Mesenchymální kmenové buňky

Mezi regionálními kmenovými buňkami zaujímají mezenchymální kmenové buňky (MSCs) zvláštní místo, jejichž deriváty tvoří stromální matrix všech orgánů a tkání lidského těla. Prioritou výzkumu MSC patří zástupci ruské biologické vědy.

V polovině minulého století v laboratoři Friedensteinem byl poprvé izolován homogenní kultury multipotentních stromální kmenové buňky kostní dřeně. Mesenchymální kmenové buňky přichycené k podkladu po dlouhou dobu zachována vysoké rychlosti proliferace a kultury při nízké hustotě očkovacího po fixaci na podkladu vytvořeném z fibroblastových buněčných klonů, které nemají fagocytární aktivitu. MSC proliferace Zastavení dokončili jejich spontánní diferenciaci in vitro do kostních buněk, tukových, chrupavky, svalu nebo pojivové tkáně. Další studie ukázala, osteogenní potenciál podobných fibroblastům stromálních buněk kostní dřeně z různých druhů savců, jakož i aktivita tvořit kolonie. Při pokusech in vivo bylo prokázáno, že jak hetero- a ortotopické transplantaci fibroblastů kolonie tvořící buňky je dokončeno tvoří kost, chrupavku, a vláknité tukové tkáně. Vzhledem k tomu, stromálních kmenových buněk kostní dřeně, vyznačující se vysokou kapacitou pro sebeobnovy a diferenciace kontrapunktu v rámci stejné buněčné linie, které se nazývají multipotentní mesenchymální progenitorové buňky.

Je třeba poznamenat, že za 45 let základního výzkumu mezenchymálních kmenových buněk byly vytvořeny reálné podmínky pro použití jejich derivátů v klinické praxi.

Dnes není pochyb o tom, že všechny tkáně lidského těla jsou tvořeny z kmenových buněk různých buněčných linií jako výsledek procesů proliferace, migrace, diferenciace a zrání. Nedávno se však věřilo, že kmenové buňky v dospělém těle jsou specifické pro tkáň, tj. Schopné produkovat specializované buněčné linie pouze tkání, ve kterých jsou umístěny. Tato koncepční situace byla vyvrácena fakty transformace hematopoetických kmenových buněk nejen do buněčných elementů periferní krve, ale také do oválných jaterních buněk. Navíc a neurální kmenové buňky mohly vést k neuronům i gliovým elementům, stejně jako k počátečnímu oddělení hematopoetických progenitorových buněk. Mezenchymální kmenové buňky, které obvykle produkují buněčné elementy kosti, chrupavky a tukové tkáně, jsou schopné přeměnit se na nervové kmenové buňky. Předpokládá se, že v procesu růstu, fyziologické a reparativní regenerace tkání se vytvářejí nezávazné progenitorové buňky z tkáňově specifických kmenových rezerv. Například reparaci svalových tkání lze uskutečnit pomocí mezenchymálních kmenových buněk, které migrují z kostní dřeně do kosterních svalů.

Ačkoli takové cross zaměnitelnost kmenové buňky rozpoznat ne všem výzkumným pracovníkům možnost klinického využití mezenchymálních kmenových buněk jako zdroj pro transplantaci buněk a buněk vektoru genetické informace nezpochybnila jako multipotentní stromálních kmenových buněk kostní dřeně, které mohou být poměrně snadno izolovat a šíří v kultuře in vitro. Zároveň se v odborné literatuře stále objevují zprávy o potenciálu pluripotentních kmenových buněk podpůrné vazivové tkáně kostní dřeně. Jako důkaz prezentovány výzkumných protokolech, které pod vlivem určitých induktorů transdiferenciace MSC jsou převedeny do nervových buněk, kardiomyocytů a hepatocytech. Nicméně někteří vědci možnost znovu aktivace a exprese genu v časném embryogeneze v vážné pochybnosti. Ve stejné době, každý chápe, že pokud se zjistí podmínky pro rozšíření multipotentní mezenchymálních kmenových buněk na pluripotenci HSR v regenerativní medicíně a plastů automaticky vyřešit mnoho problémů etické, morální, náboženské a právní povahy. Kromě toho, protože v tomto případě je zdroj kmenových regenerační schopnosti pacienta jsou autologní stromální buňky se řeší a problém imunitního odmítnutí transplantace buněk. Jak skutečné jsou tyto vyhlídky, v blízké budoucnosti se ukáže.

[1], [2]

Použití mezenchymálních kmenových buněk v medicíně

Použití klinika derivátů mezenchymálních kmenových buněk je spojeno především se snížením defektů tkáně způsobené rozsáhlých a hlubokých tepelných lézí kůže. Preklinické experimentální ověření vhodnosti alogenní fibroblastových podobných mezenchymálních kmenových buněk pro léčbu hlubokých popálenin byla provedena. Je prokázáno, že fibroblasty podobné kostní dřeně mezenchymálních kmenových buněk tvoří monovrstvy v kultuře, takže je možné je transplantovat optimalizovat regeneraci hlubokých popálenin. Autoři poznamenávají, že podobné vlastnosti mají embryonálních fibroblastů, ale klinická aplikace to je omezeno na stávající etické a právní problémy. Hluboké tepelné popáleniny s poškozením všech vrstev pokožky byly modelovány na potkanech Wistar. Plocha hoření byla 18-20% celkové plochy pokožky. V první pokusné skupiny se skládal z krys s hlubokým tepelného poškození a transplantace alogenních fibroblastů odvozených od mezenchymálních kmenových buněk. Druhá skupina se skládala ze zvířat s hlubokými popáleninami a trans-plantáží alogenních embryonálních fibroblastů. Třetí skupina kontrolních krys byla opatřena hlubokou tepelným poškozením, které neprovedla buněčné terapie. Suspenze fibroblastu odvozený z mezenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastech byla aplikována na popálenině povrchem pipetuje v množství 2 x 10 ⁴ buněk na 2. Den po excizi modelování vyhoření a nekrotické krusty vytvořené. Po transplantaci, buňky hořet povrch pokrytý gázou namočenou ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s gentamicinu. Plotové buňky kostní dřeně k získání MSCs s následnou indukcí fibroblastů linie mesenchymálních kmenových buněk produkovaných u dospělých krys Wistar z femuru. Embryonální fibroblasty byly získány z plic 14-17 dnů starých embryí. Embryonální fibroblasty a buňky kostní dřeně pro získání pre-MSC byly kultivovány v Petriho miskách při teplotě 37 ° C v C02 iikubatore, v atmosféře s 5% CO2 při 95% vlhkosti. Embryonální fibroblasty byly kultivovány po dobu 4-6 dnů, zatímco v případě tvorby monovrstvy MSC požadované od 14 do 17 dnů. Následně MSC udržuje kryokonzervaci jako výchozí materiál pro fibroblastových odvozeného mesenchymálních kmenových buněk, které byly připraveny podle rozmrazení a kultivace MSC po dobu 4 dnů. Počet fibroblastových generované mezenchymálních kmenových buněk je více než 3 krát počet embryonálních fibroblastech vzniklých během stejného období kultivace. Pro identifikaci buněk v transtslantirovannyh popálenin v kroku kultivace jejich genomem označena pomocí virového shuttle vektoru na bázi rekombinantní adenovirus kódující V typ nosiče 1 aS-2 genu beta-galaktosidázy E. Coli. Živé buňky v různých časech po transplantaci detekována imunohistochemicky na zmrazených řezech se přidá substrát X-gal, čímž charakteristickou modro-zelené barvy. V důsledku vizuální dynamiky, polohového a histologické hodnotící stav popálenin, bylo zjištěno, že dokonce na 3. Den po transplantaci buněk v oddělených skupinách se objeví významné rozdíly v průběhu procesu hojení ran. Zvláště odlišný, tento rozdíl se stal na 7. Den po transplantaci buněk. Zvířatům první skupiny, které byly transplantovány fibroblastů-jako mezenchymální kmenové buňky, rána získal rovnoměrně růžové intenzivní barvy, granulační tkáň vzrostla po celé své ploše na úrovni epidermis, a vypálit plocha je podstatně zmenší. Několik vytvořena tenčí kolagenové fólie na povrchu rány, ale ona pokračovala pokrýt celou plochu hořet. Zvířatům druhé skupiny, které byly transplantovány embryonální fibroblasty, granulační tkáň se zvedne na úroveň epidermis okraje rány, ale jen v některých místech, zároveň plazmoreya z rány byla intenzivnější než ve skupině 1, a nejprve vytvoří kolagenová folie prakticky zmizel. U zvířat, která neobdržela terapie kmenových buněk, v 7. Den vypalování rány byl světle, vypeckovaných, nekrotickou tkáň, potažené fibrinu. Na povrchu hoření byla zaznamenána plazmurina. Histologicky zvířata 1. A 2. Skupiny bylo prokázáno snížení buněčné infiltrace a vývoj vaskulatury, tyto příznaky počínající proces regenerátoru byly závažnější u krys ve skupině 1. V kontrolní skupině vykazovaly známky buněčné infiltrace operační rány, histologické vzor nově vytvořených krevních cév nepřítomné. 15-30 tý den pozorování zvířata 1. Plochy skupina vyhoření byl výrazně menší než u potkanů jiných skupin a granulační povrch byl více rozvinutý. U zvířat z 2. Skupiny vypalování povrchu se také snížila ve srovnání s velikostí popálenin v kontrolní skupině krys, která byla vzhledem k okrajové epitelizace. V kontrolní skupině povrchově místa vypalování zůstal světle granulace s vzácné, na nich uvedených žilky, ostrůvky byly fibrinózní deska pokračuje mírný plazmoreya přes hoření povrchu, něco, co je obtížné odnímatelný strupovitost zůstala. Obecně platí, že zvířata ze skupiny 3, také snižuje velikost rány, ale rána zůstal podrytymi okraj.

Takže během srovnávací studie hojení ran ceny použitím fibroblastů odvozených od mezenchymálních kmenových buněk a fibroblastů plodu, a bez použití buněčné terapie označen zrychlení hojení popálenin povrchu v důsledku transplantace fibroblastových odvozených od mezenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastů. Nicméně, v případě použití allogenních mezenchymálních kmenových buněk fibroblastů hojení rychlost byla vyšší než v transplantaci embryonálních fibroblastů. To se projevuje v zrychlující se změnou regeneračních fází procesu - ke snížení buněčné infiltrace období, zvyšuje míru proliferace cévních sítí, stejně jako tvorbu granulační tkáně.

Výsledky dynamické planimetrií ukazují, že míra spontánního hojení popálenin (bez použití buněčné terapie) byla nejnižší. V 15. A 30. Dnem po transplantaci alogenních mezenchymálních kmenových buněk fibroblastů hojení rychlost byla vyšší než při transplantaci embryonálních fibroblastů. Histochemické metody pro detekci beta-galaktosidázy ukázala, že po transplantaci podobných fibroblastům mesenchymálních kmenových buněk a embryonálních fibroblastů po celou dobu pozorování na povrchu a hlubokých ran regenerujících transplantovaných buněk zůstávají životaschopné. Autoři předpokládají, že vyšší rychlost hoření regenerace ran pomocí mezenchymálních kmenových buněk fibroblastů podmíněné propuštění těchto buňkách během zrání rostostimuliruyushih bioaktivních faktorů.

