní biopsie (4 mm) z retroaurikulární oblasti byly do laboratoře transportovány ve sterilních zkumavkách obsahujících 10 ml kultivačního média (Eagleho médium s antibiotikem, mykoseptikem, pyruvátem a fetálním telecím sérem). Materiál byl umístěn do 3–5 kultivačních misek o průměru 60 mm a inkubován v termostatu s atmosférou obsahující 5 % CO2. Po 1 týdnu byly buňky z misek trypsinizací odstraněny a umístěny do lahviček o objemu 25 cm2. Buňky byly pacientům injekčně aplikovány v množství 4 x 107. Významný a přetrvávající klinický efekt byl pozorován u pacientů během korekce nasolabiálních rýh, stejně jako u pacientů s jizvami 7 a 12 měsíců po třetí transplantaci autologních fibroblastů. Podle průtokové cytometrie produkovaly kultivované fibroblasty velké množství kolagenu typu I. Studie in vitro prokázaly normální kontraktilitu injikovaných fibroblastů. Dva měsíce po subkutánním podání kultivovaných fibroblastů v dávce 4 x 107 buněk nebyly u nahých myší detekovány žádné nádory. Injikované fibroblasty nezpůsobily u pacientů jizvení ani difúzní fibrózu. Podle autora jsou roubované autologní fibroblasty schopny neustále produkovat kolagen, což zajistí kosmetický omlazující efekt. Zároveň, vzhledem k omezené životnosti diferencovaných buněk, jsou fibroblasty odebrané od mladého pacienta účinnější než fibroblasty získané od starších lidí. V budoucnu se předpokládá, že bude možné kryokonzervovat kulturu fibroblastů odebraných od mladého dárce za účelem pozdější transplantace jeho vlastních mladých buněk staršímu pacientovi. Závěrem lze konstatovat, že autologní fibroblasty, za předpokladu jejich funkčního zachování, jsou ideálním prostředkem pro korekci defektů měkkých tkání obličeje. Zároveň sám autor poznamenává, že během studie se objevily některé problematické situace související s použitím autologního systému fibroblast-kolagen. Klinický efekt byl často slabší než při použití bovinního kolagenu, což u pacientů vyvolávalo zklamání.

Obecně vzato, literární údaje o perspektivách klinického využití mezenchymálních kmenových buněk vypadají poměrně optimisticky. Provádějí se pokusy o využití autologních multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk kostní dřeně k léčbě degenerativních lézí kloubů. Provádějí se první klinické studie využití kultivovaných mezenchymálních progenitorových buněk při léčbě komplexních zlomenin kostí. Auto- a alogenní mezenchymální stromální buňky kostní dřeně se používají k vytvoření chrupavčité tkáně pro transplantaci při korekci defektů kloubní chrupavky v důsledku traumatu nebo autoimunitních lézí. Vyvíjejí se metody klinického využití multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk k odstranění kostních defektů u dětí s těžkou formou neúplné osteogeneze způsobené mutacemi v genu pro kolagen typu I. Po myeloablaci se dětem-recipientům transplantuje kostní dřeň od zdravých dárců kompatibilních s HLA, protože nefrakcionovaná kostní dřeň může obsahovat dostatečný počet mezenchymálních kmenových buněk ke kompenzaci těžkého kostního defektu. Po transplantaci alogenní kostní dřeně vykazovaly tyto děti pozitivní histologické změny v trabekulárních kostech, zvýšení rychlosti růstu a snížení výskytu zlomenin kostí. V některých případech je pozitivního klinického výsledku dosaženo transplantací blízce příbuzné alogenní kostní dřeně a osteoblastů. Transplantace mezenchymálních kmenových buněk (MSC) se také používá k léčbě vrozené křehkosti kostí způsobené nerovnováhou osteoblastů a osteoklastů v kostní tkáni. V tomto případě je obnovení tvorby kostí dosaženo chimerizací zásoby kmenových a progenitorových stromálních buněk v kostní tkáni pacientů.

Pokračuje zdokonalování metod genetické modifikace dárcovských mezenchymálních kmenových buněk za účelem korekce genetických defektů stromálních tkání. Předpokládá se, že v nejbližší budoucnosti budou mezenchymální progenitorové buňky použity v neurologii pro cílenou chimerizaci mozkových buněk a vytvoření zdravého poolu buněk schopných generovat deficitní enzym nebo faktor zodpovědný za klinické projevy onemocnění. Transplantace mezenchymálních kmenových buněk může být použita k obnově stromatu kostní dřeně u pacientů s rakovinou po radio- a chemoterapii a v kombinaci s buňkami kostní dřeně k obnově hematopoézy. Vývoj substituční terapie zaměřené na odstranění defektů pohybového aparátu pomocí MSC je podporován inženýrským vývojem v oblasti návrhu matricových biomateriálů nebo biomimetik tvořících kostry osídlené potomky mezenchymálních kmenových buněk.

Zdroje mezenchymálních kmenových buněk

Hlavním zdrojem mezenchymálních kmenových buněk je kostní dřeň, jejíž hematopoetické kmenové buňky se v těle savců neustále diferencují na buňky krve a imunitního systému, zatímco mezenchymální kmenové buňky jsou reprezentovány malou populací buněk stromatu kostní dřeně podobných fibroblastům a přispívají k zachování nediferencovaného stavu hematopoetických kmenových buněk. Za určitých podmínek se mezenchymální kmenové buňky diferencují na buňky chrupavky a kostní tkáně. Po naočkování na kultivační médium za podmínek nízké hustoty výsadby tvoří mononukleární stromální buňky kostní dřeně kolonie adhezivních buněk, které jsou ve skutečnosti multipotentními mezenchymálními progenitorovými buňkami podobnými fibroblastům. Někteří autoři se domnívají, že v kostní dřeni se ukládají nevázané mezenchymální kmenové buňky, které díky své schopnosti sebeobnovy a vysokému diferenciačnímu potenciálu poskytují všem tkáním těla mezenchymální prekurzory stromálních elementů po celou dobu života savčího organismu.

V kostní dřeni tvoří stromální buněčné elementy síť vyplňující prostor mezi sinusoidami a kostní tkání. Obsah dormantních MSC v kostní dřeni dospělého je srovnatelný s množstvím hematopoetických kmenových buněk a nepřesahuje 0,01–0,001 %. Mezenchymální kmenové buňky izolované z kostní dřeně a nekultivované postrádají adhezní molekuly. Takové MSC neexprimují CD34, ICAM, VCAM, kolagen typu I a III, CD44 a CD29. V důsledku toho se in vitro na kultivačním substrátu nefixují mezenchymální kmenové buňky, ale pokročilejší progenitorové deriváty mezenchymálních kmenových buněk, které již vytvořily komponenty cytoskeletu a receptorový aparát molekul buněčné adheze. Stromální buňky s fenotypem CD34 se nacházejí i v periferní krvi, i když v kostní dřeni je jich výrazně méně než CD34-pozitivních mononukleárních buněk. Buňky CD34 izolované z krve a přenesené do kultury se na substrát přichytí a vytvoří kolonie buněk podobných fibroblastům.

Je známo, že v embryonálním období vzniká stromální základ všech orgánů a tkání savců a lidí ze společného souboru mezenchymálních kmenových buněk před a ve fázi organogeneze. Proto se předpokládá, že v dospělém organismu by se většina mezenchymálních kmenových buněk měla nacházet v pojivové a kostní tkáni. Bylo zjištěno, že hlavní část buněčných elementů stromatu řídké pojivové a kostní tkáně tvoří kommitované progenitorové buňky, které si však zachovávají schopnost proliferovat a tvořit klony in vitro. Po zavedení těchto buněk do krevního oběhu se více než 20 % mezenchymálních progenitorových buněk implantuje mezi stromální elementy hematopoetické tkáně a parenchymatózních orgánů.

Potenciálním zdrojem mezenchymálních kmenových buněk je tuková tkáň, mezi jejímiž kmenovými buňkami byly identifikovány prekurzory adipocytů v různé míře kommitované. Nejméně zralými progenitorovými elementy tukové tkáně jsou stromálně-vaskulární buňky, které jsou stejně jako multipotentní mezenchymální prekurzorové buňky kostní dřeně schopny diferencovat se na adipocyty pod vlivem glukokortikoidů, inzulínu podobného růstového faktoru a inzulínu. V kultuře se stromálně-vaskulární buňky diferencují na adipocyty a chondrocyty a v tukové tkáni kostní dřeně se nacházejí buňky, které tvoří adipocyty a osteoblasty.

Stromální kmenové buňky byly také nalezeny ve svalech. V primární kultuře buněk izolovaných z lidského kosterního svalu jsou detekovány hvězdicovité buňky a vícejaderné myotuby. V přítomnosti koňského séra hvězdicovité buňky proliferují in vitro bez známek cytodiferenciace a po přidání dexamethasonu do živného média je jejich diferenciace charakterizována výskytem buněčných elementů s fenotypem buněk kosterního a hladkého svalstva, kostí, chrupavek a tukové tkáně. V lidské svalové tkáni jsou proto přítomny jak vázané, tak vázané multipotentní mezenchymální progenitorové buňky. Bylo prokázáno, že populace progenitorových buněk přítomných v kosterním svalu pochází z vázaných multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk kostní dřeně a liší se od myogenních satelitních buněk.

V myokardu novorozených potkanů byly také nalezeny adhezivní stelátové buňky odpovídající multipotentním mezenchymálním progenitorovým buňkám v diferenciačním potenciálu, protože pod vlivem dexamethasonu se diferencují na adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, buňky hladkého svalstva, myotuby kosterního svalstva a kardiomyocyty. Bylo prokázáno, že buňky hladkého svalstva cév (pericyty) jsou deriváty nediferencovaných perivaskulárních multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk. V kultuře perivaskulární mezenchymální kmenové buňky exprimují α-aktin hladkého svalstva a receptor pro růstový faktor odvozený z krevních destiček a jsou schopny diferenciace alespoň na buňky hladkého svalstva.

Zvláštní místo z hlediska kmenových rezerv zaujímá chrupavčitá tkáň, jejíž extrémně nízký reparační potenciál je pravděpodobně způsoben nedostatkem multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk nebo diferenciačních a růstových faktorů. Předpokládá se, že multipotentní mezenchymální progenitorové buňky předem zapojené do chondro- a osteogeneze vstupují do chrupavčité tkáně z jiných tkáňových zdrojů.

Tkáňový původ a podmínky vázání mezenchymálních progenitorových buněk ve šlachách také nebyly stanoveny. Experimentální pozorování naznačují, že v časném postnatálním období si buňky Achillovy šlachy králíků v primárních kulturách a při prvním pasáži zachovávají expresi kolagenu typu I a dekorinu, ale při další kultivaci ztrácejí diferenciační markery tenocytů.