Transplantace autologní nebo alogenní keratinocyty a alogenní fibroblasty k léčbě popálenin a použity v klinické praxi. Je třeba poznamenat, že chirurgická léčba dětí s rozsáhlými hlubokými popáleninami je složitý úkol vzhledem k vysoké četnosti traumatologických a chirurgických zákroků významnou ztrátu krve, na základě různých reakcí používaných infuze media. Hlavní problémy při provádění kůže a plastické chirurgie s rozsáhlými hlubokými popáleninami, plocha více než 40% povrchu těla, vzhledem k závažnosti svého stavu a nedostatek zdrojů dárcovské kůže. Použití pletiva štěpů s velkým poměrem perforační neřeší problém, protože obraz po epiteliziruyutsya buněk perforace je velmi pomalý a často kožní štěpy lyžují nebo suché. Takové povlaky popálenin je ksenokozha, mrtvého štěpu, syntetické filmové povlaky nejsou vždy dostatečně účinné, takže vývoj nových metod pro ukončení hoření povrchových vrstev kultivovaných keratinocytů a fibroblastů. Zejména způsob uzavírání vypalování povrchy pomocí kultivovanou allofibroblastov poskytuje během transplantace výrazný stimulační efekt na proliferaci epidermotsitov konzervované v okraje rány u popálenin, a keratinocytů štěpy mesh pásů. V Budkevich L. Et al (2000) ukazuje výsledky použití této metody pro léčení popálenin u dětí. Bylo pozorováno 31 dětí s tepelnou traumou ve věku od 1 do 14 let. Na tři děti celkové ploše popálenin IIIA-B - IV stupně byla 40%, 25 - 50 - 70%, a to i na tři - 71-85% povrchu těla. Včasný chirurgický nekrektomie v kombinaci s transplantací kultivovaných allofibroblastov a autodermaplasty. V prvním manipulačním stupni byl proveden nekrotické tkáně vyříznutí, druhý - na transplantaci kultivované allofibroblastov nosného filmu, třetí (48 hodin po transplantaci kultivované allofibroblastov) - odstranění matrice a kožní klapky se autodermoplasty poměru perforace 1: 4. Tři pacienti přijatí do nemocnice s těžkým onemocněním vyhoření, kultivovaný allofibroblasty byly transplantovány na granulační rány. Transplantace kultivovaných allofibroblastov provést jednou za 18 dětí, dvakrát - na 11, tři - dva pacienty. Plocha povrchu rány pokrytá buněčnou kulturou byla od 30 do 3500 cm2. Účinnost kultivovaných allofibroblastov hodnocené celkovým procentem štěpu kožních laloků, doba hojení popálenin a počtu úmrtí závažné tepelné poranění. Přiložení transplantátů bylo kompletní u 86% pacientů. Částečný nedostatek kožních chlopní byl zaznamenán ve 14% případů. Přes pokračující léčbu zemřelo šest dětí (19,3%). Celková plocha léze pokožky v nich byla od 40 do 70% povrchu těla. Transplantace kultivovaných allofibroblastov neměl žádný vztah k smrti popálení jednoho pacienta.

Analyzování výsledků léčby, autoři poznamenávají, že předchozí popáleniny neslučitelné se životem, k léčbě hluboké tepelné poškození plochy pokožky 35-40% povrchu těla (pro malé děti - až 3 roky - jsou kritické hluboké popáleniny o rozloze 30%, pro starší děti věk - více než 40% povrchu těla). Když je chirurgický transplantace kultivovaných nekrektomie allofibroblastov autodermaplasty a následnou kožní štěpy s velkými popáleninami, perforace faktor IIIB - IV stupně zůstává kritická, ale v současné době existují vyhlídky v mnoha případech zachránit život i tyto oběti. Chirurgická nekrektomie ve spojení s transplantací kultivovaných allofibroblastov a autodermaplasty u dětí s hlubokými popáleninami se ukázala být zvláště účinná u pacientů s pokročilou lézemi kůže s deficitem dárcovských stránek. Aktivní chirurgické taktikou a přesazování kultivovány allofibroblastov podporují rychlé stabilizaci celkového stavu těchto pacientů, snížení počtu infekčních komplikací hoření onemocnění, vytváří příznivé podmínky pro přihojení, zkrácení doby potřebné k obnovení ztracené kůže a trvání léčby v nemocnici, snížení výskytu úmrtí u pacientů s rozsáhlých popálenin. Tak, transplantace kultivovaných allofibroblastov následuje autodermaplasty kožní klapky dosahuje zotavení u dětí s těžkými popáleninami, které byly dříve považovány za ztraceni.

Je všeobecně známo, že primárním cílem léčby onemocnění popálení je maximalizovat úplné a rychlé zotavení poškozené pokožky, aby se zabránilo vzniku toxických účinků, infekčních komplikací a dehydratace těla. Výsledky aplikace kultivovaných buněk do značné míry závisí na připravenosti na transplantaci samotné poraněné rány. V případě transplantace kultivovaných keratinocytů na povrchu rány po chirurgickém nekrektomii prizhivlyaetsya v průměru o 55% (podle plochy) transplantovaných buněk, přičemž granulační rány přihojení rychlost je snížena na 15%. Proto úspěšná léčba rozsáhlých hlubokých popálenin vyžaduje především aktivní chirurgickou taktiku. V přítomnosti popálenin IIIB-IV stupeň spalování povrchu okamžitě zbaví nekrotickou tkáň, aby se snížila jevů intoxikace a snížení množství komplikací hořet onemocnění. Použití takových taktik je klíčem ke snížení čas od času vypalování uzavřením rány a délku pobytu pacientů s rozsáhlými popáleninami v nemocnici, ale také výrazně snižuje počet úmrtí.

První zprávy o úspěšném použití kultivovaných keratinocytů na pokrytí hořlavého povrchu se objevily na počátku osmdesátých let minulého století. Následně se tato manipulace byla provedena kultivovaných keratinocytů vrstvy, často získaných z autokletok, mnohem méně - z allokeratinotsitov. Nicméně autokeratinotsitoplastiki technologie neumožňuje vytvářet buněčné banky, přičemž čas potřebný k výrobě dostatečného prostoru štěpu z keratinocytů, vysoké a množství na 3-4 týdnů. Během tohoto období vzrůstá riziko vzniku infekčních a jiných komplikací popálení, což významně prodlužuje celkovou délku pobytu pacientů v nemocnici. Navíc prakticky žádná autokeratinotsity prizhivlyayutsya transplantace pro granulační spálenin a vysoké náklady na specializovaných růstového média a jeho biologicky aktivní stimulátory růstu keratinocyte významně omezuje jejich klinické použití. Další biotechnologické metody, jako je transplantace kollagenoplastika ksenokozhi Kryokonzervované, jakož i používání různých biopolymerů povlaků zvýšit efektivitu povrchové úpravy rozsáhlých, ale ne hluboké popáleniny. Způsob potahování povrchu rány kultivovanými fibroblasty je zásadně odlišný v tom, že hlavní složkou buněk kultivovaných buněk nejsou keratinocyty, ale fibroblasty.

Předpokladem pro vývoj způsobu slouží jako důkaz, že pericyty, které obklopují malé cévy jsou Pro- genitornymi mezenchymální buňky schopné přeměnit fibroblasty, které produkují řadu růstových faktorů a poskytují hojení ran kvůli silné stimulační účinek na proliferaci a adhezi keratinocytů. Použití kultivovaných fibroblastů pro uzavření rány ploch okamžitě identifikovat řadu významných výhod této metody při využívání kultivovaných keratinocytů. Zejména příprava fibroblastů v kultuře nevyžaduje použití speciálních kultivačních médiích a růstových stimulátorů, což snižuje náklady na transplantaci více než 10 krát náklady na získání keratinocyty. Fibroblasty jsou snadno podrobeny pasážování, při které se částečně ztrácí své povrchové histokompatibilních antigeny, což umožňuje použít pro výrobu alogenních transplantátů buněk a vytvářet své banky. Zkracuje přijímací transplantace, vhodné k použití v klinice, z 3 týdny (keratinocytů) 1-2 dny (pro fibroblasty). Primární kultury fibroblastů je možno získat kultivací buněk z fragmentů kůže odebraných v autodermoplasty a buněčná hustota setí Po obdržení subkultur lidských fibroblastů je pouze 20 x 10 ³ na 1 cm ².

Pro studium účinku fibroblastů a jejich regulačních proteinů v proliferaci a diferenciaci keratinocytů, srovnávací analýzu vlastností a morfologii proliferaci keratinocytů na substrátech kolagenu typu I a III a fibronektin v ko-kultuře s lidskými fibroblasty. Lidské keratinocyty byly izolovány z fragmentů kůže pacientů s popáleninami, které byly během operace autodermoplastiky odebrány. Hustota keratinocytů byla 50 x 103 buněk na cm2. Klinická účinnost transplantace kultivovaných fibroblastů byla hodnocena u 517 pacientů. Všichni pacienti byli rozděleni do dvou skupin: 1. - dospělí postižení spalováním IIA, B - IV stupeň; 2. - děti s hlubokými popáleninami stupně IIIB - IV. Posouzení dynamiky strukturní a funkční organizaci jednovrstvé kultury fibroblastů, pokud jde o úlohu v procesu regenerace glykosaminoglykanů, fibronektin, kolagen, a nechá autoři určit třetí den jako nejvhodnější z hlediska použití fibroblastových kultur pro výrobu transplantací. Zkoumání vlivu na proliferaci a diferenciaci keratinocytů fibroblastů ukázaly, že za fibroblasty in vitro mají výrazný stimulační účinek, a to především na keratinocytů adhezních procesech, zvyšuje počet adherentních buněk a rychlost stanovení více než 2 krát. Stimulace adhezní procesy doprovázené zvýšenou intenzitou syntézy DNA a úrovně proliferaci keratinocytů. Dále bylo zjištěno, že přítomnost fibroblastů a extracelulární matrix tvořené nich je předpokladem pro vznik tonofibrillyarnogo zařízení keratinocytů mezibuněčných spojení, a v konečném důsledku k diferenciaci keratinocytů a tvorbu bazální membrány. Při léčbě dětí s hlubokými popáleninami založena klinickou účinnost transplantace allofibroblastov kultury, a to zejména u pacientů s rozsáhlými lézemi dárcovských kůže místech v deficitu. Komplexní morfofunktcionalnoe studie ukázala, že roubované vyznačující fibroblasty aktivní syntéza DNA, stejně jako kolagen, fibronektin a glykosaminoglykany, které jsou generovány v buňkách extracelulární matrix. Autoři předpokládají, vysoké procento přihojení transplantovaných fibroblastů (až 96%), což je výrazné snížení, pokud jde o jejich přípravě (během 2-3 hodin namísto 24-48 týdnů v případě keratinocytů), podstatné zrychlení epitelizaci vypalování povrchu, a významné snížení ceny (v 10 časů) technologie růstu štěpu z fibroblastů ve srovnání s transplantací keratinocytů. Použití transplantace kultivovaných allofibroblastov umožňuje zachránit životy dětí s kritickými popáleninami - tepelným poškozením více než 50% tělesného povrchu, která se dříve myslelo neslučitelná se životem. Je pozoruhodné, že alogenní transplantace embryonálních fibroblastů také přesvědčivě dokázal nejen rychlejší regeneraci ran a pacientů rekondiční s různým stupněm popálenin a okolí, ale také podstatné snížení úmrtnosti.

Autologní fibroblasty se používají v takové komplikované a plastické chirurgie, jako poškození korekční náhradní hlasivkách. Obvykle se používá pro tento účel bovinního kolagenu, trvání účinku, která je omezena jeho imunogenicity. Jako cizí protein, hovězí kolagen, kolagenáza citlivé na příjemce a může vyvolat imunitní reakce, aby se snížilo riziko, které technologie kolagenových přípravků byly vyvinuty, síťovaný glutaraldehydem. Jejich výhodou je větší stabilita a nižší imunogenicita, která našla praktické uplatnění v odstraňování vad a hlasivek atrofie. Injekce autologního kolagenu byla poprvé použita v roce 1995. Metody za předpokladu zachování primární struktury autologních kolagenových vláken, včetně enzymaticky katalyzovaná intramolekulární zesítění. Skutečnost, že přírodní kolagenová vlákna jsou odolnější proti degradaci proteázami než rekonstituovaných kolagenových telopeptidů, kde řez. Integrita telopeptidů důležité pro kvarterní strukturu kolagenových vláken a zesítění mezi sousedícími molekulami kolagenu. Na rozdíl od přípravků bovinního kolagenu, autologní kolagen nezpůsobuje imunitní reakce u příjemce, ale není dostatečně účinný jako výplně činidlo. Trvalé korekce může být dosaženo v důsledku místní produkce autologní transplantace kolagenu fibroblasty. Šetření však efektivity transplantace autologních fibroblastů v klinice odhalilo některé obtíže. V časném období po transplantaci fibroblastů klinického účinku byla slabší ve srovnání se, že po podání hovězího kolagenu. Když kultivované autologní fibroblasty nelze vyloučit možnost transformace normálních fibroblastů v normální, tak zvané myofibroblasty, odpovědné za vývoj fibrózy a jizev, jak dokládá snížení kolagenového gelu, vzhledem ke zvláštní interakci fibroblastů a kolagenových fibril. Dále, po sériové pasážování fibroblasty in vitro ztrácejí svou schopnost syntetizovat proteiny extracelulární matrix.