Je třeba poznamenat, že odpověď na otázku, zda jsou multipotentní mezenchymální progenitorové buňky lokalizované v různých tkáních skutečně neustále přítomny ve svém stromatu, nebo zda je tkáňový pool mezenchymálních kmenových buněk doplňován migrací stromálních kmenových buněk kostní dřeně, dosud nebyla přijata.

Kromě kostní dřeně a dalších mezenchymálních tkání dospělého organismu může být dalším zdrojem MSC pupečníková krev. Bylo prokázáno, že pupečníková žíla obsahuje buňky, které mají podobné morfologické a antigenní vlastnosti jako multipotentní mezenchymální progenitorové buňky, jsou schopné adheze a v diferenciačním potenciálu nejsou horší než multipotentní mezenchymální progenitorové buňky kostní dřeně. V kulturách mezenchymálních kmenových buněk pupečníkové krve bylo nalezeno 5 až 10 % nevázaných multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk. Ukázalo se, že jejich počet v pupečníkové krvi je nepřímo úměrný gestačnímu věku, což nepřímo naznačuje migraci multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk do různých tkání během fetálního vývoje. Objevily se první informace o klinickém využití mezenchymálních kmenových buněk izolovaných z pupečníkové krve, stejně jako buněk získaných z embryonálního biomateriálu, které je založeno na známé schopnosti fetálních kmenových buněk integrovat se, uchytit se a fungovat v orgánech a tkáňových systémech dospělých příjemců.

Hledání nových zdrojů mezenchymálních kmenových buněk

Využití mezenchymálních kmenových buněk embryonálního původu, stejně jako dalších fetálních buněk, vytváří řadu etických, právních, soudních a legislativních problémů. Proto hledání extraembryonálního dárcovského buněčného materiálu pokračuje. Pokus o klinické využití lidských kožních fibroblastů byl neúspěšný, což bylo předurčeno nejen vysokou finanční kapacitou technologie, ale také rychlou diferenciací fibroblastů na fibrocyty, které mají výrazně nižší proliferační potenciál a produkují omezené množství růstových faktorů. Další pokrok ve studiu biologie MSC a multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk kostní dřeně nám umožnil vyvinout strategii pro klinické využití autologních mezenchymálních kmenových buněk. Technologie jejich izolace, kultivace, ex vivo reprodukce a cílené diferenciace vyžadovala v první řadě studium spektra molekulárních markerů MSC. Jejich analýza ukázala, že primární kultury lidské kostní tkáně obsahují několik typů multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk. Proosteoblastový fenotyp byl detekován v buňkách exprimujících marker stromálních progenitorových buněk STRO-1, ale nenesoucích osteoblastový marker - alkalickou fosfatázu. Tyto buňky se vyznačují nízkou schopností tvořit mineralizovanou kostní matrici, stejně jako absencí exprese osteopontinu a receptoru parathormonu. Deriváty STRO-1-pozitivních buněk, které neexprimují alkalickou fosfatázu, jsou reprezentovány středně a kompletně diferencovanými osteoblasty. Bylo zjištěno, že buněčné elementy klonovaných linií STRO-1-pozitivních lidských trabekulárních kostních buněk jsou schopny diferenciace na zralé osteocyty a adipocyty. Směr diferenciace těchto buněk závisí na účinku polynenasycených mastných kyselin, prozánětlivých cytokinů - IL-1b a tumor nekrotizujícího faktoru a (TNF-a), jakož i protizánětlivého a imunosupresivního TGF-b.

Později bylo zjištěno, že multipotentní mezenchymální progenitorové buňky postrádají specifický fenotyp, který je jim vlastní, ale exprimují komplex markerů charakteristických pro mezenchymální, endoteliální, epiteliální a svalové buňky při absenci exprese imunofenotypových antigenů hematopoetických buněk - CD45, CD34 a CD14. Kromě toho mezenchymální kmenové buňky konstitutivně a indukovatelně produkují hematopoetické a nehematopoetické růstové faktory, interleukiny a chemokiny a na multipotentních mezenchymálních progenitorových buňkách jsou exprimovány receptory pro některé cytokiny a růstové faktory. Mezi buňkami stromální matrix lidského těla byly nalezeny dormantní neboli klidové buňky s imunofenotypem téměř identickým s antigenním profilem multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk neošetřených 5-fluorouracilem - obě buňky exprimují CD117, který označuje „dospělé“ kmenové buňky.

Buněčný marker jedinečný pro mezenchymální kmenové buňky tedy dosud nebyl identifikován. Předpokládá se, že klidové buňky představují populaci nevázaných multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk, protože neexprimují markery buněk vázaných na osteo- (Cbfa-1) nebo adipogenezi (PPAR-γ-2). Dlouhodobé vystavení pomalu proliferujících klidových buněk fetálnímu bovinnímu séru vede k tvorbě terminálně diferencujících se vázaných progenitorů charakterizovaných rychlým růstem. Klonální expanzi těchto mezenchymálních kmenových buněk podporuje FGF2. Zdá se, že genom stromálních kmenových buněk je poměrně pevně „uzavřený“. Existují zprávy o absenci spontánní diferenciace v MSC – bez zvláštních podmínek pro vázání se netransformují ani do buněk mezenchymální linie.

Pro studium populační struktury derivátů mezenchymálních kmenových buněk se provádí hledání diferenciačních markerových proteinů na stromálních buněčných liniích a v primárních kulturách. In vitro klonální analýza buněk tvořících kolonie kostní dřeně ukázala, že EGF zvyšuje průměrnou velikost kolonií a snižuje klonální expresi alkalické fosfatázy při aplikaci na primární kultury, zatímco přidání hydrokortizonu aktivuje expresi alkalické fosfatázy, která je markerem osteogenního směru diferenciace MSC. Monoklonální protilátky proti STRO-1 umožnily separovat a studovat populaci STRO-1-pozitivních adhezivních buněk v heterogenním systému Dexterových kultur. Bylo stanoveno spektrum cytokinů, které regulují nejen proliferaci a diferenciaci hematopoetických a lymfoidních buněk, ale také se podílejí na tvorbě, formování a resorpci kosterních tkání prostřednictvím para-, auto- a endokrinních mechanismů. Receptory zprostředkované uvolňování sekundárních poslů, jako je cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfát a Ca2+, se také používá pro analýzu markerů různých kategorií buněk stromální tkáně exprimujících odpovídající receptory. Použití monoklonálních protilátek jako markerů umožnilo stanovit příslušnost retikulárních buněk stromatu lymfoidních orgánů k T- a B-dependentním zónám.

Po určitou dobu pokračovaly vědecké debaty o možnosti původu MSC z hematopoetických kmenových buněk. Když jsou suspenze buněk kostní dřeně explantovány do monovrstvých kultur, skutečně v nich rostou jednotlivé kolonie fibroblastů. Ukázalo se však, že přítomnost prekurzorů kolonií fibroblastů a různých klíčků diferenciace hematopoetické tkáně v kostní dřeni není důkazem jejich společného původu z hematopoetických kmenových buněk. Pomocí diskriminační analýzy kmenových buněk kostní dřeně bylo zjištěno, že mikroprostředí během heterotopické transplantace kostní dřeně není hematopoetickými buňkami přenášeno, což dokazuje existenci populace MSC v kostní dřeni, která je histogeneticky nezávislá na hematopoetických buňkách.

Metoda selektivního klonování navíc umožnila identifikovat novou kategorii stromálních progenitorových buněk v monovrstvých kulturách buněk kostní dřeně, určit jejich počet a studovat jejich vlastnosti, proliferační a diferenciační potenciál. Ukázalo se, že buňky podobné stromálním fibroblastům proliferují in vitro a tvoří diploidní kolonie, které po transplantaci zpět do těla zajišťují tvorbu nových hematopoetických orgánů. Výsledky studie jednotlivých klonů naznačují, že mezi stromálními progenitorovými buňkami existuje populace buněk, které si svým proliferačním a diferenciačním potenciálem mohou nárokovat roli kmenových buněk stromální tkáně, histogeneticky nezávislých na hematopoetických kmenových buňkách. Buňky této populace se vyznačují samoudržitelným růstem a diferencují se na progenitorové buněčné elementy kosti, chrupavky a retikulární tkáně kostní dřeně.

Velmi zajímavé jsou výsledky studií R. Chailakhyana a spoluautorů (1997-2001), kteří kultivovali progenitorové buňky stromatu kostní dřeně králíků, morčat a myší na živném médiu a-MEM s přídavkem fetálního telecího séra. Autoři provedli explantaci s počáteční hustotou 2-4 x 103 buněk kostní dřeně na 1 cm2. Jako podpůrné médium byly použity homologní nebo heterologní radiačně inaktivované buňky kostní dřeně v dávce, která sice zachovala podpůrný účinek, ale zcela blokovala jejich proliferaci. Dvoutýdenní primární diskrétní kolonie fibroblastů byly trypsinizovány za účelem získání monoklonálních kmenů. Důkazy o klonálním původu kolonií byly získány pomocí chromozomálního markeru ve smíšených kulturách kostní dřeně samců a samic morčat, časosběrným fotografováním živých kultur a ve smíšených kulturách syngenní kostní dřeně myší CBA a CBAT6T6. Transplantace suspenze čerstvě izolovaných buněk kostní dřeně nebo in vitro pěstovaných stromálních fibroblastů pod ledvinovou pochvu byla provedena v porézních podložkách z ivalonu nebo želatiny, stejně jako v inaktivované matrici králičí houbovité kosti. Pro transplantaci klonů do kostní pochvy byly femury morčat zbaveny měkkých tkání a periostu, epifýzy byly oříznuty a kostní dřeň důkladně promyta. Kost byla nakrájena na fragmenty (3-5 mm), vysušena a ozářena dávkou 60 Gy. Jednotlivé kolonie fibroblastů byly umístěny do kostních pochev a implantovány intramuskulárně. Pro intraperitoneální transplantaci stromálních fibroblastů pěstovaných in vitro byly použity difuzní komory typu A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) a O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Při studiu růstové dynamiky klonálních kmenů R. Chailakhyan a kol. (2001) zjistili, že jednotlivé buňky tvořící kolonie fibroblastů, stejně jako jejich potomci, mají obrovský proliferační potenciál. Do 10. pasáže byl počet fibroblastů u některých kmenů 1,2–7,2 x 109 ^buněk. Během svého vývoje provedly až 31–34 zdvojení buněk. V tomto případě heterotopická transplantace kmenů odvozených z kostní dřeně, tvořených stromálními prekurzory několika desítek klonů, vedla k přenosu mikroprostředí kostní dřeně a vzniku nového hematopoetického orgánu v transplantační zóně. Autoři si položili otázku, zda jsou jednotlivé klony schopny přenést mikroprostředí kostní dřeně stromálních buněk, nebo zda je k tomu nutná spolupráce několika různých klonogenních stromálních prekurzorů? A pokud jsou jednotlivé klony schopny přenést mikroprostředí, bude to pro všechny tři hematopoetické klíčky úplné, nebo různé klony zajišťují tvorbu mikroprostředí pro různé hematopoetické klíčky? Pro řešení těchto problémů byla vyvinuta technologie kultivace stromálních progenitorových buněk na kolagenovém gelu, která umožňuje odstranit rostoucí kolonie fibroblastů z povrchu pro následnou heterotopickou transplantaci. Jednotlivé klony stromálních fibroblastů vypěstovaných z buněk kostní dřeně myší a morčat kmene CBA byly vyříznuty spolu s fragmentem gelového povlaku a heterotopicky transplantovány - pod ledvinové pouzdro syngenních myší nebo do břišního svalu autologních morčat. Po transplantaci do svalu byly kolonie na gelu umístěny do kostních pochev.