Nicméně, v současné době experimentální techniku dokonalosti kultivace lidských autologních fibroblastů, který odstraňuje výše uvedené nevýhody a vede k onkogenní transformace normálních fibroblastů. Autologní fibroblasty získané touto metodou se používají k vyplnění defektů měkkých tkání tváře. Ve studii H. Kellera a spoluautorů (2000) bylo léčeno 20 pacientů ve věku 37 až 61 let s vráskami a atrofickými jizvy. Kožní biopsie (4 mm) BTE oblast jsme transportovat do laboratoře v sterilních zkumavek, obsahujících 10 ml kultivačního média (Dulbecco antibiotikum mikoseptikom, pyruvát a fetálního bovinního séra). Materiál byl umístěn uvnitř 3-5 kultivačních misek o průměru 60 mm a inkubován v termostatu s atmosférou obsahující 5% CO2. Po 1 týdnu byly buňky odstraněny z misky trypsinizací a umístěny do 25 cm2 lahviček. Buňky jsou podávány pacientům v množství 4 x 107. Významnou a dlouhotrvající klinický účinek byl pozorován u pacientů s korekcí nasolabiálních záhyby, a u pacientů s jizvami po 7 a 12 měsíců po třetí transplantaci autologních fibroblastů. Podle průtokové cytometrie produkovaly kultivované fibroblasty velké množství kolagenu typu I. Studie in vitro ukazují normální kontraktilitu injekčních fibroblastů. Dva měsíce po subkutánním podání kultivovaných fibroblastů v dávce 4 x 107 buněk nebyly detekovány nahé myši. Injekční fibroblasty u pacientů nezpůsobily tvorbu jizev a difuzní fibrózu. Podle autora jsou implantované autologní fibroblasty schopné neustále produkovat kolagen, který poskytne kosmetický omlazující účinek. V tomto případě, protože životnost diferencovaných buněk je omezená, jsou fibroblasty odebrané od mladého pacienta efektivnější než ty, které byly získány u starších lidí. Do budoucna se předpokládá možnost kryokonzervace kultivovaných fibroblastů odebraných z mladého dárce mají být transplantovány později starší pacient ze svých mladých buněk. Závěrem lze říci, že není zcela správné závěr, že autologní fibroblasty, že jejich funkční bezpečnost jsou ideální pro korekci obličeje defektů měkkých tkání. V tomto případě se autor sám poukazuje na to, že v průběhu vyšetřování se objevily i některé problematické situace v souvislosti s použitím autologní fibroblastů kolagenu systému. Klinický účinek byl často slabší než při použití kolagenu skotu, což způsobilo zklamání u pacientů.

Obecně platí, že údaje z literatury o vyhlídkách na klinické využití mezenchymálních kmenových buněk jsou zcela optimistické. Pokouší se používat autologní multipotentní mezenchymální progenitorové buňky kostní dřeně pro léčení degenerativních kloubních lézí. První klinické testy kultivovaných mezenchymálních progenitorových buněk při léčbě komplexních zlomenin kostí jsou prováděny. Autologní a alogenní mesenchymální buňky stromatu kostní dřeně kostí použité ke generování chrupavkové tkáně pro transplantaci do opravy defektů kloubní chrupavky v důsledku traumatu, nebo autoimunitních léze. Praktikované metody klinické aplikace multipotentních mezenchymových progenitorových buněk k odstranění kostních defektů u dětí s těžkou pokroku osteogenesis způsobené mutacemi genu kolagenu typu I. Po mieloabelyatsii děti-příjemců transplantované kostní dřeně od HLA-kompatibilní zdravého dárce jako nefrakcionovaného kostní dřeně může obsahovat dostatečné množství mezenchymálních kmenových buněk na doplnění těžkou kostního defektu. Po transplantaci, alogenní kostní dřeně tyto děti představovaly významné histologické změny v trabekulární kosti, zvýšení rychlosti růstu a snížení výskytu zlomenin kostí. V některých případech se pozitivní klinický výsledek dosáhne transplantací úzce příbuzné alogenní kostní dřeně a osteoblastů. Pro léčení vrozené křehkosti kostí v důsledku nerovnováhy osteoblastů a osteoklastů v kostní tkáni, a použité transplantace MSC. Obnova tvorby kosti v tomto případě je dosažena kvůli chimerizaci skupiny kmenových a progenitorových stromálních buněk v kostním tkání pacientů.

Metody genetické modifikace dárcovských mezenchymálních kmenových buněk se zlepšují za účelem opravy genetických defektů stromálních tkání. Předpokládá se, že mesenchymální progenitorové buňky brzy bude použit v neurologii pro směrová chimerization mozkovými buňkami a vytvořit fond zdravých buněk, které jsou schopné generovat deficitní enzym nebo faktor zodpovědný za klinické projevy onemocnění. Transplantace mezenchymálních kmenových buněk může být použit k obnovení stroma kostní dřeně u pacientů s nádorovým onemocněním po radioterapii a chemoterapii, a v kombinaci s buňkami kostní dřeně - pro obnovu krvetvorby. Vývoj substituční terapie zaměřené na odstranění vady pohybového systému pomocí MSCs podporovat inženýrství v biomateriálů provedení matrice nebo biomimics tvořících kostry obývat potomstvo mezenchymálních kmenových buněk.

Zdroje mezenchymálních kmenových buněk

Hlavním zdrojem mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně hematopoetických kmenových buněk, které u savců je neustále diferencovat do krevních buněk a imunitního systému, vzhledem k tomu, mesenchymální kmenové buňky prezentovány malé populace stromálních buněk podobných fibroblastům kostní dřeně a pomáhají udržovat nediferencovaného stavu krvetvorných kmenových buněk. Za určitých podmínek, mesenchymální kmenové buňky diferencují na buňky chrupavky a kosti. Při naneseny na kultivačním médiu v nízké hustotě na výsadbu stromatu mononukleárních buněk kostní dřeně tvořit kolonie adherentních buněk, které ve skutečnosti jsou fibroblastové multipotentní mesenchymální prekurzorové buňky. Někteří autoři se domnívají, že kostní dřeň uloženy nepřidělené mesenchymální kmenové buňky, které, díky schopnosti samoobnovení a vysoká diferenciace možné, poskytnout všechny tkáně těla předchůdců mesenchymálních stromálních buněk po celou dobu života organismu savců.

Buňka stromatu kostní dřeně prvky tvoří řetězec, který vyplňuje prostor mezi sinusoid a kostní tkáně. Obsah dormantnyh MSC v dospělé kostní dřeně, je srovnatelný s počtem krvetvorných buněk a nepřesahuje 0.01-0.001%. Mesenchymální kmenové buňky izolované z kostní dřeně a nepodrobené kultivaci jsou zbaveny adhezivních molekul. Takové MSC neexprimují CD34, ICAM, VCAM, typy kolagenu I a III, CD44 a CD29. Z tohoto důvodu, v in vitro mesenchymální kmenové buňky, které nejsou upevněny na kultivační nádoby, a pokročilejší progenitorových odvozené mesenchymální kmenové buňky, jsou tvořeny komponenty cytoskeletu a receptoru aparát buněčných adhezních molekul. Stromální buňky s CD34 fenotypem nalezena i v periferní krve, kostní dřeně, i když jsou mnohem menší, než jsou mononukleární buňky CD34-pozitivní. Izolované z krve a přenese se do kultury buněk CD34, připevněných k podkladu a tvoří kolonie fibroblastu-podobné buňky.

Je známo, že v embryonálním období stromální báze všech orgánů a tkání savců a lidí vzniká ze společného fondu mezenchymálních kmenových buněk před a ve fázi organogeneze. Proto se věří, že ve zralém těle by měla být většina mezenchymálních kmenových buněk v spojivové a kostní tkáni. Bylo zjištěno, že většina buněčných prvků stromy uvolněných spojivových a kostních tkání je reprezentována spáchanými progenitorovými buňkami, které si však zachovávají schopnost proliferovat a vytvářet klony in vitro. Se zavedením takových buněk do celkového průtoku krve se více než 20% mezenchymálních progenitorových buněk implantuje mezi stromální prvky hematopoetického tkáně a parenchymálních orgánů.

Potenciální zdroj mezenchymálních kmenových buněk je tuková tkáň, mezi nimiž angažovaných kmenových buněk nalezených v různém stupni adipocyty progenitorů. Nejméně zralé progenitorové prvky tukové tkáně - stromatu-cévní buňky, který je stejný jako multipotentní mesenchymální předci kostní dřeně mohou diferencovat na adipocyty působením glukokortikoidů, růstového faktoru podobného inzulínu a inzulínu. V kultuře stromálních vaskulárních buněk diferenciace na adipocyty a chondrocyty a tukové tkáně kostní buňky dřeně odvozené tvořící adipocytů a osteoblastů.

Ve svalech byly také nalezeny stromální kmenové zdroje. Kultivační primárních buněk izolované z lidského kosterního svalu, ukazuje, ve tvaru hvězdy buňky a mnohojaderné myotub. V přítomnosti hvězdicových buněk koňského séra proliferovat in vitro bez známek cytodiferenciační a po přidání dexamethasonu do kultivačního média diferenciace je charakteristický vzhled buněčných prvků buněk s fenotypem kosterního a hladkého svalu, kosti, chrupavky, a tukové tkáně. V důsledku toho, v lidské svalové tkáni reprezentován jako potvrzené a nepotvrzené multipotentní mezenchymálních kmenových buněk. Je ukázáno, že populace kmenových buněk přítomných v kosterním svalu pochází z nepřidělené multipotentních kostní dřeně mesenchymální progenitorové buňky, a liší se od myogenních satelitních buněk.

V myokardu novorozených potkanů také zjištěno, adhezivní hvězdicových buněk, vhodných pro diferenciaci potenciálu multipotentních mezenchymových progenitorových buněk, jako pod vlivem dexamethasonu rozlišují na adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, buňky hladkého svalstva, myotubulů kosterních svalů a srdečních myocytů. Bylo prokázáno, že buňky hladkého svalstva cév (pericyty) jsou odvozeny multipotentní nediferencované perivaskulární mesenchymální prekurzorové buňky. V kultuře perivaskulárních mezenchymálních kmenových buněk exprimují a-aktin hladkého svalstva a krevních destiček odvozený růstový faktor receptor a jsou schopny odlišit alespoň buněk hladkého svalstva.

Zvláštní místo, pokud jde o kmenových zásob se chrupavky, velmi nízká reparační potenciál, který se předpokládá, že je v důsledku nedostatku multipotentních mesenchymální progenitorové buňky nebo diferenciaci a růstových faktorů. Předpokládá se, že multipotentní mezenchymální progenitorové buňky, předem dárcovské pro chondro- a osteogenezi, vstupují do chrupavkové tkáně z jiných zdrojů tkáně.

Nezajišťuje ani vznik tkáně a podmínky pro pěstování mezenchymálních progenitorových buněk v šlachách. Ekspermentalnye pozorování naznačují, že v raných postnatálních králík Achillovy šlachy buněk v primárních kulturách v prvním průchodu a udržet expresi kolagenu typu I a dekorinu, ale na další kultivaci ztrácejí tenotsitov diferenciačních markerů.