Autoři zjistili, že 50–90 dní po transplantaci kolonií fibroblastů kostní dřeně byl v transplantační zóně u 20 % případů pozorován vývoj kostní nebo kostní a hematopoetické tkáně. U 5 % recipientních zvířat obsahovala vytvořená ložiska kostní tkáně dutinu vyplněnou kostní dření. Uvnitř kostních válců měla tato ložiska zaoblený tvar a kapsli budovanou z kostní tkáně s osteocyty a dobře vyvinutou osteoblastickou vrstvou. Dutina kostní dřeně obsahovala retikulární tkáň s myeloidními a erytroidními buňkami, jejichž proporcionální poměr se nelišil od normální kostní dřeně. V ledvině byl transplantát typickým orgánem kostní dřeně vytvořeným při transplantaci nativní kostní dřeně, přičemž kostní kapsle kryla dutinu kostní dřeně pouze ze strany ledvinové kapsle. Hematopoetická tkáň zahrnovala myeloidní, erytroidní a megakaryocytární prvky. Stroma dutiny kostní dřeně mělo dobře vyvinutý sinusový systém a obsahovalo typické tukové buňky. Zároveň byla v transplantační zóně některých kolonií pod kapslí ledviny nalezena kostní tkáň bez známek hematopoézy. Studium proliferačního a diferenciačního potenciálu jednotlivých klonů pokračovalo na monoklonálních kmenech kostní dřeně králíků, jejichž buňky byly resuspendovány v živném médiu a v samostatné ivalonové houbičce o hmotnosti 1-2 mg byly transplantovány pod ledvinovou kapsuli dárce kostní dřeně králíka. Buňky 21 monoklonálních kmenů byly podrobeny takové autotransplantaci. Výsledky byly zohledněny po 2-3 měsících. Autoři zjistili, že ve 14 % případů transplantované monoklonální kmeny vytvořily orgán kostní dřeně sestávající z kostní tkáně a dutiny kostní dřeně vyplněné hematopoetickými buňkami. Ve 33 % případů transplantované kmeny vytvořily kompaktní kost různé velikosti s osteocyty zazděnými v dutinách a vyvinutou osteoblastickou vrstvou. V některých případech se v houbičkách s transplantovanými klony vyvinula retikulární tkáň bez kostních nebo hematopoetických elementů. Někdy se vytvořilo retikulární stroma s dobře vyvinutou sítí sinusoidů, ale nebylo osídleno hematopoetickými buňkami. Získané výsledky byly tedy podobné datům získaným během transplantace klonů na kolagenový gel. Pokud však transplantace klonů pěstovaných na substrátu vedla k tvorbě kostní dřeně v 5 % případů, kostní tkáně v 15 % a retikulární tkáně v 80 % případů, pak při transplantaci monoklonálních kmenů byla tvorba elementů kostní dřeně pozorována ve 14 % případů, kostní tkáně v 53 % a retikulární tkáně v 53 % případů. Podle autorů to naznačuje, že podmínky pro realizaci proliferačního a diferenciačního potenciálu stromálních fibroblastů během transplantace na porézní nosiče byly optimálnější než během jejich transplantace do kostních pochev a na kolagenový substrát.Je možné, že použití pokročilejších metod kultivace a reverzní transplantace klonů může zlepšit podmínky pro realizaci jejich diferenciačního potenciálu klony a změnit tyto poměry. Tak či onak, ale hlavní význam provedených studií spočívá v tom, že některé klony stromálních buněk jsou schopny tvořit kostní tkáň a současně poskytovat stromální hematopoetické mikroprostředí pro tři klíčky hematopoézy kostní dřeně najednou: erytroidní, myeloidní a megakaryocytární, čímž vytvářejí poměrně velké platformy hematopoetické tkáně a určité kostní hmoty.

Autoři se poté zabývali otázkou schopnosti jednotlivých klonogenních stromálních progenitorových buněk podstoupit tyto typy buněčné diferenciace v uzavřeném systému difuzních komor. Dále bylo nutné určit, zda jednotlivé klony disponují polypotencií, nebo zda projev diferenciačního potenciálu vyžaduje kooperativní interakci několika klonů s fixním cytodiferenciačním znakem, jehož různé poměry určují preferenční tvorbu kostní, retikulární nebo chrupavčité tkáně. Kombinací dvou metodologických přístupů - získáním monoklonálních kmenů stromálních progenitorových buněk kostní dřeně a jejich transplantací do difuzních komor - dosáhli R. Chailakhyan a spoluautoři (2001) výsledků, které jim umožnily přiblížit se k pochopení strukturní organizace stromatu kostní dřeně. Transplantace monoklonálních kmenů stromálních progenitorových buněk do komor typu O vedla k tvorbě kostní i chrupavčité tkáně, což naznačuje schopnost potomků jediné stromální kolonie tvořící buňky současně tvořit kostní a chrupavčitou tkáň. Předpoklad, že kostní a chrupavčitá tkáň pocházejí ze společné stromální progenitorové buňky, byl opakovaně předkládán. Tato hypotéza však neměla žádné správné experimentální potvrzení. Tvorba kosti a chrupavky v difuzních komorách byla nezbytným důkazem existence společné progenitorové buňky pro tyto dva typy tkání mezi stromálními kmenovými buňkami kostní dřeně.

Poté bylo 29 klonálních kmenů z druhé až třetí pasáže získaných z primárních kultur králičí kostní dřeně umístěno do difuzních komor a intraperitoneálně implantováno do homologních zvířat. Studie ukázaly, že 45 % monoklonálních kmenů kostní dřeně má osteogenní potenciál. Devět komor obsahovalo výhradně retikulární tkáň, ale ta byla přítomna spolu s kostní a chrupavčitou tkání ve 13 dalších komorách, což představovalo 76 % všech kmenů. V komorách typu O, kde byla možná diferenciace kostní i chrupavčité tkáně, bylo studováno 16 kmenů. Ve čtyřech komorách (25 %) se tvořila kostní i chrupavčitá tkáň. Je třeba znovu poznamenat, že ve studiích R. Chailakhyana a kol. (2001) prodělaly jednotlivé progenitorové buňky v rámci buněčného kmene 31 až 34 zdvojení a jejich potomstvo tvořilo 0,9–2,0 x 109 ^buněk. Počet mitóz, kterým progenitorové buňky polyklonálních kmenů prošly, byl prakticky identický s počtem mitóz monoklonálních kmenů. Rychlost vývoje polyklonálních kmenů, zejména v první fázi jejich vzniku, do značné míry závisela na počtu kolonií použitých k jejich iniciaci. Diploidní kmeny lidských embryonálních fibroblastů (WI-38) při reklonování na úrovni 12-15 zdvojení také tvořily kolonie, které se lišily průměrem a obsahem buněk. Velké kolonie obsahující více než 103 buněk tvořily pouze 5-10 %. S rostoucím počtem dělení se procento velkých kolonií snižovalo. Mono- a polyklonální kmeny stromálních fibroblastů kostní dřeně si po 20 a více zdvojeních zachovaly diploidní sadu chromozomů a tendence jejich vývoje byla srovnatelná s dynamikou vývoje diploidních kmenů embryonálních fibroblastů. Analýza diferenciačního potenciálu jednotlivých progenitorových buněk stromatu kostní dřeně, provedená transplantací monoklonálních kmenů do difuzních komor, ukázala, že polovina z nich byla osteogenní. Velké kolonie tvořily 10 % z jejich celkového počtu. V důsledku toho počet osteogenních buněk tvořících kolonie odpovídal přibližně 5 % jejich celkové populace. Celková hmotnost osteogenních progenitorových buněk identifikovaných autory zahrnovala buňky schopné současně tvořit kostní a chrupavčitou tkáň. Navíc bylo poprvé zjištěno, že tyto dva typy tkání v dospělém organismu mají společnou progenitorovou buňku: 25 % testovaných klonů bylo vytvořeno těmito buňkami a jejich počet v celkové populaci progenitorových buněk byl nejméně 2,5 %.

Heterotopická transplantace jednotlivých klonů fibroblastů kostní dřeně tak odhalila nové aspekty strukturní organizace populace mezenchymálních progenitorových buněk. Byly nalezeny stromální progenitorové buňky, které jsou schopny přenášet specifické mikroprostředí pro všechny hematopoetické klíčky najednou, jejichž počet mezi velkými klony studovanými v různých modelech se pohybuje od 5 do 15 % (0,5–1,5 % z celkového počtu detekovaných progenitorových buněk). Spolu s klony, které přenášejí kompletní mikroprostředí kostní dřeně, existují progenitorové buňky určené pouze k osteogenezi, které při přenosu v otevřeném systému tvoří kostní tkáň, která nepodporuje rozvoj hematopoézy. Jejich počet z celkového počtu progenitorových buněk je 1,5–3 %. Některé z těchto buněk jsou schopny tvořit kostní tkáň s omezenou dobou samoudržování. V důsledku toho je populace stromálních progenitorových buněk heterogenní ve svém diferenciačním potenciálu. Mezi nimi existuje kategorie buněk, které se prohlašují za stromální kmenové buňky, schopné diferenciace ve všech třech směrech charakteristických pro stromální tkáň kostní dřeně, tvořící kost, chrupavku a retikulární tkáň. Prezentovaná data nám umožňují doufat, že s využitím různých buněčných markerů bude možné určit příspěvek každého typu stromálních buněk k organizaci specifického mikroprostředí a podpoře hematopoézy v Dexterových kulturách.

Vlastnosti mezenchymálních kmenových buněk

V posledních letech bylo zjištěno, že ve stacionárních kulturách kostní dřeně jsou multipotentní mezenchymální progenitorové buňky reprezentovány omezenou populací malých agranulárních buněk (buňky RS-1), které se vyznačují nízkou schopností tvorby kolonií a absencí exprese antigenu Ki-67 specifického pro proliferující buňky. Antigenní parametry dormantních buněk RS-1 se liší od spektra antigenů rychle proliferujících commitovaných stromálních progenitorových buněk. Bylo zjištěno, že vysoká míra proliferace commitovaných progenitorových buněk je pozorována pouze v přítomnosti buněk RS-1. Buňky RS-1 zase zvyšují svou rychlost růstu pod vlivem faktorů vylučovaných nejzralejšími deriváty multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk. Zdá se, že buňky RS-1 jsou podtřídou nekommitovaných MSC schopných recyklace. In vitro se 5-fluorouracil-rezistentní stromální progenitorové buňky kostní dřeně vyznačují nízkým obsahem RNA a vysokou expresí genu ornithin dekarboxylázy, markeru neproliferujících buněk.

Intenzivní proliferace stromálních progenitorových buněk začíná po jejich fixaci na substrátu. V tomto případě je exprimován markerový profil špatně diferencovaných buněk: SH2 (receptor TGF-(3)), SH3 (doména signálního proteinu), kolagen typu I a III, fibronektin, adhezní receptory VCAM-1 (CD106) a ICAM (CD54), kadherin-11, CD44, CD71 (transferinový receptor), CD90, CD120a a CD124, ale bez exprese charakteristických markerů hematopoetických kmenových buněk (CD34, CD14, CD45). Klonální růst umožňuje opakované pasážování mezenchymálních kmenových buněk s tvorbou četných geneticky homogenních stromálních progenitorových pluripotentních buněk v kultuře. Po 2-3 pasážích jejich počet dosahuje 50-300 milionů. V kultuře s dostatečnou hustotou se stromální progenitorové buňky, po zastavení proliferace, na rozdíl od fibroblastů hematopoetické tkáně diferencují na adipocyty, myocyty, chrupavčité a kostní buňky. Kombinace tří regulačních diferenciačních signálů, včetně 1-methylisobutylxanthinu (induktor intracelulární tvorby cAMP), dexamethasonu (inhibitor fosfolipáz A a C) a indomethacinu (inhibitor cyklooxygenázy, který zároveň snižuje aktivitu tromboxansyntázy), přeměňuje až 95 % progenitorových mezenchymálních buněk na adipocyty. Vznik adipocytů z nezralých stromálních elementů je potvrzen expresí genu lipoproteinové lipázy, histochemickou detekcí apolipoproteinů a peroxizomálních receptorů. Buňky stejného klonu pod vlivem TGF-b v bezsérovém médiu vytvářejí homogenní populaci chondrocytů. Vícevrstvá buněčná kultura této chrupavčité tkáně se vyznačuje vyvinutou mezibuněčnou matricí sestávající z proteoglykanu a kolagenu typu II. V živném médiu s 10 %. Účinek komplexu diferenciačního signálu sestávajícího z b-glycerofosfátu (anorganický donor fosfátu), kyseliny askorbové a dexamethasonu ve stejné kultuře stromálních progenitorových buněk vede k tvorbě buněčných agregátů. V takových buňkách je pozorován progresivní nárůst aktivity alkalické fosfatázy a hladin osteopontinu, což naznačuje tvorbu kostní tkáně, jejíž mineralizace buněk je potvrzena progresivním nárůstem intracelulárního obsahu vápníku.

Podle některých údajů je schopnost mezenchymálních kmenových buněk k neomezenému dělení a reprodukci různých typů buněk mezenchymální diferenciační linie kombinována s vysokým stupněm plasticity. Po zavedení do mozkových komor nebo bílé hmoty migrují mezenchymální kmenové buňky do parenchymu nervové tkáně a diferencují se na deriváty gliové nebo neuronální buněčné linie. Kromě toho existují informace o transdiferenciaci MSC na hematopoetické kmenové buňky in vitro i in vivo. Hloubkovější analýza v některých studiích zjistila mimořádně vysokou plasticitu MSC, která se projevuje v jejich schopnosti diferencovat se na astrocyty, oligodendrocyty, neurony, kardiomyocyty, buňky hladkého svalstva a buňky kosterního svalstva. Řada studií o transdiferenciačním potenciálu MSC in vitro a in vivo prokázala, že multipotentní mezenchymální progenitorové buňky kostní dřeně se terminálně diferencují na buněčné linie, které tvoří kostní, chrupavčitou, svalovou, nervovou a tukovou tkáň, stejně jako šlachy a stroma, které podporují hematopoézu.

Jiné studie však neodhalily žádné známky omezení pluripotence genomu mezenchymálních kmenových buněk a progenitorových populací stromálních buněk, ačkoli bylo studováno více než 200 klonů MSC izolovaných z jedné primární kultury za účelem testování možné pluripotence stromálních buněk. Drtivá většina klonů in vitro si zachovala schopnost diferenciace v osteogenním, chondrogenním a adipogenním směru. Při vyloučení pravděpodobnosti migrace recipientních buněk transplantací mezenchymálních kmenových buněk pod ledvinovou kapsli nebo do difuzních komor se ukázalo, že stromální progenitorové buňky in situ si zachovávají heterogenní fenotyp, což naznačuje buď absenci restrikčních faktorů v transplantační zóně, nebo absenci pluripotence MSC jako takové. Zároveň se připouští existence vzácného typu somatických pluripotentních kmenových buněk, které jsou společnými prekurzory všech dospělých kmenových buněk.

Multi-, ale nikoli pluripotence pravých mezenchymálních kmenových buněk, které tvoří velmi malý podíl buněk kostní dřeně a jsou schopny proliferovat za určitých podmínek během kultivace in vitro bez diferenciace, se projevuje jejich indukovanou vazbou na buňky kostí, chrupavek, tukové a svalové tkáně, stejně jako na tenocyty a stromální elementy, které podporují hematopoézu. Dlouhodobá expozice kultivačnímu médiu s fetálním telecím sérem zpravidla vyvolává uvolňování MSC do vázaných stromálních progenitorových buněk, jejichž potomstvo podléhá spontánní terminální diferenciaci. In vitro je možné dosáhnout cílené tvorby osteoblastů přidáním dexamethasonu, ß-glycerofosfátu a kyseliny askorbové do kondicionačního média, zatímco kombinace dexamethasonu a signálů inzulínové diferenciace indukuje tvorbu adipocytů.

Bylo zjištěno, že před vstupem do fáze terminální diferenciace se MSC kostní dřeně za určitých kultivačních podmínek nejprve diferencují na fibroblastům podobné mezenchymální kmenové buňky. Deriváty těchto buněk se in vivo podílejí na tvorbě kostí, chrupavek, šlach, tukové a svalové tkáně, jakož i stromatu, které podporuje hematopoézu. Mnoho autorů chápe termín „multipotentní mezenchymální progenitorové buňky“ jak samotné MSC, tak i komitované stromální progenitorové buňky kostní dřeně a mezenchymálních tkání. Klonální analýza multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk kostní dřeně ukázala, že o něco více než třetina všech klonů se diferencuje na osteo-, chondro- a adipocyty, zatímco buňky zbývajících klonů mají pouze osteogenní potenciál a tvoří pouze chondro- a osteocyty. Klon multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk, jako je BMC-9, se za vhodných podmínek mikroprostředí diferencuje na buňky s fenotypem a funkčními charakteristikami nejen osteoblastů, chondrocytů a adipocytů, ale také stromálních buněk, které podporují hematopoézu. Klon buněk RCJ3.1 izolovaných z kostní dřeně plodu potkanů se diferencuje na mezenchymální buňky různých fenotypů. Při kombinovaném působení kyseliny askorbové, b-glycerofosfátu a dexamethasonu tvoří buněčné elementy tohoto klonu nejprve multinukleární myocyty a poté postupně adipocyty, chondrocyty a ostrůvky mineralizované kostní tkáně. Populace granulárních buněk z periostu plodů potkanů odpovídá nevázaným multipotentním mezenchymálním progenitorovým buňkám, protože se vyznačuje nízkou rychlostí proliferace, neexprimuje diferenciační markery a za kultivačních podmínek se diferencuje za vzniku chondro-, osteo- a adipocytů, stejně jako buněk hladkého svalstva.

Je tedy třeba si uvědomit, že otázka pluri- nebo multipotence genomu mezenchymálních kmenových buněk zůstává otevřená, což ovlivňuje i představy o diferenciačním potenciálu stromálních progenitorových buněk, který také nebyl definitivně stanoven.

Experimentálně prokázanou a důležitou charakteristikou mezenchymálních kmenových buněk je jejich schopnost opustit tkáňovou niku a cirkulovat v celkovém krevním řečišti. Pro aktivaci programu genetické diferenciace musí takové cirkulující kmenové buňky vstoupit do vhodného mikroprostředí. Bylo prokázáno, že při systematickém zavádění MSC do krevního oběhu recipientních zvířat jsou nezralé buňky implantovány do různých orgánů a tkání, kde se následně diferencují na krevní buňky, myocyty, adipocyty, chondrocyty a fibroblasty. V důsledku toho v lokálních tkáňových zónách dochází k signálně-regulačním interakcím mezi nevázanými a vázanými stromálními progenitorovými buňkami, jakož i mezi nimi a okolními zralými buňkami. Předpokládá se, že diferenciaci indukují parakrinní regulační faktory mezenchymálního i nemezenchymálního původu (růstové faktory, eikosanoidy, molekuly extracelulární matrix), které zajišťují prostorové a časové spojení v mikroprostředí multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk. Lokální poškození mezenchymální tkáně by proto mělo vést k tvorbě zón mikroprostředí multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk, které se kvalitativně liší od komplexu regulačních signálů intaktních tkání, ve kterých probíhají spíše fyziologické než reparativní regenerační procesy. Tento rozdíl je mimořádně důležitý z hlediska specializace buněčného fenotypu v normálním a poškozením indukovaném mikroprostředí.

Podle těchto konceptů jsou právě zde zakotveny mechanismy zásadního rozdílu mezi dvěma známými procesy - fyziologickou regenerací a zánětlivou proliferací. První z nich končí obnovou specializovaného buněčného složení tkáně a její funkce, zatímco výsledkem realizace proliferačního procesu je tvorba zralých elementů pojivové tkáně a ztráta funkce poškozené tkáňové zóny. Pro vývoj optimálních programů pro využití multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk v regenerativně-plastické medicíně je tedy nezbytné důkladné studium zvláštností vlivu faktorů mikroprostředí na diferenciaci MSC.

Závislost struktury kompartmentu kmenových buněk na buněčných para- a autokrinních regulátorech, jejichž exprese je modulována vnějšími signály, je nepochybná. Mezi funkce regulačních faktorů patří nejdůležitější kontrola asymetrického dělení MSC a exprese genů určujících stádia závazku a počet buněčných dělení. Vnější signály, na kterých závisí další vývoj MSC, poskytuje jejich mikroprostředí. V nezralém stavu MSC proliferují po dlouhou dobu a zároveň si zachovávají schopnost diferencovat se na linie adipocytů, myofibroblastů, hematogenní tkáňové stroma, chrupavčité a kostní buňky. Bylo zjištěno, že omezená populace CD34-negativních stromálních buněčných elementů cirkulujících v krvi se vrací z celkového krevního oběhu do stromatu kostní dřeně, kde se transformuje na linie CD34-pozitivních hematopoetických kmenových buněk. Tato pozorování naznačují, že recirkulace progenitorových mezenchymálních buněk v krevním řečišti udržuje tkáňovou rovnováhu stromálních kmenových buněk v různých orgánech mobilizací společného poolu nezralých stromálních elementů kostní dřeně. Diferenciace MSC do buněk s více mezenchymálními fenotypy a jejich účast na regeneraci nebo opravě kostí, chrupavek, tukové tkáně a šlach in vivo byla prokázána pomocí adoptivních transferových modelů u experimentálních zvířat. Podle jiných autorů je vzdálená migrace MSC podél cévního řečiště kombinována s krátkodobým nebo lokálním pohybem multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk v tkáni během opravy chrupavky, regenerace svalů a dalších regeneračních procesů.