Je třeba poznamenat, že odpověď na otázku, zda skutečně lokalizované v různých tkáních multipotentních mesenchymální progenitorové buňky jsou vždy přítomny v jejich stromatu, nebo tkáně bazén z mezenchymálních kmenových buněk je kompenzován migrací stromální kmenové buňky kostní dřeně, to je ještě čeká.

Také může být kostní dřeň a jiné mezenchymální tkáně zóny dospělý jiný zdroj MSC pupečníkové krve. Bylo prokázáno, že pupečníková žíla krev obsahuje buňky, které mají podobné morfologické a antigenní vlastnosti s multipotentních mesenchymální progenitorové buňky jsou schopné adheze a není horší než multipotentní mesenchymální progenitorové buňky kostní dřeně původu derivací potenciál. V kulturách mezenchymálních kmenových buněk z pupečníkové krve detekovaných 5-10% nepřidělené multipotentních mezenchymálních kmenových buněk. Ukázalo se, že jejich počet se v pupečníkové krvi je nepřímo úměrná stáří plodu, což je nepřímý důkaz o migraci z multipotentních mezenchymových progenitorových buněk do různých tkání během vývoje plodu. Tam byly první informace o klinickém použití mezenchymálních kmenových buněk izolovaných z pupečníkové krve, stejně jako embryonální odvozený biologický materiál, který je založen na známém schopnosti plodových kmenových buněk integrovat a funkce prizhivlyatsya v orgánech a tkáních systémy příjemců pro dospělé.

Hledání nových zdrojů mezenchymálních kmenových buněk

Využití mezenchymálních kmenových buněk embryonálního původu, jakož i jiných buněk plodu, vytváří řadu etických, právních, právních a regulačních otázek. Proto pokračuje hledání extraembryonálního buněčného dárcovského materiálu. Pokus byl neúspěšný klinická aplikace fibroblastů z lidské kůže, ale byla stanovena nejen vysokou finanční možnosti technologie, ale také rychlé diferenciaci fibrocytů do fibroblastů, které mají podstatně nižší potenciální proliferaci a produkci omezený počet růstových faktorů. Další pokrok v oblasti biologie a MSC jsou multipotentní mesenchymální progenitorové buňky kostní dřeně dovoleno, aby vypracovala strategii pro klinické použití autologních mezenchymálních kmenových buněk. Technologie jejich izolace, kultivace, množení ex vivo, a řízené diferenciaci nutné, v první řadě, studium spektra molekulárních markerů MSC. Jejich analýza ukázala, že v primárních kulturách lidské kostní tkáně, existuje několik typů multipotentních mesenchymální progenitorové buňky. Proosteoblastov fenotyp možné zjistit u buněk exprimujících progenitorových buněk markeru STRO-1 stromatu, ale nenesou marker osteoblastické - alkalická fosfatáza. Tyto buňky se vyznačují nízkou schopnost tvořit mineralizované kostní matrix, jakož i nedostatečné exprese osteopontin a parathyroidního hormonu. Deriváty STRO-1 pozitivních buněk, které neexprimují alkalickou fosfatázu, průběžnou a plně diferencované osteoblastů. Bylo zjištěno, že tyto buněčné elementy klonovaných linií STRO-1 pozitivních buněk lidské trabekulární kosti jsou schopné diferenciace do zralých osteocyty a adipocytů. Směr diferenciace těchto buněk je závislá na expozici polynenasycených mastných kyselin, prozánětlivých cytokinů - IL-1b a tumor nekrotizujícího faktoru a (TNF-a), stejně jako protizánětlivé a imunosupresivní TGF-B.

Později bylo zjištěno, že multipotentní mesenchymální prekurzorové buňky postrádají specifické pouze jim vlastní fenotyp, ale vyjadřují komplexní znaky, charakteristické pro mesenchymální, endoteliální, epiteliálních a svalových buněk v nepřítomnosti exprese hematopoetických buněčných immunophenotypic antigeny - CD45, CD34 a CD14. Kromě toho, mesenchymální kmenové buňky a konstitutivně produkují induktibilní hematopoetických a ne-hematopoetických růstových faktorů, interleukiny, chemokiny, a, a na multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk exprimovány receptory pro některé růstové faktory a cytokiny. Mezi buňky stromatu základy lidského těla nalezeno dormantnye nebo klidové buňky s imunofenotypu, téměř totožné s antigenní profil surových 5-fluorouracilu multipotentních mezenchymových progenitorových buněk - ty, a další buňky exprimují CD117, označení „pro dospělé“ kmenové buňky.

Takže buněčný marker jedinečný pro mezenchymální kmenové buňky dosud nebyl stanoven. Předpokládá se, že klidové buňky jsou nezávazné populace multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk, protože neexprimují markery buněčné angažovaných osteoartritidě (SKFČR-1) nebo adipogeneze (PPAR-y-2). Prodloužené vystavení klidové pomalu proliferující buňky s fetálním telecím sérem výsledky v tvorbě terminálně diferencovaných angažovaných prekurzorů, které se vyznačují rychlým růstem. Klonální růst těchto kmenových mezenchymálních buněk je podporován FGF2. Zdá se, že genom stromatu odvozené z kmenových buněk „zavřeno“ těsný natolik byla označena o nepřítomnosti spontánní diferenciace MSC -. Bez zvláštních podmínek pro spáchání ani nejsou převedeny do buněk mezenchymální série.

Pro studium struktury populace odvozenou mezenchymálních kmenových buněk jsou prohledávány diferenciace proteinové markery na buněčné linie stromálních a primárních kultur. V klonální kolonie testu buněk kostní dřeně in vitro zjištěno, že když je podrobena primárních kulturách EGF zvyšuje průměrná velikost kolonií a snižuje klonální expresi alkalické fosfatázy, zatímco přidání hydrokortizonu aktivuje expresi alkalické fosfatázy, která je markerem osteogenní diferenciace orientace MSC. Monoklonální protilátky proti Stro-1 bylo možné oddělit a studie populace STRO-1-pozitivních adherentních buněk v heterogenním systému Dexter kultur. Spektrum cytokinů regulovat nejen proliferace a diferenciace hematopoetických a lymfoidních buněk, ale také se podílejí na formování, formování a resorpce kosterní tkáně para-, automatického a endokrinních mechanismů. Receptory zprostředkované uvolňování sekundárních poslů, jako je cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfátu a Ca2 + se také používají pro markerový analýzu různých kategorií stromální tkáně buněk exprimující relevantní receptory. Použití monoklonálních protilátek jako markery mohou navázat stromatu lymfatických orgánů patří retikulární buněk pro T a B-závislých zón.

Na nějakou dobu pokračovalo vědecké debaty kolem otázku možnosti vzniku MSC z krvetvorných buněk. Opravdu, když explantace suspenze buněk kostní dřeně v jednovrstevné kultuře, v níž jednotlivé kolonie růst fibroblastů. Nicméně, bylo prokázáno, že přítomnost prekurzorů fibroblastů kolonií a různých zárodků diferenciaci krvetvorné tkáně jako součást kostní dřeně není důkazem jejich společný původ krvetvorných buněk. Pomocí diskriminační analýzy kmenových buněk kostní dřeně zjištěno, že mikroprostředí na heterotopní transplantaci krvetvorných buněk kostní dřeně se přenáší, což svědčí o existenci, v kostní dřeni nezávislé histogenetického MSC populace hematopoetických buněk.

Navíc selektivní metoda klonování odhalený v jednovrstvých kulturách stromální buňky kostní dřeně o nové kategorie prekurzorových buněk pro stanovení jejich počtu, studovat jejich vlastnosti, proliferativní a diferenciační potenciál. Bylo zjištěno, že podobné fibroblastům stromální buňky in vitro proliferaci a tvoří diploidní kolonií, které při reverzní transplantace do těla zajišťující tvorbu nových krevních krvetvorných orgánů. Výsledky studií jednotlivých klonů naznačují, že je zde populace buněk v jejich proliferativní a diferenciační potenciál schopných nároku roli kmenových buněk stromální tkáně, Gistogeneticheskaja nezávislé na hematopoetických kmenových buněk v stromálních progenitorových buněk. Buňky z této populace se vyznačují soběstačného růstu progenitorových a diferenciované buňky prvky kosti, chrupavky a kostní dřeně retikulární tkáně.

Velmi zajímavé je, jsou-li výsledky studií Chailakhyan R. A kol (1997 - 2001), které byly kultivovány kostní dřeně stromatu odvozené progenitorové buňky králíci, morčata, myši a z a-MEM kultivačním médiu doplněném fetálním telecím sérem. Explantace autoři provádí počáteční hustotě 2-4 x 103 buněk dřeně na 1 cm2. Jak je použito dávkovači homologní nebo heterologní inaktivován ozářením buněk kostní dřeně v zádržné působení podavače dávky, ale zcela blokována proliferace. Dvoutýdenní primární diskrétní kolonie byly trypsinizovány fibroblasty k produkci monoklonálních kmenů. Evidence klonální původ kolonie byly získány za použití chromozomální markery ve směsných kulturách kostní dřeně samců a samic morčete, časosběrné snímání živých kultur, jakož i ve směsných kulturách kostní dřeně syngenních myší a CBA SVAT6T6. Transplantace suspenze čerstvě izolovaných buněk kostní dřeně pěstovaných in vitro nebo stromální fibroblasty pod ledvinové pouzdro bylo provedeno v ivalonovyh porézní nosné struktury nebo želatina, jakož i inaktivované králičí spongiózní kostní matrix. Transplantační klony do kosti krycí stehna morčete vyčištěné od měkkých tkání a periostu, snížit epifýzy a důkladně praní jejich kostní dřeň. Kost se rozřeže na fragmenty (3-5 mm), usušily a ozářily v dávce 60 Gy. Kost se umístí se vztahuje na jednotlivé kolonie fibroblasty a implantovány intramuskulárně. Pro intraperitoneální transplantaci stromálních fibroblastů, pěstovaných in vitro, jsme použili typy difúzní komory (V = 0,015 cm 3, h = 0, l mm) a D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Při studiu dynamiku růstu klonů kmenů Chailakhyan R. Et al (2001) zjistili, že jednotlivé buňky tvořící kolonie fibroblasty, jakož i jejich potomci mají velký proliferační potenciál. Od 10. Průchodu počet fibroblastů v některých kmenů byla 1,2-7,2 x 10 ⁹ buněk. V průběhu jejich vývoje vykonávaly až 31-34 duplikace buněk. Tak heterotopické transplantace kmenů dřeně odvozené z kostní tvořených stromatu prekurzorů několik desítek klonů vedlo k převodu mikroprostředí kostní dřeně a vzdělávání v novém transplantaci zóna hematopoetických orgánů. Autoři zvýšil na otázku, zda jednotlivé klony mohou tolerovat kostní dřeně mikroprostředí, stromální buňky, nebo to vyžaduje spolupráci několika různých klonogenní stromální progenitorových? A pokud budou jednotlivé klony moci přenášet mikroprostředí, ať už je plný všech tří zárodečných krve nebo různé klony zajistit tvorbu krvetvorné mikroprostředí pro různé choroboplodné zárodky? K řešení těchto problémů byla vyvinuta technologie pěstování stromálních progenitorových buněk do kolagenového gelu, který vám umožní fotografovat z povrchu fibroblastů kultivovaných kolonií za účelem následného heterotopické transplantaci. Jednotlivé klony stromální fibroblasty, buňky kostní dřeně vypěstované z CBA myších a morčatech, řezané spolu s fragmentem gelového povlaku a transplantované heterotopické - pod kapsle ledvin syngenních myší nebo autologních břicho svalu morčat. Při transplantaci do svalu byly kolonie na gelu umístěny v kostních krytech.