Lokální kmenové rezervy stromální tkáňové báze slouží jako zdroj buněk v procesech fyziologické regenerace tkání a jsou doplňovány vzdáleným transportem MSC, protože jsou zdroje stromální tkáňové kmenové tkáně spotřebovávány. Avšak v podmínkách potřeby nouzové mobilizace reparativního buněčného potenciálu, například při polytraumatu, se na procesech reparativní regenerace podílí celá řada MSC a mezenchymální progenitorové buňky kostní dřeně jsou rekrutovány na periferii prostřednictvím celkového krevního oběhu.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk

Mezi procesy fyziologické regenerace tkání a jejich tvorbou během nitroděložního vývoje lze vysledovat určité paralely. V embryogenezi u lidí a savců dochází k tvorbě různých typů specializovaných buněk z ekto-, mezo- a endodermálního poolu zárodečných vrstev, ale za povinné účasti mezenchymu. Řídká buněčná síť embryonální mezenchymální tkáně plní četné regulační, metabolické, strukturní a morfogenetické funkce. K kladení provizorních orgánů dochází až po kondenzaci mezenchymu v důsledku klonogenního růstu progenitorových buněk, které generují primární morfogenetické signály organogeneze. Stromální deriváty embryonálního mezenchymu vytvářejí buněčnou kostru provizorních orgánů a tvoří základ pro jejich budoucí energeticko-plastické zásobení v důsledku růstu primárních krevních a lymfatických cév. Jinými slovy, stromální prvky mikrocirkulační jednotky fetálních orgánů vznikají před vznikem jejich strukturních a funkčních jednotek. Aktivní migrace mezenchymálních buněk během organogeneze navíc zajišťuje prostorovou orientaci vyvíjejících se orgánů tím, že vyznačuje jejich objemové hranice omezením homeotických Hox-typů. Stromální kostra také slouží jako základ pro sestavení strukturálních a funkčních jednotek parenchymatózních orgánů, které často zahrnují morfogeneticky a funkčně zcela odlišné buňky. V důsledku toho jsou funkce mezenchymu během embryogeneze primární a realizují se prostřednictvím generování regulačních signálů, které aktivují regionální proliferaci a diferenciaci progenitorových epiteliálních buněk. Embryonální mezenchymální buňky produkují růstové faktory, jako je HGF-β, HGF-β, CSF, pro které mají parenchymální progenitorové buňky odpovídající receptory. V diferencované zralých tkáních dospělého organismu generuje stromální síť buněk také signály pro udržení životaschopnosti a proliferace progenitorových buněk nemezenchymálního původu. Spektrum stromálních regulačních signálů v postnatální ontogenezi je však odlišné (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF atd.) a je zaměřeno na zajištění fyziologické regenerace nebo opravy poškozených tkáňových zón. Spektrální charakteristiky stromálních regulačních faktorů se navíc v každém typu tkáně a dokonce i v rámci jednoho orgánu liší. Zejména hematopoéza a lymfopoéza s proliferací a diferenciací hematopoetických a imunokompetentních buněk probíhají pouze v určitých orgánech, v jejichž hranicích funguje stromální mikroprostředí, které zajišťuje podmínky pro zrání hematopoetických a lymfoidních buněk. Schopnost hematopoetických a lymfoidních buněk znovu osídlit daný orgán, proliferovat a zrát v jeho mikrostrukturálních nikách závisí na regulačních faktorech mikroprostředí.

Mezi složkami extracelulární matrix, které produkují multipotentní mezenchymální progenitorové buňky, je třeba zmínit fibronektin, laminin, kolagen a proteoglykany, stejně jako CD44 (receptor pro hyaluronan a osteopontin), které hrají hlavní roli v organizaci mezibuněčných interakcí a tvorbě extracelulární matrix v kostní dřeni a kostní tkáni. Bylo prokázáno, že multipotentní mezenchymální progenitorové buňky kostní dřeně vytvářejí stromální mikroprostředí, které poskytuje indukční a regulační signály nejen MSC, ale také hematopoetickým progenitorům a dalším nemezenchymálním kmenovým buňkám kostní dřeně. Je známo, že účast MSC v hematopoéze je určena jejich schopností diferencovat se na stromální buňky, které podporují hematopoézu, a tento instruktivní signál je MSC přijímán přímo z hematopoetických kmenových buněk. Proto v kultuře síť stromálních progenitorových buněk slouží jako podpůrná základna pro vývoj všech klonů hematopoetických buněk.

V dospělém organismu je intenzita hemo- a lymfopoézy ve stavu dynamické rovnováhy s „výdaji“ zralých krevních buněk a buněk imunitního systému na periferii. Vzhledem k tomu, že stromální buňky kostní dřeně a lymfoidních orgánů se obnovují extrémně zřídka, nedochází v nich k významné restrukturalizaci stromálních struktur. Systém může být vyveden z dynamické rovnováhy mechanickým poškozením kteréhokoli z orgánů hemo- nebo lymfoidní pojivové činnosti, což vede k rovnoměrným sekvenčním změnám, které se týkají nejen a ne tolik hematopoetických nebo lymfoidních prvků, jako spíše stromálních struktur poškozeného orgánu. V procesu reparativní regenerace se nejprve vytvoří stromální báze, která je poté znovu osídlena hematopoetickými nebo imunokompetentními buňkami. Tato dlouhodobě známá skutečnost činí z posttraumatické regenerace vhodný model pro studium stromálního mikroprostředí hematopoetických orgánů. Zejména mechanické vyprazdňování dřeňové dutiny tubulárních kostí se používá ke studiu reparativní regenerace kostní dřeně - kyretáže, která umožňuje rychlé a efektivní vyvedení hematopoetické tkáně ze stavu dynamické rovnováhy. Při studiu procesů reparativní regenerace hematopoetických a stromálních složek kostní dřeně po mechanickém vyprázdnění dřeňové dutiny tibie morčat bylo zjištěno, že neexistuje přímá korelace mezi indexy regenerace hematopoetických a stromálních buněk (počet hematopoetických buněk, koncentrace a počet stromálních progenitorových buněk). Kromě toho se ukázalo, že ke zvýšení populace stromálních progenitorových buněk dochází dříve po kyretáži a samotné stromální fibroblasty se stávají fosfatázově pozitivními, což je typické pro osteogenní tkáň. Bylo také zjištěno, že kyretáž 3-5 tubulárních kostí vede k růstu této buněčné populace v kostní dřeni neoperovaných kostí a dokonce i ve slezině, která je u morčat výhradně lymfopoetickým orgánem.

Morfologický obraz reparačních procesů v kostní dřeni kyretovaných tibií morčat obecně odpovídá údajům popsaným v literatuře získaným v experimentech na zvířatech jiných druhů a dynamika změn, ke kterým dochází po odstranění hematopoetické tkáně, je pro všechny druhy zvířat stejná a rozdíl se týká pouze časových parametrů. Morfologicky se fázové pořadí obnovy hematopoézy ve vyprázdněné dřeňové dutině skládá z postupných procesů organizace krevní sraženiny, tvorby hrubé vláknité kostní tkáně, její resorpce, vývoje sinusoidů a tvorby retikulárního stromatu, který je následně znovu osídlen hematopoetickými elementy. V tomto případě se počet progenitorových hematopoetických buněk v procesu regenerace tkáně kostní dřeně zvyšuje souběžně se zvyšujícím se obsahem hematopoetických kmenových buněk.

Yu. Gerasimov a spoluautoři (2001) porovnávali změny v počtu hematopoetických buněk a počtu stromálních progenitorových buněk v jednotlivých fázích regeneračního procesu. Ukázalo se, že kvantitativní změny v buňkách kostní dřeně v kyretované kosti odpovídají dynamice morfologických charakteristik regenerace. Autoři spojují pokles buněčného obsahu v regenerátu během prvních tří dnů se smrtí hematopoetických buněk v důsledku nepříznivého vlivu mikroprostředí vytvořeného proliferující retikulární tkání v zachované kostní dřeni v oblasti epifýzy, jakož i s tvorbou ložisek osteoidní tkáně v ní a poškozením cév během kyretáže. 7.–12. den se zvýšení hladiny jaderných buněk shoduje s výskytem jednotlivých ložisek myeloidní hematopoézy v zónách proliferace stromálních elementů. 20. den se objevují významné oblasti regenerované kostní dřeně a dobře vyvinuté sinusy, což je doprovázeno významným zvýšením celkového počtu buněk. Počet hematopoetických elementů však během tohoto období představuje 68 % kontrolní úrovně. To je v souladu s dříve publikovanými údaji, že počet hematopoetických buněk po kyretáži dosahuje normy až 35.–40. den po operaci.

V časném posttraumatickém období jsou hlavním zdrojem pro obnovu hematopoézy lokální buněčné elementy zachované během kyretáže. V pozdějších stádiích jsou hlavním zdrojem regenerace hematopoetické tkáně kostní dřeně kmenové buňky repopulující volné stromální zóny. Pokud jde o jednotlivé kategorie stromálních buněk (endoteliální, retikulární a osteogenní), zdroje, které zajišťují jejich tvorbu během reorganizace dutiny kostní dřeně, zůstávají nejasné. Výsledky studie Yu. V. Gerasimova a spoluautorů (2001) naznačují, že v kostní dřeni zachované po kyretáži je koncentrace buněk tvořících kolonie fibroblastů výrazně vyšší než v normální kostní dřeni. Autoři se domnívají, že kyretáž vede k intenzivnějšímu selektivnímu vymývání hematopoetických buněk ve srovnání se stromálními buňkami tvořícími kolonie, které se podílejí na tvorbě stromatu a jsou silněji asociovány s jeho hlavní substancí než hematopoetické buňky.