Zjistili jsme, že 50-90 dnů po transplantaci kostní dřeně fibroblastů kolonie v 20% případů byly pozorovány ve vývoji transplantace oblasti kostí nebo kostní a krvetvorné tkáně. V 5% příjemců, vytvořené kapsy kosti, které mají dutinu naplněnou kostní dřeni. Uvnitř kostních válců taková ložiska mají zaoblený tvar a kapsli vyrobenou z kostní tkáně, s osteocyty a dobře vyvinuté osteoblastické vrstvu. Dutina Kostní dřeň obsahuje retikulární tkanina s myeloidních a erytroidních buněk, proporce, které se neliší od toho v normální kostní dřeni. Štěp ledvina byla typická medulární těleso tvořeno nativním transplantací kostní dřeně, přičemž kost kapsle se vztahuje pouze medulární dutiny z ledvin kapsle. Krvetvorné tkáně zahrnuty myeloidní, megakaryocytů a erytroidní prvky. Stromatu dřeňového kanálu byla dutiny dobře vyvinuté a obsahuje typický systém tukových buněk. Zároveň se v oblasti transplantace nějakého kolonií kostí bez známek krvetvorby bylo zjištěno pod kapsli ledvin. Studium proliferativní a diferenciace účinnosti jednotlivých klonů se pokračovalo na kmenech monoklonálních králík kostní dřeně, buňky se resuspendují v kultivačním médiu a v samostatném ivalonovoy houbou o hmotnosti 1-2 mg zastrčenou do kapsle ledvin dárce králičí kostní dřeně. Tyto buňky byly podrobeny Autotransplantace 21 monoklonální napětí. Výsledky jsou vzata v úvahu za 2-3 měsíce. Autoři zjistili, že 14% z transplantovaných kostní dřeně monoklonální kmenů tvarové těleso složené z kostí a kostní dřeně dutiny naplněné krvetvorných buněk. V 33% případů transplantované kmenů vytvořena kompaktní kost s různými dutinami velikosti ostootsitami zazděny osteoblastů a rozvinutých vrstvou. V některých případech, houby transplantované klony vyvinut retikulum bez kosti nebo krvetvorných buněk. Někdy retikulární formace stroma nastal s dobře vybudované síti sinusoid, ale není naplněna krvetvorných buněk. Takto získané výsledky byly podobné výsledkům získaným transplantací klonů na kolagenového gelu. Nicméně, v případě, že transplantace klony pěstované na substrátu vedla k tvorbě tkáně dřeně je 5% kosti - 15% a retikulární tkanina - v 80% případů, transplantace monoklonální kmenů tvorbu buněk kostní dřeně byla pozorována u 14% případů kosti - 53% a retikulární - v 53% případů. Podle autorů, znamená to, že podmínky pro provádění proliferačních a diferenciačních potenciálů stromálních fibroblastů při transplantaci na porézní lešení byly optimálnější než jejich transplantací kostní a vztahuje se na kolagenu substrát. Není vyloučeno, že použití pokročilejších metod pěstování a transplantaci klonů zpětné vazby může zlepšit podmínky pro provádění jejích klonů diferenciačních potenciály a změnit tyto vztahy. Tak či onak, ale hlavní hodnota výzkumu spočívá v tom, že některé z těchto klonů se buňky stromatu, které jsou schopné tvořit kostní tkáně a zároveň zajistit stromální hematopoetických mikroprostředí hned tři klíčky krve kostní dřeně: erytroidní, myeloidní a megakaryocytů, vytváří dostatečně velké opěrné body krvetvorné tkáně a některé kostní hmoty.

Dále autoři zabývá otázkou kapacity pro tyto typy buněčné diferenciace jednotlivých klonogenních stromálních progenitorových buněk v uzavřeném systému difúzních komor. Kromě toho, bylo třeba zjistit, zda jednotlivé klony pluripotentních expozice nebo displejem pro rozlišování potenciál vyžaduje kooperativní interakci několika klonů s pevným znamení cytodiferenciační, odlišný poměr, který určuje přednostní tvorbu kostí, chrupavky nebo retikulární. Kombinací dvou metodologické přístupy - monoklonální izoluje stromálních progenitorových buněk kostní a transplantace je do difúzních komor, Chailakhyan R. Et al (2001), získané výsledky, které nemá přístup pochopení konstrukčního uspořádání podpůrné vazivové tkáně kostní dřeně. Transplantační monoklonální kmeny stromálních progenitorových buněk na O článků typu vedla k tvorbě jak kostní a chrupavkové tkáně, což ukazuje na schopnost potomstva jednoho stromálních buněk tvořících kolonie současně tvořící kost a chrupavku. Předpoklad, že kostní a chrupavková tkáň pochází z běžné stromální progenitorové buňky, byla opakovaně opakovaně vyjádřena. Tato hypotéza však neměla správné experimentální potvrzení. Kosti a chrupavky v difuzních komor bylo nezbytné prokázat existenci kmenových buněk zahrnují kostní dřeně stromální prekurzorové buňky jsou společné pro tyto dva typy tkání.

Pak se 29 klonální kmeny druhý a třetí pasáže, primární kultury odvozené z kostní dřeně králíka byly umístěny do difúzní komory a intraperitoneálně homologní zvíře. Studie ukázaly, že 45% monoklonálních kmenů kostní dřeně má osteogenní účinky. Výjimečně retikulární tkaniny obsahoval komory 9, ale s kostí a chrupavkové tkáně je stále přítomna v komorách 13, což představuje 76% všech kmenů. V komorách typu O, kde bylo možné diferenciaci jak pro kosti, tak pro chrupavkovou tkáň, bylo studováno 16 kmenů. Ve čtyřech komorách (25%) se vytvořila kostní i chrupavková tkáň. Je třeba ještě jednou poznamenat, že studie Chailakhyan R. Et al (2001) Jednotlivé progenitorové buňky prošly buněk kmene, jejichž součástí jsou z 31 až 34 zdvojení, a jejich potomstvo je 0.9-2.0 x 10 ⁹ buněk. Počet mitóz, kterým byly exponovány prekurzorové buňky polyklonálních kmenů, byl prakticky stejný jako počet buněk monoklonálních kmenů. Tudíž míra vývoje polyklonálních kmenů, a to zejména v první fázi svého vzniku, do značné míry závisí na počtu kolonií používaných k iniciaci kmenů. Diploidní kmeny lidských embryonálních fibroblastů (WI-38) pro 12-15 reklonirovanii th zdvojnásobení hladiny také vytvořen kolonie s odlišným průměrem, a v jejich obsahu buněk. Velké kolonie obsahující více než 103 buněk byly pouze 5-10%. S nárůstem počtu divizí se snížilo procento velkých kolonií. Mono- a polyklonální kmeny stromatu kostní dřeně fibroblastové udržel diploidní chromozomů po 20 nebo více zdvojení a tendence vývoje byla srovnatelná s dynamikou diploidních kmenů embryonální fibroblasty. Analýza diferenciace potenciálu specifických stromatu kostní dřeně, progenitorových buněk monoklonálními kmeny transplantací provedených v difuzních komor, ukázala, že polovina z nich v osteoblasty. Velké kolonie představovaly 10% jejich celkového počtu. V důsledku toho počet buněk tvořících osteogenní kolonie odpovídal přibližně 5% jejich celkové populace. V celkové hmotnosti osteogenních progenitorových buněk identifikovaných autory existovaly buňky schopné současně vytvářet kostní a chrupavkovou tkáň. Poprvé se zjistilo, že pro tyto dva typy tkání v dospělém organismu je společné prekurzorové buňky: 25% testovaných klonů byly vytvořeny podobnými buňkami, a jejich počet v obecné populaci progenitorových buněk nebyl menší než 2,5%.

Tak, heterotopická transplantace fibroblastů kostní dřeně jednotlivé klony otevřely nové aspekty strukturní organizaci populace mesenchymální progenitorové buňky. Nalezeno stromální progenitorové buňky, které jsou schopné přenášet specifické mikroprostředí okamžitě pro všechny krvetvorným stonku, které číslo ze zkoumaných klonů větší na různých modelech je od 5 do 15% (0,5-1,5% z celkového počtu progenitorových buněk detekována). Spolu s klony, přenášení kompletní mikroprostředí kostní dřeně, existuje progenitorové buňky, deterministické pouze tvorby kostní tkáně, který se tvoří, když převedena do otevřeného systému, kostí, který nepodporuje vývoj krvetvorby. Jejich počet z celkového počtu progenitorových buněk je 1,5-3%. Některé z těchto buněk mohou tvořit kostní tkáň s omezenou dobou sebeúdržby. V důsledku toho je populace stromálních progenitorových buněk heterogenní ve svém diferenciačním potenciálu. Mezi nimi existuje kategorie buněk, tvrdí roli stromálních kmenových buněk, které jsou schopné diferenciace na všech třech dimenzích spojených stromatu kostní dřeně tkáně, tvořící kostí, chrupavek a retikulární tkáně. Tyto údaje nám umožňují doufat, že s pomocí různých buněčných markerů bude možné určit příspěvek každého typu buněk stromatu v mikroprostředí konkrétní organizaci a podporují krvetvorbu v Dexter kulturách.

Vlastnosti mezenchymálních kmenových buněk

V posledních letech se zjistilo, že ve stacionárních kulturách kostní dřeně mezenchymální multipotentní progenitorové buňky jsou málo populace malých agranulární buněk (RS-1) buňkách, vyznačující se tím, nízkou schopnost kolonizace a absence exprese Ki-67 antigenu specifického pro proliferujících buněk. Antigenní parametry dormantnyh RS-1 buňky se liší od spektra spáchaných antigenů rychle proliferujících stromatu progenitorové buňky. Bylo zjištěno, že vysoká míra proliferace angažovaných progenitorových buněk byla pozorována pouze v přítomnosti buněk, RS-1. Na druhé straně, RS-1 buňky zvyšuje rychlost růstu pod vlivem faktorů sekretovaných nejzralejším odvozených multipotentní mesenchymální progenitorové buňky. Zdá se, že buňky, RS-1 jsou podmnožinou nesvěřené MSC schopné recyklace. V odolné proti 5-fluorouracilu stromální progenitorových buněk kostní dřeně, vyznačující se nízkým obsahem RNA a vysoké úrovně exprese genu ornitindekarboxyláza vitro - markeru neproliferující buňky.

Intenzivní chov stromatu progenitorové buňky začíná po jejich uchycení na podkladu. Pokud je to vyjádřeno markerem profil špatně diferencovaných buněk: SH2 (TGF-P receptor (3), SH3 (doména signalizační protein), typy kolagenu I a III, fibronektin, adhezní receptor VCAM-1 (CD106) a ICAM (CD54), cadherin-11 , CD44, CD71 (transferinový receptor), CD90, CD120a a CD124, ale bez exprese charakteristických markery hematopoetických kmenových buněk (CD34, CD14, CD45). Klonální růst umožňuje opakovaně pasážovány mezenchymálních kmenových buněk pro produkci kultury mnoha geneticky homogenní stromální progenitorových pluripotentních buňky. Cerea 2-3 průchod jejich počet dosáhne 50-300 milionů. V kultuře dostatečnou hustotou po zastavení proliferace stromální progenitorových buněk, na rozdíl od krvetvorné tkáně fibroblasty diferenciaci na adipocyty, myocytů, buněk chrupavky a kostní tkáně. Kombinace regulačních signálů tři diferenciačních zahrnující 1-methyl-izobutilksantin (induktor tvorby intracelulárního cAMP), dexamethason (inhibitor fosfolipázy a a C) a indomethacin (inhibitor cyklooxygenázy, snížení aktivity tromboxanu a) se otáčí adipocyty a 95% mesenchymální progenitorové buňky. Tvorba adipocytů z nezralých stromálních buněk potvrdila exprese lipoproteinové lipázy genu, histochemické identifikaci apolipoproteinů a peroxysomal receptory. Buňky stejného klonu ovlivněné TGF-B v médiu bez séra vytváří homogenní populaci chondrocytů. Vícevrstvý buněčné kultury z chrupavky extracelulární matrix, se vyznačuje tím, vyvinut sestávající z proteoglykanu a kolagenu typu II. Živné médium s 10% fetálního séra efekt diferenciace signálů komplex sestávající z b-glycerofosfát (donátor anorganického fosfátu), kyselina askorbová a dexamethason, ve stejných kultura stromálních progenitorových progenitorových buněk vede k tvorbě buněčných agregátů. V těchto buňkách, dochází k postupnému nárůstu aktivity hladin alkalické fosfatázy a osteopontinu ukazuje tvorbu mineralizaci kostí, které buňky potvrdil postupný nárůst intracelulárního vápníku.