Dynamika změny počtu buněk tvořících fibroblastové kolonie koreluje s intenzitou procesů osteogeneze, následnou resorpci kostních trabekul a tvorbou retikulárního stromatu, který je osídlen hematopoetickými buňkami. Většina stromálních progenitorových buněk v určených termínech regenerace tvoří hrubou vláknitou kostní tkáň a retikulární stroma. V případě zlomenin stehenní kosti za podmínek prodloužené osteosyntézy se 5. den v regenerační zóně zvyšuje koncentrace a počet buněk tvořících fibroblastové kolonie a během období intenzivní tvorby kosti se jejich počet zvyšuje 6krát. Je známo, že buňky kostní dřeně tvořící fibroblastové kolonie mají osteogenní vlastnosti. Počet stromálních progenitorových buněk se zvyšuje před osídlením kyretovaného území kostní dřeně hematopoetickými buňkami. To je v dobré shodě s údaji, že stromální buňky zajišťují tvorbu hematopoetického mikroprostředí. Zdá se, že vytvoření hematopoetického mikroprostředí odpovídá určité úrovni regenerace stromální tkáně a počet hematopoetických buněk se zvyšuje s expanzí stromální platformy vhodné pro hematopoézu.

Nejzajímavější jsou údaje autorů, které ukazují, že bezprostředně po kyretáži se zvyšuje počet stromálních progenitorových buněk v odlehlých částech kostry. Od šesté hodiny až do dvacátého dne včetně je v kontralaterální tibii pozorován více než dvojnásobný nárůst jak koncentrace, tak počtu buněk tvořících fibroblastové kolonie. Mechanismus tohoto jevu pravděpodobně souvisí s tím, že masivní poškození kostní dřeně vede k tvorbě velkého množství krevních sraženin se současnou destrukcí významného počtu krevních destiček a uvolněním destičkového růstového faktoru (PDGF) do krve, o kterém je známo, že způsobuje proliferaci buněk tvořících fibroblastové kolonie umístěných v těle mimo proliferativní pool. V experimentech na králících podporuje lokální podávání MSC obnovu chrupavčité tkáně chirurgicky poškozeného kolenního kloubu, což může souviset s tvorbou chondrocytů pocházejících z injikovaných MSC. Reparativní regenerace kostních defektů u laboratorních potkanů je však významně zvýšena použitím mezenchymálních kmenových buněk uzavřených v keramické konstrukci. Lze tedy předpokládat, že pokud nejde o RBOC, pak nějaký jiný faktor pocházející z poškozených stromálních buněk, který má vzdálený stimulační účinek na proliferaci mezenchymálních progenitorových buněk v intaktních zónách kostní dřeně a stimuluje jejich migraci do oblasti defektu kostní dřeně. Tomu naopak odporují literární údaje z předchozích let, které naznačují, že stromální buňky zodpovědné za mikroprostředí, na rozdíl od hematopoetických buněk, nejsou schopny migrace a pocházejí z lokálních zdrojů.

Výsledky studie Yu. Gerasimova a spoluautorů (2001) nicméně naznačují, že mechanické trauma způsobuje nejen prudkou restrukturalizaci stromální tkáně v kyretované kosti, ale také významné změny ve stromatu ve vzdálených intaktních kostech, tj. dochází k systémové reakci stromální tkáně na lokální trauma. Navíc při polytraumatu - mnohočetné kyretáži - je tato reakce zesílena a je pozorována nejen v operované kosti a vzdálených částech kostry, ale také v lymfoidních orgánech, zejména ve slezině. Mechanismus takové systémové reakce stromální tkáně kostní dřeně a sleziny na lokální trauma a polytrauma zůstává neznámý. Předpokládá se, že tento proces je spojen s působením humorálního faktoru vylučovaného mezenchymálním stromatem dřeňové dutiny kostní dřeně. Možnost produkce orgánově nespecifického humorálního faktoru zodpovědného za proliferaci buněk tvořících kolonie fibroblastů stromálními buňkami kostní dřeně a sleziny je doložena údaji o jejich aktivitě stimulující kolonie v monovrstvých kulturách kostní dřeně.

V tomto ohledu stojí za zmínku, že při systémovém podávání multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk dochází k repopulaci jejich derivátů nejen kostní dřeně, ale i dalších tkání, což se využívá zejména pro genovou terapii. Bylo prokázáno, že při intravenózním podávání velkého množství MSC s genomem divokého typu myším s mutací v genu kolagenu I nahrazují dárcovské buňky až 30 % buněk v kostní a chrupavčité tkáni příjemců a transfekované myší mezenchymální kmenové buňky vylučující lidský IL-3 účinně podporují hematopoézu po dobu 9 měsíců v případě jejich současného podávání s lidskými hematopoetickými kmenovými buňkami imunodeficitním myším.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetická modifikace mezenchymálních kmenových buněk

Mezi úspěchy experimentální genetické modifikace MSC stojí za zmínku transfekce genu faktoru IX do lidských MSC s následným přenosem transfektovaných buněk imunodeficitním myším, což vede k výskytu antihemofilního faktoru B v krvi po dobu 8 týdnů po transplantaci. V tomto experimentu byla v transfekovaných buňkách provedena posttranslační modifikace faktoru IX pomocí γ-glutamylkarboxylázy. Transdukce MSC retrovirovým vektorem kódujícím lidský faktor IX byla méně úspěšná - následné podání těchto buněk psovi s hemofilií B poskytlo terapeutickou hladinu faktoru IX, udržující normální intenzitu koagulační hemostázy, po dobu pouhých 12 dnů.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk do mozkového parenchymu zvířat ukázala, že nezralé buňky dárce se transformují do neuronálních i gliových populací. Engraftment neuronálních derivátů zdravé mezenchymální tkáně dárce teoreticky umožňuje korigovat genetické abnormality mozkového metabolismu u pacientů s Gaucherovou chorobou a dalšími poruchami metabolismu lipidů, gangliosidů nebo sacharidů.

Experimentální hledání podmínek pro transdiferenciaci stromálních kmenových buněk kostní dřeně na progenitorové buňky nervové a jaterní tkáně stále probíhá. Pozornost výzkumníků se zaměřuje na kombinace induktorů diferenciace a speciálních kondicionovaných médií. Zejména pro izolaci primární kultury stromálních buněk se buňky kostní dřeně promyté a resuspendované v kultivačním médiu DMEM/F12 (1/1) s 10% fetálním telecím sérem vysejí v hustotě 200 000/cm2. Po 24 hodinách se nepřilnulé buňky odstraní a buňky podobné fibroblastům připojené k plastu se kultivují po dobu jednoho týdne. Pro diferenciaci buněk stromatu kostní dřeně na neuroblasty se používá kondicionované médium získané třídenní kultivací primární kultury myších embryonálních fibroblastů, dále médium DMEM/F12 (1/1) s 2 % fetálního telecího séra a přidáním 20 ng/ml NF nebo 10-6 M kyseliny retinové (neuroinduktory, které se používají pro neurální diferenciaci myších a lidských embryonálních kmenových buněk). Diferenciace buněk stromatu kostní dřeně na prekurzorové buňky hepatocytů se indukuje v kondicionovaném médiu vytvořeném v důsledku třídenní kultivace primární kultury myších embryonálních jaterních buněk v médiu DMEM/F12 (1/1) s přidáním 10 % fetálního telecího séra.

Zde je třeba ještě jednou poznamenat, že kolonie tvořící buňky stromatu kostní dřeně jsou heteromorfní a lze je rozdělit na dva typy. První typ zahrnuje buňky podobné fibroblastům, které tvoří filopodie s velkými jádry a jedním nebo dvěma jadérky. Druhý typ je reprezentován malými vřetenovitýma buňkami. Při kultivaci buněk obou typů v podmíněném médiu získaném na podpůrné vrstvě primárních myších embryonálních fibroblastů se v kultuře 3. až 4. den objevují buňky podobné neuroblastům. V této fázi mají nejčastěji vřetenovitý tvar s jedním nebo dvěma dlouhými výběžky zakončenými filopodiemi. Méně časté jsou pyramidální nebo hvězdicovité buňky s krátkými dendrity. Dendrity některých neuroblastů mají v distální části charakteristické rozšíření (růstové pupeny) a větvení, zatímco jiné mají zřetelné růstové kužely s filopodiemi, kterými dendrity prorůstají. Podobné morfologické znaky (pupeny a růstové kužely s filopodiemi) vlastní neuroblastům diferencujícím se v neurony byly podrobně popsány ve studiích neurogeneze. Na základě toho někteří autoři usoudili, že buňky, které v kultuře našli, jsou neuroblasty. Zejména E. Ščegelská a spoluautoři (2002) po kultivaci primární kultury stromálních buněk po dobu dvou týdnů v podmíněném médiu, které se měnilo každé 3. až 4. den, zjistili, že některé buňky proliferovaly a zároveň si zachovaly nediferencovaný stav. Navenek se tyto buňky podobaly fibroblastům a byly v kultuře detekovány spolu s diferencujícími se neuroblasty. Většina buněk (asi 80 %) byla v různých stádiích diferenciace do buněk nervové tkáně, primárně do neuronů. Dendritické výběžky těchto buněk byly ve vzájemném těsném kontaktu, takže buňky postupně vytvářely na substrátu úseky nervové sítě ve formě dlouhých mnohobuněčných vláken. Dendritické výběžky neuroblastů se výrazně prodlužovaly, některé z nich 8–10krát překročily délku samotného těla neuronu. Postupně se zvyšoval podíl pyramidálních a hvězdicových buněk. Dendrity hvězdicových buněk se větvily. Podle autorů pozdější diferenciace pyramidálních a hvězdicových buněk ve srovnání s vřetenovitým tvarem odpovídá posloupnosti fází normální neurogeneze u zvířat. Autoři proto dospěli k závěru, že stromální kmenové buňky kostní dřeně procházejí indukovanou neurogenezí, během níž se z neuroblastů in vitro tvoří všechny tři hlavní typy neuronů. Prekurzory nervových buněk byly také detekovány během kultivace stromálních buněk kostní dřeně po dobu 3–4 dnů v médiu s 2 % fetálním sérem a 20 ng/ml LIF. V tomto případě se však kmenové buňky dělily velmi pomalu, k diferenciaci neuroblastů došlo pouze ve 30 % případů a netvořily neuronální sítě. Použitím kyseliny retinové jako jednoho z induktorů diferenciace nervových buněk autoři získali v kultuře až 25–30 % nervových buněk.s převážně gliovými elementy - astrocyty a oligodendrocyty. Neurony tvořily pouze třetinu všech nervových buněk, ačkoli byly zastoupeny všemi třemi typy: vřetenovité, pyramidální a hvězdicovité buňky. 6. den kultivace stromálních buněk v médiu s kyselinou retinovou se nervové buňky více diferencovaly a v jednotlivých pyramidálních neuronech byly nalezeny axony, které se za normální neuroontogeneze objevují později než vznik dendritických výběžků. Podle autorů má metoda indukce kyselinou retinovou i přes nízký výtěžek nervových buněk své výhody: oligodendrocyty a astrocyty plní myelinační a nutriční funkce během růstu dendritů a axonů a jsou nezbytné pro normální tvorbu nervové tkáně. Proto je pro opravu jejích poškozených oblastí in vivo lepší použít suspenzi neuronů obohacenou gliovými buňkami.

Ve druhé sérii experimentů se autoři pokusili indukovat diferenciaci buněk stromatu kostní dřeně do jaterních buněk. Po třech dnech kultivace kmenových buněk stromatu kostní dřeně v kondicionovaném médiu získaném inkubací myších embryonálních hepatocytů byly nalezeny velké, sférické buňky, často dvojjaderné, s cytoplazmatickými inkluzemi různých velikostí. Tyto buňky byly v různých stádiích diferenciace a lišily se velikostí, počtem jader a inkluzemi v cytoplazmě. Ve většině těchto buněk byl detekován glykogen, na základě čehož je autoři identifikovali jako prekurzorové buňky hepatocytů. Vzhledem k tomu, že v kultuře nebyly nalezeny žádné buňky podobné neuroblastům, byl učiněn závěr, že kondicionované médium získané v důsledku kultivace embryonálních hepatocytů postrádalo diferenciační faktory nervových buněk a naopak obsahovalo faktory indukující diferenciaci buněk stromatu kostní dřeně do prekurzorových buněk hepatocytů. Závěrem autoři naznačují přítomnost pluripotence ve buňkách stromatu kostní dřeně, protože se in vitro diferencují na buňky nervové nebo jaterní tkáně v závislosti na specifickém kondicionovaném médiu a použitých induktorech.

Některé studie skutečně správně prokázaly diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně na kardiomyocyty, chrupavku, kostní a nervovou tkáň. Existují důkazy, že mezi buňkami kostní dřeně existují populace kmenových buněk schopných diferenciace na hepatocyty. Vzhledem k těmto údajům lze výsledky výše uvedených experimentů na myších stále považovat za další potvrzení přítomnosti pluripotentních mezenchymálních kmenových buněk v kostní dřeni schopných diferenciace na buňky různých tkání dospělého organismu.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk

V klinické transplantologii lze lidské mezenchymální kmenové buňky využít k zajištění expanze hematopoetických kmenových buněk, stejně jako jejich časně prekomitovaných potomků. Zejména zavedení autologních hematopoetických kmenových buněk a MSC pacientům s rakovinou po vysokodávkové chemoterapii urychluje obnovu počtu neutrofilů a krevních destiček v periferní krvi. Alo- a autologní transplantace mezenchymálních kmenových buněk se používají k léčbě mnohočetného myelomu, aplastické anémie a spontánní trombocytopenie - onemocnění spojených s primárním defektem ve stromatu hematopoetické tkáně. Účinnost buněčné terapie v onkohematologické patologii je v mnoha případech vyšší při současném zavedení stromálních a hematopoetických kmenových buněk, což se projevuje zkrácením pooperační doby obnovy hematopoézy, snížením počtu fatálních konců v důsledku neselektivní destrukce regionálních a cirkulujících rakovinných buněk, při kterých hynou i vlastní progenitorové hematopoetické buňky pacienta. Perspektivy využití MSC a dalších multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk v klinické praxi jsou dány relativně snadnou možností jejich získání z aspirátů kostní dřeně, expanzí v kultuře a transfekcí terapeutických genů. Zároveň lze lokální implantaci multipotentních mezenchymálních progenitorových buněk využít ke kompenzaci lokálních tkáňových defektů a v případě systémových dysfunkcí tkání mezenchymálního původu není vyloučeno jejich zavedení do krevního oběhu.

Autoři prací, ve kterých analyzují perspektivy využití MSC pro lokální, systémovou transplantaci a genovou terapii z hlediska biologie stromálních buněk, jsou ve svém uvažování opatrnější. Postnatální kostní dřeň je tradičně považována za orgán sestávající ze dvou hlavních systémů jasně definovaných buněčných linií - samotné hematopoetické tkáně a s ní spojeného podpůrného stromatu. Proto byly mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně zpočátku považovány výhradně za zdroj stromálního základu pro produkci regulačních faktorů hematopoetického mikroprostředí. Poté se pozornost výzkumníků přesunula ke studiu role MSC jako kmenového zdroje kosterních tkání. Nejnovější data naznačují neočekávaný potenciál pro diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně s tvorbou nervové nebo svalové tkáně. Jinými slovy, mezenchymální kmenové buňky vykazují transgermální plasticitu - schopnost diferencovat se na buněčné typy fenotypově nesouvisející s buňkami původní tkáně. Zároveň některé aspekty biologie stromálních buněk kostní dřeně zůstávají nejasné a nevyřešené jak z obecně biologického hlediska, tak v jednotlivých detailech, včetně identifikace, povahy, původu, vývoje a funkce stromálních buněk kostní dřeně in vivo, jakož i přípustného diferenciačního potenciálu ex vivo a možností terapeutického využití in vivo. Získaná data o potenciálu MSC, stejně jako výsledky studií regeneračního potenciálu jiných kmenových buněk, jsou v příkrém rozporu s dogmaty zavedenými v biologii.

Při kultivaci v nízké hustotě tvoří stromální kmenové buňky kostní dřeně odlišné kolonie, z nichž každá pochází z jedné progenitorové buňky. Procento stromálních progenitorových buněk v jaderných buňkách kostní dřeně, určené schopností tvorby kolonií, je vysoce závislé jak na kultivačních podmínkách, tak na druhu MSC. Například u hlodavců je přítomnost ozářených podpůrných buněk kostní dřeně a séra v kultuře naprosto nezbytná pro získání maximálního počtu stromálních progenitorových buněk, zatímco u lidí je účinnost tvorby kolonií mezenchymálních kmenových buněk nezávislá jak na podpůrném médiu, tak na kultivačním médiu. Počet známých mitogenních faktorů, které stimulují proliferaci stromálních progenitorových buněk, je omezený. Patří mezi ně PDGF, EGF, FGF, TGF-β a IGF1. Za optimálních kultivačních podmínek mohou polyklonální linie MSC odolat více než 50 buněčným dělením in vitro, což umožňuje získat miliardy stromálních buněk kostní dřeně z 1 ml jejich aspirátu.

Populace stromálních buněk kostní dřeně je však heterogenní, což se projevuje jak variabilitou velikosti kolonií, různou rychlostí jejich tvorby, tak i rozmanitostí buněčné morfologie, která pokrývá rozsah od fibroblastům podobných vřetenovitě tvarovaných buněk až po velké ploché buňky. Během vývoje těchto kultur je po 20 dnech zaznamenána i fenotypová heterogenita. Některé kolonie se vyznačují vysokou expresí alkalické fosfatázy, jiné ji neexprimují vůbec a kolonie třetího typu jsou v centrální oblasti fosfatáza-pozitivní a na periferii fosfatáza-negativní. Jednotlivé kolonie tvoří uzlíky kostní tkáně (nástup mineralizace matrice je označen barvením alizarinovou červení nebo na vápník podle Van Kosse). V jiných koloniích dochází k akumulaci tuku, která je identifikována G-barvením olejovou červení. Méně často kolonie mezenchymálních kmenových buněk tvoří chrupavky barvené alciánovou modří).

Po ektopické transplantaci experimentálním zvířatům tvoří polyklonální linie MGK ektopickou kost s retikulárním stromatem asociovaným s myelopoézou a adipocyty a méně často s chrupavčitou tkání. Při transplantaci monoklonálních linií buněk stromatu kostní dřeně je v některých případech pozorován chimerismus, kdy de novo kost se skládá z buněk kostní tkáně, obsahuje stroma a adipocyty dárcovského původu, zatímco buňky hematopoetické linie a cévního systému pocházejí od příjemce.

Výsledky těchto studií potvrzují kmenovou povahu progenitorových buněk stromatu kostní dřeně, z nichž byla klonální linie odvozena. Naznačují také, že ne všechny buňky klonogenní v kultuře jsou skutečně multipotentní kmenové buňky. Někteří výzkumníci se domnívají, a my sdílíme jejich názor, že nejspolehlivější informace o skutečném diferenciačním potenciálu jednotlivých klonů lze získat pouze in vivo po transplantaci, a nikoli stanovením fenotypu jejich derivátů in vitro. Exprese fenotypových markerů osteo-, chondro- nebo adipogeneze v kultuře (stanovených mRNA nebo histochemickými technikami) a dokonce ani produkce mineralizované matrix neodrážejí stupeň pluripotence jednotlivého klonu in vivo. Identifikace kmenových buněk ve skupině stromálních buněk je proto možná pouze a posteriori, za vhodných podmínek biologického transplantačního testu. Zejména chondrogeneze je velmi vzácně pozorována v otevřených transplantačních systémech, zatímco tvorba chrupavky není zdaleka neobvyklá v uzavřených systémech, jako jsou difuzní komory nebo in vitro mikromasové kultury stromálních buněk, kde je dosaženo lokálně nízkého tlaku kyslíku, což podporuje tvorbu chrupavčité tkáně. Proto i transplantační technika, stejně jako nespecifické podmínky kultivace in vitro, významně ovlivňují rozsah diferenciace MSC.

Experimentální transplantace za specifických experimentálních podmínek je zlatým standardem pro stanovení diferenciačního potenciálu stromálních buněk kostní dřeně a klíčovým prvkem v jejich identifikaci. Historicky jsou studie transplantace stromálních buněk kostní dřeně spojeny s obecným problémem transplantace kostní dřeně. Bylo zjištěno, že hematopoetické mikroprostředí je vytvořeno transplantací linií stromálních buněk kostní dřeně a zajišťuje ektopický vývoj hematopoetické tkáně v transplantační zóně. Původ mikroprostředí od dárce a hematopoetické tkáně od hostitele nám umožňuje považovat ektopickou kost za skutečnou „invertovanou“ transplantaci kostní dřeně. Lokální transplantace stromálních buněk kostní dřeně podporuje účinnou korekci kostních defektů, výraznější než při spontánní reparativní regeneraci. Několik preklinických studií na experimentálních modelech přesvědčivě prokázalo možnost využití transplantací stromálních buněk kostní dřeně v ortopedii, ačkoli pro optimalizaci těchto metod je zapotřebí co nejpečlivější práce a analýzy, a to i v nejjednodušších případech. Zejména optimální podmínky pro expanzi osteogenních stromálních buněk ex vivo dosud nebyly stanoveny, struktura a složení ideálního nosiče, stejně jako počet buněk nezbytných pro objemovou regeneraci kosti, zůstávají nevyvinuté.

Kromě použití ex vivo expandovaných stromálních buněk kostní dřeně pro regeneraci tkání mezenchymálního původu otevírá neortodoxní plasticita MSC potenciální aplikace pro regeneraci nervových buněk nebo dodávání genových produktů do CNS. V principu to zjednodušuje buněčnou terapii poškození nervového systému, protože není nutné získávat autologní lidské nervové kmenové buňky. Byly hlášeny potenciální aplikace buněk kostní dřeně pro generování kardiomyocytů a myogenních progenitorových buněk pravého stromálního i extrastromálního původu.