Podle některých schopnost mezenchymálních kmenových buněk na neurčitou dobu rozdělit a rozmnožování různých typů mezenchymálních linií buněk v kombinaci s vysokým stupněm plasticity. Když jsou podávány do komor, nebo bílá hmota mezenchymálních kmenových buněk migrovat do parenchymu nervové tkáně a diferencovat do neuronů a gliových odvozené buněčné linie. Kromě toho, že je informace o MSC transdiferenciace v hematopoetických kmenových buněk in vitro a in vivo. Více hloubková analýza v některých studiích určených výjimečně vysoká tažnost MSC, která se projevuje v jejich schopnosti diferencovat do astrocytů, oligodendrocyty, neuronů, kardiomyocytů, buněk hladkého svalstva a buněk kosterního svalstva. V řadě studií transdifferentsirovochnogo potenciál MSC in vitro a in vivo zjištěno, že multipotentní mesenchymální prekurzorové buňky původu kostní dřeně diferencují do buněčných linií, které tvoří kost, chrupavka, svaly, nervy a tukové tkáně, stejně jako šlach a podpůrné vazivové tkáně, která podporuje krvetvorbu ,

Nicméně, v jiných studiích, žádné známky omezení pluripotentním genomu mezenchymálních kmenových buněk a nemohly být detekovány populace stromálních progenitorových buněk, ale pro kontrolu možných pluripotentní buňky stromatu byla zkoumána více než 200 MSC klony izolované z primární kultury. Drtivá většina klonů v in vitro udržel schopnost diferenciace do osteogenní, chondrogenní a adipogenní směry. Při vyloučení pravděpodobnost migrace buněk příjemce transplantací mezenchymálních kmenových buněk v rámci kapsle ledvin nebo v difúzních komor se zdálo, že stromální progenitorové buňky in situ udržet heterogenní fenotyp, což naznačuje, že neexistují restrikčního faktorů transplantaci zóna nebo nepřítomnost samotných pluripotentních MSC. Zároveň umožnila existenci vzácného druhu somatických pluripotentních kmenových buněk, které jsou společnými prekurzory kmenových buněk dospělých jedinců.

Na multi-, ale není pravda pluripotentní mesenchymální kmenové buňky představují jen velmi malou část z buněk kostní dřeně a jsou schopny, za určitých okolností, když jsou kultivovány in vitro proliferaci, aniž by přišel do diferenciace, o čemž svědčí jejich indukované linie nasazení buněk v kosti, chrupavky, tukové, svalové tkáně , stejně jako v tenocytech a stromálních prvcích podporujících hematopoézu. Typicky, kontinuální expozice v kultivačním médiu s fetálním telecím sérem vyvolává výstupní MSCs ve stromálních angažovaných progenitorových buněk, potomstvo, které podstoupí spontánní konečné diferenciaci. In vitro lze dosáhnout tvorby směrové osteoblastů přidáním do středotlakého klimatizace dexamethason, beta-glycerofosfát a askorbové kyseliny, přičemž kombinace diferenciace signalizuje dexametazon a inzulín vyvolává tvorbu adipocytů.

Bylo zjištěno, že před vstupem do fáze terminální diferenciace kostní dřeně MSC pro vytváření určitých podmínek kultivace nejprve diferencovat do podobných fibroblastům mezenchymálních kmenových buněk. Deriváty těchto buněk in vivo, jsou zapojeny do tvorby kostí, chrupavek, šlach, tukové a svalové tkáně, stejně jako nosné stromální krvetvorby. Mnozí autoři chápat pojem „multipotentní mesenchymální progenitorové buňky“, jak je vlastně MSC a angažovaní stromálních progenitorových buněk a kostní dřeně mezenchymálních tkání. Klonální analýza mezenchymálních multipotentních progenitorových buněk z kostní dřeně původu ukázalo, že o něco více než třetina z klonů diferencovaných v osteo-, hondro- a adipocytů, zatímco jiné klony buněk mají osteogenní potenciál a forma pouze hondro- a osteocyty. Tento klon multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk, jak je IUD-9, za vhodných podmínek mikroprostředí diferencovány do buněk s fenotypem a funkčních vlastností nejen osteoblastů, chondrocytů a adic potsitov ale stromální buňky, které podporují krvetvorbu. Izolované z fetálních buněk krysí kostní dřeně klon RCJ3.1 diferencované mesenchymální buňky různých fenotypů. Kombinovaným působením kyseliny askorbové, b-glycerofosfát, a dexamethasonu z buněčných elementů tohoto klonu se nejprve vytvoří mnohojaderné myocyty a potom postupně, adipocyty, chondrocyty a ostrůvky mineralizované kosti. Populace granulárních buněk z periostu z plodů potkanů odpovídá nepřidělené multipotentních mesenchymálních kmenových buněk, jak je charakterizována nízkou rychlosti proliferace neexprimuje markery diferenciace, a diferencovány kultivačních podmínek pro vytvoření hondro-, osteo- a adipocytů a buněk hladkého svalstva.

Proto je třeba si uvědomit, že otázka plyuri- nebo multipotency genomu mezenchymálních kmenových buněk je stále otevřený, což následně ovlivňuje současně diferenciačního potenciálu stromálních progenitorových buněk, což je také úplně nainstalován.

Experimentálně prokázán a důležitou charakteristikou mezenchymálních kmenových buněk je jejich schopnost opustit tkáně výklenek a cirkulují v krevním oběhu. Chcete-li aktivovat genetického programu diferenciace těchto cirkulujících kmenových buněk se dostat k příslušné mikroprostředí. Je ukázáno, že při podávání systémově do krevního řečiště Mscs příjemců, nezralé buňky implantované v různých orgánech a tkáních, a pak diferencovány na krevních buněk, myocytů, adipocytů, chondrocytů, a fibroblasty. V důsledku toho, v oblastech místní tkáně dochází signálu regulační interakce potvrzené a nepotvrzené stromálních progenitorových buněk, jakož i mezi nimi a okolních zralých buněk. Předpokládá se, že diferenciace indukce se provádí parakrinní regulační faktory mesenchymálního původu a nemezenhimalnogo (růstové faktory, eikosanoidy, extracelulární matrix molekuly), které poskytují prostorové a časové vztahy v mikroprostředí multipotenciální mezenchymálních kmenových buněk. Proto je lokální poškození mezenchymální tkáně by měla vést k vytvoření mikroprostředí zón multipotentní mesenchymální prekurzorové buňky kvalitativně se liší od složitých regulačních signálů, intaktní tkáně, ve které se vyskytují fyziologické procesy místo reparační regenerace. Tento rozdíl je velmi důležité z hlediska znalostí v fenotypu buňky v normálním a indukované poškození mikroprostředí.

Podle myšlenek zde stojí mechanismy základního rozdílu dvou známých procesů - fyziologické regenerace a proliferace zánětů. První z nich končí obnovením specializované kompozice buněčné tkáně a její funkce, zatímco výsledkem proliferačního procesu je tvorba zralých prvků pojivové tkáně a ztráta funkce poškozené tkáňové zóny. Tak, vyvinout optimální aplikační programy multipotentní mesenchymální progenitorové buňky v regenerativní medicíně a plastové vyžaduje pečlivé studium zvláštností mikroprostředí ovlivňujících faktorů na diferenciaci MSC.

Závislost struktury prostoru kmenových buněk z buněčné para- a autokrinních regulátorů, jejichž exprese je modulována externích signálů, nemá jednu nade vší pochybnost. Mezi nejdůležitější funkcí regulačních faktorů jsou kontrolní MSC asymetrické rozdělení a expresi genů krok stanovení počet řádků závazek a počet buněčných dělení. Externí signály, na kterých závisí další vývoj MSC, jsou poskytovány jejich mikroprostředím. V nezralých MSC proliferovat dostatečně dlouhou dobu, při zachování schopnost diferenciace na adipocyty linie, myofibroblasty, hematogenní stromální tkáně, buněk chrupavky a kosti. Bylo zjištěno, že omezený počet obyvatel cirkulujících SB34-negativní buňky stromatu prvky z krevního oběhu se vrací do kostní dřeně vazivových tkání, je transformován do linky, kde CD34-pozitivních hematopoetických kmenových buněk. Tato pozorování naznačují, že recirkulace progenitorové buňky, mesenchymální v krevním řečišti tkáně poskytuje podporu pro rovnováhu stromálních kmenových buněk v různých orgánech mobilizací společný bazén stromálních buněk kostní dřeně nezralé kosti. Diferenciace MSC do buněk s více mezenchymálních fenotypy a jejich účast na opravy nebo regeneraci kostí, chrupavek, šlach a tukové tkáně in vivo prokázané adoptivní modelů přenosu u pokusných zvířat. Podle jiných autorů, vzdálený migrace MSC řečiště je v kombinaci s lokálním posunutí nebo korotkodistantnym multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk v tkáni na opravy chrupavky, regeneraci svalů a dalších redukčních reakcí.

Místní zásoby kmenových stromatu tkáně nadace hrají roli zdroj buněk ve fyziologickém regeneraci tkání procesů a jsou doplňovány vzdálených dopravních MSC jsou výdaje stromatu tkáně kmenových zdrojů. Nicméně, v případě potřeby nouzového mobilizaci buněčného reparativní kapacity, například více trauma, v opravných procesů regenerace podílí Mscs celý vlak, a obvod přes krevní řečiště přijímáni mesenchymální prekurzorové buňky z kostní dřeně.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk

Existují jisté paralely mezi procesy fyziologické regenerace tkání a jejich tvorbou v období nitroděložního vývoje. Embryogeneze člověka a savců, vytváření různých typů specializovaných buněk odvozených od ektoparaziticid, mezo a endodermal zárodečné vrstvy bazénu, ale s povinnou účastí mesenchyme. Volná buněčná síť embryonálních mezenchymálních tkání provádí řadu regulačních, metabolických, skeletálních a morfogenetických funkcí. Záložka provizorní těla se provádí až po kondenzační mesenchymu na úkor růstu klonogenní progenitorových buněk, které vytvářejí primární morfogenetické signály organogenezi. Stromální odvozen embryonální mezenchym vytvořit lešení provizorní těla a tvoří základ budoucí energoplasticheskogo zajistit díky růstu primárních cév a lymfatických cév. Jinými slovy, stromální prvky mikrocirkulační jednotky plodových orgánů se objevují před vytvořením jejich strukturně-funkčních jednotek. Kromě toho, aktivní migrace mesenchymálních buněk během organogeneze poskytuje prostorová orientace vyvíjí orgány v důsledku značení jejich hranice objemové omezení Homeotické HOX-tepov. Na stromálních dochází kostry a montáž konstrukčních a funkčních jednotek parenchymálních orgánů, které často obsahuje morphogenetically a funkčně velmi odlišné buňky. V důsledku toho, v embryogeneze mesenchymu jsou primární funkcí a provádí generování regulační signály aktivující regionální proliferaci a diferenciaci epitelových buněk kmenových buněk. Embryonální mesenchymu buňky produkují růstové faktory, jako jsou nohy, HGF-b, CSF, pro které existují odpovídající receptory na parenchymu progenitorových buněk. Zralé diferencované tkáně sítě dospělého organismu buněk stromatu také generuje signály, aby udržela životaschopnost a proliferaci progenitorových buněk nemezenhimalnogo původ. Nicméně, spektrum stromální regulační signály v postnatální ontogeneze další (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, Flt-3, LIF atd.) A je zaměřen na zajištění fyziologické regenerace nebo opravy poškozených zón tkáně. Kromě toho jsou spektrální charakteristiky stromálních regulačních faktorů v každém druhu tkáně a dokonce v rámci stejného orgánu odlišné. Zejména, hematopoézy a lymfopoéze na množení a diferenciaci hematopoetických a imunokompetentních buněk se vyskytuje pouze v určitých orgánech, ve které působí stromální mikroprostředí zajišťující podmínky pro zrání hematopoetických a lymfoidních buněk. Je na regulačních faktorů mikroprostředí závisí na schopnosti hematopoetických a lymfoidních buněk repopulovat tělo k proliferaci a zralé do jeho mikrostrukturních výklenky.