Probíhají experimenty se systémovou transplantací stromálních buněk kostní dřeně pro léčbu běžných onemocnění skeletu. Není pochyb o tom, že stromální buňky kostní dřeně jsou populací zodpovědnou za genetické poruchy u onemocnění skeletu, což dobře ilustruje vektorový přenos genetické informace pomocí těchto buněk, který vede k tvorbě patologické kostní tkáně u experimentálních zvířat. Schopnost stromálních buněk implantovat se, uchytit se, proliferovat a diferencovat se v kostech skeletu po zavedení do krevního oběhu však dosud nebyla prokázána.

To je částečně proto, že při standardní transplantaci kostní dřeně se stroma netransplantuje společně s hematopoetickou tkání, takže přísná kritéria pro posouzení úspěšného uchycení systémově podávaných stromálních buněk dosud nebyla vyvinuta. Je třeba si uvědomit, že přítomnost markerových genů v tkáňových extraktech nebo izolace buněk dárcovského původu v kultuře neindikuje uchycení buněk, ale pouze jejich přežití. I intraarteriální injekce stromálních buněk kostní dřeně do končetiny myši může vést k prakticky nulovému uchycení, a to i přes skutečnost, že buňky dárcovského původu se nacházejí ve velkém počtu v mikrovaskulatuře kostní dřeně. Bohužel jsou takové buňky obvykle popisovány jako „uchycené“ pouze na základě detekce markerových genů pro dárcovské buňky v ex vivo kultuře. Kromě toho je nutné poskytnout přesvědčivé důkazy o dlouhodobé integraci diferencovaných a funkčně aktivních buněk dárcovského původu ve studovaných tkáních. V mnoha publikovaných pracích, které se zabývají uchycením stromálních buněk kostní dřeně do kostry, je absence jasných údajů tohoto druhu zarážející. Je však třeba poznamenat, že některé korektní experimenty na zvířatech skutečně prokázaly omezené, ale skutečné uchycení stromálních progenitorových buněk po jejich systémovém podání.

Tato data jsou v souladu s výsledky studií o možnosti transportu myogenních progenitorových buněk kostní dřeně do svalu prostřednictvím cévního systému. Nemělo by se však zapomínat, že jak kosterní, tak svalová tkáň se tvoří během vývoje a růstu na základě extravaskulárních pohybů buněk, které využívají migrační procesy nezahrnující krevní oběh. Pokud existuje nezávislá oběhová cesta pro transport progenitorových buněk do tkání pevné fáze, je možné předpokládat existenci fyziologicky cirkulujících mezenchymálních progenitorových buněk? Jaký je původ těchto buněk ve vyvíjejícím se i postnatálním organismu a jak pronikají cévní stěnou? Řešení těchto otázek se jeví jako naprosto nezbytné a vyžaduje co nejpečlivější preklinickou analýzu. I po nalezení odpovědí na tyto otázky zůstanou problematické kinetické aspekty spojené s růstem skeletu a remodelací pojivové tkáně nevyřešeny. Zároveň se léčba poruch osteogeneze nahrazením celé populace mutovaných kosterních progenitorových buněk zdravými stromálními elementy jeví jako reálná klinická perspektiva. V tomto případě lze lokální zóny zlomenin nebo deformace v důsledku patologické osteogeneze, stejně jako destruktivní změny kostní tkáně, korigovat pomocí stromálních kmenových buněk kultivovaných in vitro. Proto je vhodné zaměřit budoucí výzkum na problematiku transformace nebo genetické korekce autologních mutovaných osteogenních progenitorových buněk ex vivo.

Genetické inženýrství buněk, ať už krátkodobé nebo trvalé, se stalo základem buněčné a molekulární biologie, zdrojem mnoha vědeckých objevů týkajících se role jednotlivých proteinů v buněčném metabolismu in vitro a in vivo. Využití molekulárních technologií pro korekci dědičných patologií a lidských onemocnění je pro praktickou medicínu velmi slibné, protože vlastnosti stromálních kmenových buněk kostní dřeně umožňují vyvinout unikátní transplantační schémata pro korekci genetických onemocnění kostry. Zároveň lze mezenchymální prekurzorové buňky snadno získat od budoucího příjemce, jsou přístupné genetické manipulaci a jsou schopny se množit ve velkém množství v krátkém časovém období. Použití mezenchymálních kmenových buněk umožňuje vyhnout se omezením a rizikům spojeným s dodáváním genetického informačního materiálu přímo pacientovi prostřednictvím intravaskulárních vektorových konstruktů. Podobná strategie je použitelná i pro embryonální kmenové buňky, ale autologní postnatální stromální buňky kostní dřeně jsou výhodnějším materiálem, protože jejich zavedení vylučuje možné imunologické komplikace po transplantaci. Pro dosažení krátkodobého účinku, například k urychlení regenerace kostí, je nejoptimálnější metodou genetická modifikace mezenchymálních kmenových buněk pomocí elektroporace, chemické fúze, lipofekce, plazmidů a adenovirových konstruktů. Zejména virová transfekce do stromálních buněk kostní dřeně BMP-2 se ukázala jako účinná při urychlení regenerace kostí u experimentálního polytraumatu. Vytvoření adenovirových vektorových konstruktů je výhodnější kvůli absenci toxicity. Genetická modifikace stromálních buněk kostní dřeně se však v tomto případě vyznačuje extrémně nízkou stabilitou. Kromě toho normální transformované stromální buňky kostní dřeně vyžadují použití vektorových nosičů genetické informace, které jsou 10krát infekčnější než jiné typy buněk, což významně zvyšuje procento úmrtí transfekovaných buněk.

Léčba recesivních onemocnění způsobených nízkou nebo nulovou biologickou aktivitou určitých genů vyžaduje dlouhodobou nebo trvalou modifikaci mezenchymálních kmenových buněk, což vyžaduje použití adeno-asociovaných virů, retrovirů, lentivirů nebo adeno-retrovirových chimér. Transportní oblasti těchto virů jsou schopny přenášet velké DNA transfekty (až 8 kb). Vědecká literatura již informovala o exogenní biologické aktivitě stromálních buněk kostní dřeně transfekovaných retrovirovými konstrukty kódujícími syntézu regulačních a markerových molekul - IL-3, CD2, faktoru VIII, a také enzymů zapojených do syntézy L-DOPA. I v těchto studiích však autoři poukazují na řadu omezení, která je třeba překonat před praktickým využitím této technologie. Prvním problémem je optimalizace procesu modifikace MSC ex vivo. Je známo, že dlouhodobá (3-4 týdny) proliferace stromálních buněk kostní dřeně in vitro snižuje jejich transfekci. Zároveň je pro dosažení vysoké úrovně genetické modifikace MSC nutné provést několik transfekčních cyklů. Druhý problém je spojen s dobou trvání terapeutické genové exprese, která zatím nepřesahuje čtyři měsíce. Přirozený pokles efektivní genové exprese je způsoben inaktivací promotoru a smrtí modifikovaných buněk. Vzhledem k obecným vyhlídkám přenosu genetické informace pomocí mezenchymálních kmenových buněk výsledky předběžných studií naznačují potřebu další optimalizace ex vivo transfekčních metod, výběru adekvátního promotoru regulujícího biologickou aktivitu požadovaným směrem a zvýšení schopnosti modifikovaných stromálních buněk kostní dřeně k sebeudržování in vivo po transplantaci. Je třeba poznamenat, že použití retrovirových konstruktů k modifikaci stromálních buněk kostní dřeně požadovaným směrem nevyžaduje vždy jejich povinné uchycení. Transfekované mezenchymální kmenové buňky mohou plnit korekční funkci na pozadí stabilní rezidence a bez povinného aktivního fyzického začlenění a fungování v pojivové tkáni. V tomto případě by měly být považovány za biologickou mini-pumpu produkující in vivo faktor, jehož nedostatek určuje projevy genetické patologie.

Použití transformovaných stromálních buněk kostní dřeně k léčbě dominantní genetické patologie, která je charakterizována expresí genu s patologickou nebo abnormální biologickou aktivitou, je mnohem problematičtější, protože v tomto případě je nutné blokovat přenos nebo implementaci zkreslené genetické informace. Jednou z metod genetického inženýrství je homologní rekombinace embryonálních kmenových buněk za účelem vytvoření transgenních zvířat. Extrémně nízký stupeň homologní rekombinace v kombinaci s problémy identifikace, separace a expanze takových rekombinantů však pravděpodobně nepřispěje k širokému využití této metody v blízké budoucnosti, a to ani v případě vývoje nových technologických metod. Druhý přístup v genové terapii dominantní patologie je založen na automatické korekci poškozené DNA, protože genetické mutace lze korigovat zavedením exogenní DNA s požadovanou sekvencí (krátké DNA oligonukleotidy nebo chimérické RNA/DNA oligonukleotidy), která se váže na homology v poškozeném genomu. Třetí možnost zahrnuje blokování přenosu patologické informace, čehož se dosahuje použitím speciálně navržených oligonukleotidů, které se vážou na specifický gen za vzniku ternární helikální struktury, která eliminuje možnost transkripce.

Ačkoli korekce genetického onemocnění na úrovni genomu zůstává nejoptimálnější a nejpreferovanější terapeutickou metodou, mRNA je také slibným vektorem (možná i dostupnějším) pro blokování dominantně negativního genu. Proteinové molekuly s antisense oligonukleotidem nebo kompletními sekvencemi, které blokují vazbu mRNA na buněčný biosyntetický aparát, se již dlouho používají k inhibici translace a/nebo zvýšení degradace mRNA. Dvouvláknová RNA navíc indukuje rychlou degradaci mRNA, jejíž mechanismus zůstává nejasný. Je však nepravděpodobné, že by pouhá eliminace mRNA transkribovaných z mutantní alely s krátkými nebo jednotlivými mutacemi podpořila expresi mRNA normální alely. Alternativou je použití kladívkových a vlásenkových ribosyntéz, které mají schopnost vázat se na vysoce specifické oblasti mRNA s následnou indukcí jejich štěpení a inaktivací během translace. Možnost využití této metody v terapii patologické osteogeneze je v současné době studována. Bez ohledu na to, co přesně je cílem - genomové nebo cytoplazmatické elementy, bude úspěch nových technologií genové terapie určen účinností začlenění činidel do stromálních buněk kostní dřeně ex vivo, optimálním výběrem specifického vektoru a stabilní schopností mezenchymálních kmenových buněk exprimovat potřebné faktory in vivo.

Objev mezenchymálních kmenových buněk s jejich neočekávanými vlastnostmi tak vytváří nové koncepční schéma pro vývoj buněčných linií. Pro pochopení biologické role stromálních kmenových buněk, jejich povahy, schopnosti transdiferenciace nebo dediferenciace, jejich fyziologického významu během embryonálního vývoje, postnatálního růstu, zrání a stárnutí, jakož i u lidských onemocnění, je však zapotřebí dalšího interdisciplinárního výzkumu.