Mezi složky extracelulární matrix, které produkují multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk, je třeba poznamenat, fibronektin, laminin, kolagen a proteoglykany, stejně jako CD44 (hyaluronan a osteopontinu receptor) přijímající hlavní roli v organizaci mezibuněčné interakce a tvorbu extracelulární matrice v kostní dřeni a kosti , Je dokázáno, že mezenchymálních kostní dřeně, multipotentní buňky vytvořit redshestvenniki stromální mikroprostředí, poskytující induktivní a regulační signály nejen MSC, ale také hematopoetických prekurzorů a nemezenhimalnye kmenové buňky kostní dřeně. Je známo, že MSC zapojené do krvetvorby měřené na základě jejich schopnosti diferencovat na buňky stromatu, které podporují krvetvorbu, ve kterých je aktivní vedení MSK signál získané přímo z hematopoetických kmenových buněk. To je důvod, proč kultura síťových stromatu progenitorových buněk je základem pro krmení všech klonů krvetvorných buněk.

Ve zralém intenzity organismu hemodialýzy a lymfopoéze ve stavu dynamické rovnováhy s „výdajů“ zralých krevních buněk a buněk imunitního systému na periferii. Vzhledem k tomu, stromální buňky kostní dřeně a lymfatické orgány zřídka aktualizovány významné restrukturalizace stromální struktury nedochází v nich. Přinést systém dynamické rovnováhy, je možno s pomocí mechanického poškození na všechny orgány Hemo nebo lymfopoéze, což vede ke stejnému typu sekvenčních změn, které ovlivňují nejen a ne tolik krvetvorných nebo lymfoidních buněk, jako stromální struktury poškození orgánu. V procesu reparativní regenerace primárně vytvořené rámce stromatu, které se pak repopulating hematopoetických nebo buňky imunitního systému. Tento dlouho známý fakt dělá posttraumatický regenerace vhodný model pro studium stromální mikroprostředí krve-tvořit orgány. Zejména pro vyšetřování reparativní regenerace kostní dřeně se používá mechanické vyprazdňování medulární dutiny dlouhých kostí - kyretáž, který umožňuje rychle a účinně, aby krvetvorné tkáně ze stavu dynamické rovnováhy. Při studiu proces reparativní regenerace hematopoietických a stromatu kostní dřeně složek po mechanickém vyprázdnění dutiny kosti z morčat tibie zjištěno, že mezi indikátory regeneraci krvetvorných a stromálních buněk (počet hematopoetických buněk, koncentrace a množství stromálních progenitorových buněk) není žádný přímý vztah. Kromě toho bylo zjištěno, že zvýšení populace stromálních progenitorových buněk dochází k dřívějšímu datu po kyretáž, a samy o sobě stromální fibroblasty jsou fosfatazopolozhitelnymi, která je charakteristická pro osteogenní tkáně. Bylo také zjištěno, že kyretáž 3-5 dlouhé kosti vede k růstu populace buněk v kostní dřeni a neoperovaného kosti i ve slezině, která u morčat je jen lymfopoetický tělo.

Morfologické obrázek reparativní procesy v kostní dřeni kyuretirovannyh tibiální morčata obecně odpovídá údajům v literatuře získané při pokusech na zvířatech jiných druhů, dynamika změn, k nimž došlo po odstranění krvetvorné tkáně je stejný pro všechny druhy a rozdíl se týká pouze časové parametry . Morfologicky fáze Postup obnovení hematopoézy v dřeňové dutině se vyprázdní v následných procesech organizování tvorby krevní sraženiny hrubé vlákniny kosti, její resorpci, sinusoid a retikulární formace stromatu, které dále repopulating hematopoetické prvky. Počet krvetvorných progenitorových buněk v kostní dřeni regenerace tkání procesu se zvyšuje spolu zvýšení obsahu krvetvorných buněk.

Gerasimov Yu et al (2001), ve srovnání se změny v počtu hematopoetických buněk a množství stromálních buněčných prekurzorů v jednotlivých fázích procesu regenerace. Bylo zjištěno, že kvantitativní změny v buňkách kostní dřeně v kostní kyuretirovannoy zápasů dynamiky morfologických charakteristik regenerace. Redukce během prvních tří dnů obsahu buňky v regenerovat autorů atribut ztrátu hematopoetických buněk vzhledem k nepříznivým účinkům na mikroprostředí, což vytváří retikulární tkáň roste ve zbývající kostní dřeni v epifýzy a ve druhém případě za vzniku ohnisek osteoid a cévní poškození s kyretáž. 7-12 tý den zvyšování yaderosoderzhaschih buňky se shoduje s výskytem jednotlivých ložisek v myeloidních krvetvorných buněk stromatu proliferace zón. Na 20. Den jsou významné části regenerované kostní dřeně a dobře vyvinutými dutin, který je doprovázen výrazným zvýšením celkového počtu buněk. Nicméně počet hematopoetických prvků v tomto období je 68% kontrolní úrovně. To je v souladu s dříve publikovanými údaji, které prokazují, že počet buněk krvetvorné po kyretáž dosáhne normy pouze 35 až 40 dny po operaci.

V raném posttraumatickém období je hlavním buněčným zdrojem pro obnovu hemopoézy buněčné prvky uchované v kyretáži. V pozdějším pořadí jsou hlavním zdrojem regenerace hematopoetické tkáně kostní dřeně kmenové buňky, které znovu množí volné stromální zóny. U některých kategorií stromálních buněk (endoteliálních, retikulárních a osteogenních) zůstávají zdroje, které vytvářejí během rekonstrukce medulární dutiny, nevysvětlitelné. Výsledky Yu.V. Gerasimova et al (2001) ukazují, že ve zbývající kostní dřeně po koncentraci kyretáž buněk pro tvorbu kolonií fibroblastů výrazně vyšší než v normální kostní dřeni. Autoři se domnívají, že se kyretáž je intenzivnější selektivní eluce krvetvorných buněk ve srovnání s stromální tvořících kolonie buněk, které se podílejí na tvorbě vazivové tkáně a pevně spojené s jeho základní látky než krvetvorných buněk.

Dynamika změny v počtu buněk tvořících kolonie fibroblastů koreluje s intenzitou osteogeneze procesů následné trabekulární kostní resorpce a retikulární formace stromatu, které naplnit hematopoetických buněk. Většina stromálních progenitorových buněk tvoří hrubé vláknité kostní tkáně a retikulární stromu v uvedených regeneračních časech. Pro zlomenin stehenní kosti v podmínkách prodlouženého osteosyntézy v 5. Den v regenerační zóny zvyšuje koncentraci buněk a počet kolonie tvořících fibroblastů a tvorbu kosti v intenzivní jejich počet se zvyšuje o 6 krát. Je známo, že buňky kostní dřeně tvořící fibroblastové kolonie mají osteogenní vlastnosti. Počet stromálních progenitorových buněk se zvyšuje před kolonizací oblasti kortexované kostní dřeně hematopoetickými buňkami. To je v dobré shodě s důkazem, že stromální buňky poskytují tvorbu hematopoetického mikroprostředí. Je zřejmé, že vytvoření hematopoetického mikroprostředí odpovídá určité úrovni regenerace stromální tkáně, a zvyšuje počet hematopoetických buněk po expanzi stromálních předmostí vhodné pro krvetvorbu.

Velmi zajímavé jsou údaje autorů, že ihned po kyretáž se zvyšuje počet stromálních progenitorových buněk ve vzdálených částech kostry. Počínaje šesté hodiny, a dvacátý den včetně kontralaterální tibie je pozorováno ve více než dvou-násobné zvýšení koncentrace a počet buněk tvořících kolonie fibroblastů. Mechanismus tohoto jevu je pravděpodobně spojena s tím, že masivní poškození kostní dřeně, což vede k tvorbě velkého počtu krevních sraženin a současně ničí významný počet krevních destiček a uvolňování do krevních destiček odvozený růstový faktor (RBSK), o kterém je známo, že způsobují proliferaci buněk tvořících kolonie fibroblasty umístěné v těle mimo proliferativní skupinu. Při pokusech na králících lokální podání MSC podporuje obnovu chirurgicky poškozené chrupavky kolenního kloubu, která může být spojena s tvorbou chondrocytů odvozených od MSC zavedených. Reparativní regenerace kostních defektů u laboratorních potkanů je však výrazně zvýšena použitím mezenchymálních kmenových buněk uzavřených v keramické kostře. Proto lze předpokládat, že pokud ne RBOK, pak jakýkoli jiný faktor, odvozený z poškozených buněk stromatu, má vzdálený stimulační účinek na proliferaci mezenchymálních kmenových buněk v neporušených oblastí kostní dřeně a stimuluje jejich migraci do oblasti tkáně defektu kostní dřeně. Na druhé straně, to v rozporu s literárními údaji z minulých let, což naznačuje, že stromální buňky jsou zodpovědné za mikroprostředí, na rozdíl od krvetvorných buněk nejsou schopni přenést a pocházejí z místních zdrojů.

Nicméně výsledky studie Gerasimov Yu et al (2001) ukazují, že aplikace mechanického traumatu způsobuje nejen ostrý restrukturalizaci stromální tkáně kyuretirovannoy kostí, ale také významné změny ve stromatu vzdálených kostí neporušený, to znamená, že je systémová odezva stromální tkáň pro lokální trauma. A při použití polytrauma - více kyretáž - tato reakce je zesílen a pozorována nejen v provozované kosti a vzdálených částí kostry, ale i v lymfatických orgánech, zejména ve slezině. Mechanismus takové systémové odpovědi stromální tkáně kostní dřeně a sleziny na lokální trauma a polytrauma zůstává neznámé. Předpokládá se, že tento proces je spojen s působením humorální faktor uvolněné mesenchymálních stromálních medulární dutiny kosti dřeně. Možnost tvorby stromální buňky kostní dřeně a sleziny organonespetsificheskogo humorální faktor odpovědný za proliferaci buněk, tvořících kolonie fibroblasty ukazují údaje o jejich kolonie stimulující činnost v jednovrstvých kulturách kostní dřeně.

V tomto ohledu je třeba poznamenat, že pokud se podává systémově multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk repopulating jejich deriváty nejen kostní dřeně, ale i jiné tkáně, která se používá, zejména pro genovou terapii. Je ukázáno, že po intravenózním podání velkých množství MSC s genomu divokého typu myší s mutantní kolagen gen I dárcovských buněk nahradit až 30% buněk v kostní a chrupavkové tkáně příjemce a transfekovaných mesenchymálních buněk kmenových myších vylučujících IL-3 člověka, na 9 měsíců účinně podporovat krvetvorbu v případě jejich současném podání s lidskými krvetvorných kmenových buněk do imunodeficientních myší.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Genetická modifikace mezenchymálních kmenových buněk

Další experimentální úspěch genetické modifikace třeba poznamenat, MSC transfekce genu pro faktor IX v lidských MSC následným převodem transfektantů buněk imunodeficientních myší, což vede k objevení krevního Antihemophilic faktoru B po dobu 8 týdnů po transplantaci. V tomto experimentu se transfekované buňky se provádí posttranslační modifikaci faktoru IX y-glutamyl karboxylázy. Transdukce MSC s retrovirový vektor kódující lidský faktor IX, byl méně úspěšný - následné zavedení těchto buněk s hemofilií psem v terapeutické faktoru IX, který podporuje normální koagulační intenzita hemostázu, pouze po dobu 12 dnů.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk v parenchymu mozku zvířat ukázaly, že dárce transformované nezralé buňky v populaci neuronů a glie. Přihojení neuronální deriváty zdravého dárce mezenchymální tkáň teoreticky umožňuje korekci genetických abnormalit metabolismu mozku u pacientů s Gaucherovou chorobou a dalších poruch metabolismu lipidů, sacharidů nebo gangliosidů.

Pokračování experimentální podmínky vyhledávání transdiferenciaci kmenových buněk v kostní dřeně stromální prekurzorů v nervové a jaterní tkáně. Pozornost vědců je zaměřena na kombinace induktorů diferenciace a speciálních kondicionačních médií. Zejména pro izolaci primární kulturu s 10% fetálního telecího séra, stromální buňky kostní dřeně promyjí a resuspendují v DMEM / F12 kultivačním médiu (1/1) se očkují v hustotě 200,000 / cm2. Po 24 hodinách se neadherující buňky odstraněny a připojeny k plastové fibroblastové buňky se kultivují po dobu jednoho týdne. Pro diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně na Neuroblasty používaných kondiciované médium získané kultivací třídenní kultury primárních myších embryonálních fibroblastů, a to i mezi DMEM / F12 (1/1) s 2% fetálního telecího séra a doplněném 20 ng / ml nebo 10-6 M LiF kyselina retinová (neuroinduktory, které se používají pro nervovou diferenciaci myších a lidských embryonálních kmenových buněk). Diferenciace stromálních buněk kostní do progenitorových buněk do hepatocytů byla indukována klimatizovaného prostředí, vytvořené jako výsledek třídenní kultivaci primární kultury embryonálních myších jaterních buněk v DMEM / F12 (1/1) médiu doplněném 10% fetálního telecího séra.

Tady je třeba znovu připomenout, že kolonie tvořící stromální buňky kostní dřeně heteromorphic a lze je rozdělit do dvou typů. První typ zahrnuje buňky podobné fibroblastům, které vytvářejí filopodické buňky s velkými jádry a jednou nebo dvěma nukleoly. Druhý typ je reprezentován malými buňkami tvaru vřetena. U obou typů buněčné kultury v kondicionovaném médiu získané na živné vrstvě primárních myších embryonálních fibroblastů, a na Z-4-tý den kultivace buněk objeví Podobně Neuroblasty. V této fázi, mají často vřetenovité s jedním nebo dvěma dlouhými procesů ukončovací filopodií. Pyramidové nebo stelátové buňky s krátkými dendryty jsou méně časté. Dendrity jeden Neuroblasty mají typické rozšíření (růst ledvin) a větvení v jeho distální části, druhý - s výraznou Růstové vrcholy filopodia, jehož prostřednictvím dochází k růstu dendrit. Podobné morfologické vlastnosti (růstové ledvin kužely a filopodia a) vlastní neuroblastom, diferencují na neurony, jsou podrobně popsány v publikacích podle neurogeneze. Na tomto základě, někteří autoři dospěli k závěru, že objevili v kultuře jsou buňky Neuroblasty. Zejména Schegelskaya E. Et al (2002), po primární kultury buněk stromatu kultivovaných po dobu dvou týdnů v vyměnitelné na každém z-a-4.den kondicionovaného média zjištěno, že část proliferujících buněk, nediferencovaný zachování stavu. Vnější buňky vypadaly jako fibroblasty a byly identifikovány v kultuře spolu s diferenciačními neuroblasty. Větší část buněk (asi 80%), se nacházejí v různých stádiích diferenciace buněk nervové tkáně převážně v neuronech. Dendritické procesy těchto buněk v těsném vzájemném kontaktu, tak, že postupně buňky vytvořenou na podkladu úseků neuronové sítě ve formě dlouhých vláken mnohobuněčných. Dendritické trny Neuroblasty mnohem delší, některé z nich v 8-10 krát větší než délka těla neuronu. Postupně se zvýšil podíl pyramidových a stelátových buněk. Dendrity stelátových buněk rozvětvené. Podle autorů, později diferenciace pyramidových a hvězdicových buněk, ve srovnání s vytáhlých odpovídá sekvenci normálních fází neurogeneze u zvířat. Výsledkem je, že autoři došli k závěru, že kmenové buňky stromatu kostní dřeně jsou buňky vystaveny indukované neurogeneze v tomto procesu in vitro generované Neuroblasty ze všech tří hlavních typů neuronů. Prekurzory nervových buněk byly také nalezeny v kultuře buňkami stromatu kostní dřeně po dobu 3-4 dnů v médiu s 2% fetálním sérem a 20 ng / ml LIF. Ale v tomto případě, kmenové buňky byly rozděleny velmi pomalu, diferenciace Neuroblasty dochází pouze ve 30% případů, a netvoří neuronové sítě. Použití jako nervových buněk induktory diferenciace kyseliny retinové, autorů získané v kultuře na 25-30% z nervových buněk s převahou gliových buněk - astrocytů a oligodendrocytů. Neurony byly jen třetina všech nervových buněk, i když byly představeny všechny tři typy: vřetenovité, pyramidální a hvězdicovité buňky. Na 6. Den kultivace buněk stromatu v kyselině retinové střední nervové buňky se staly více diferencovaný, zatímco bylo zjištěno, jednotlivé axony pyramidových neuronů, které v normálním neuroontogenesis se objeví později tvorbu dendritických procesů. Podle autorů, i přes nízký výtěžek nervových buněk, způsob vyvolání kyselinu retinovou má výhody: astrocyty a oligodendrocyty a myelinating ovládat krmné funkce v průběhu růstu axonů a dendritů a jsou nezbytné pro tvorbu normální nervové tkáně. Proto je vhodné opravit poškozená místa in vivo, je lepší použít suspenzi neuronů obohacených gliovými buňkami.

Ve druhé sérii experimentů jsme se pokusili indukovat diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně v jaterních buňkách. Po třídenní kultivaci stromatu kostní dřeně kmenových buněk v kondicionovaném médiu získané inkubací myších zárodečných hepatocyty, bylo zjištěno, že velké, kulovité tvaru buňky, často dvě jaderné, cytoplazmatické inkluze s různou velikostí. Tyto buňky byly v různých stádiích diferenciace, a lišily ve velikosti, počtu jader a cytoplazmatických inkluzí. Ve většině z těchto buněk byla detekována glykogenu, čímž jsme identifikovali je jako hepatocytů prekurzorových buněk. Vzhledem k tomu, kultury byly detekovány žádné buňky Podobně Neuroblasty, následně k závěru, že v kondicionovaném médiu získané kultivací embryonálních hepatocyty, neexistují žádné faktory diferenciace nervových buněk, a naopak, existují faktory, které indukují diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně do progenitorových buněk hepatocytů . Autoři předpokládají přítomnost pluripotentních buněk z stromatu kostní dřeně, jak se diferencují in vitro na buňkách jater nebo nervové tkáně v závislosti na specifických kondiciovaného média, a induktory.

U některých prací je diferencování buněk stromy kostní dřeně do kardiomyocytů, buněk chrupavky, kostí a nervových tkání správně zobrazeno. Existují informace, že mezi buňkami kostní dřeně jsou populace kmenových buněk, které se mohou diferencovat na hepatocyty. Ve světle těchto výsledků shora uvedených pokusů na myších lze stále považovat za další potvrzení přítomnosti v kostní dřeni pluripotentní mezenchymálních kmenových buněk, které mají schopnost diferenciace do buněk různých tkání dospělého organismu.

Transplantace mezenchymálních kmenových buněk

V klinické transplantace lidských mezenchymálních kmenových buněk mohou být použity pro expanzi hematopoietických kmenových buněk a jejich rané potomci prekommitirovannyh. Zejména zavedení autologních krvetvorných kmenových buněk u pacientů s rakovinou a MSC po chemoterapii u vysoce urychluje obnovu neutrofilů a krevních destiček v periferní krvi. Autologní a alogenní transplantace mezenchymálních kmenových buněk používaných k léčbě mnohočetného myelomu, aplastické anémie, spontánní trombocytopenie - onemocnění spojených s primární defekt hematopoetických stromální tkáně. Účinnost buněčné terapie v hematologických patologických stavů v mnoha případech vyšší, zatímco zavedení stromálních a krvetvorných kmenových buněk, což se projevuje snížení pooperačním období rekonvalescence, krve, snížení počtu úmrtí v důsledku ne-selektivní destrukci regionálních a cirkulujících nádorových buněk, ve kterých matrice a její vlastní progenitorové buňky hematopoetické pacienta. MSC slibná aplikací a dalších multipotentní mesenchymální prekurzorové buňky v klinické praxi v důsledku své relativní snadnost získání aspiráty kostní dřeně, expanze v kultuře a transfekci terapeutického genu. Tak pro kompenzaci vady místní tkáně lze použít místní implantaci multipotentních mesenchymálních prekurzorových buněk a v systémové dysfunkce tkání mesenchymálního původu není vyloučeno jejich zavedení do oběhu.

Opatrnější v jejich tvrzení autorů, v níž perspektivy MSC pro lokální, systémové transplantaci a genové terapie jsou analyzovány z hlediska biologie buněk stromatu. Postnatální kostní dřeň je tradičně považován za těleso se skládá ze dvou hlavních systémů různých buněčných linií - vlastně krvetvorné tkáně a jeho přidružené podpůrné vazivové tkáně. Z tohoto důvodu, kostní dřeně mezenchymální kmenové buňky původně pouze jako zdroj stromálního základ pro výrobu regulačních faktorů hematopoetické mikroprostředí. Poté se pozornost vědců obrátila na studium role MSC jako kmenového zdroje skeletálních tkání. Nedávné údaje ukazují neočekávaný potenciál diferenciace stromálních buněk kostní tvořit nervové nebo svalové tkáně. Jinými slovy, mesenchymální kmenové buňky vykazují transgermalnuyu plasticitu - schopnost diferenciace do buněčné typy, které fenotypicky než původní tkáně buněk. Nicméně, některé aspekty biologie stromální buňky kostní dřeně, zůstávají nejasné a nevyřešené obecně biologického plánu, a do určité míry, včetně identifikace, původ a vývoj a funkci v stromálních buněk kostní dřeně in vivo kostní, jakož i přípustného potenciální diferenciaci ex vivo a možnosti terapeutické použití in vivo. Údaje o potenciální příležitosti MSC, jakož i výsledky studií druhé regenerační potenciálu kmenových buněk, v ostrém kontrastu se zavedenou dogma v biologii.

Při kultivaci v podmínkách s nízkou hustotou vytvářejí stromální buňky kostní dřeně odlišné kolonie, z nichž každý je derivátem jediné prekurzorové buňky. Procento stromálních buněčných prekurzorů v buňkách kostní dřeně nukleaci je definováno v jejich schopnosti tvořit kolonie velmi závisí na podmínkách kultivace a druhy z MSC, které patří. Například u hlodavců pro získání maximálního množství stromálních progenitorových buněk, je nezbytně nutné, v přítomnosti ozářených podavače kultury buněk kostní dřeně a séra, zatímco kolonie tvořící účinnosti lidských mesenchymálních kmenových buněk, je nezávislý na podavače, nebo z kultivačního média. Počet známých mitogenních faktorů stimulujících proliferaci stromálních progenitorových buněk je omezen. Ty zahrnují PDGF, EGF, FGF, TGF-b a také IGF1. Za optimálních podmínek kultivace Mscs polyklonální linie byly kultivovány in vitro po dobu více než 50 buněčných dělení, takže je možné získat miliardy stromálních buněk kostní dřeně od 1 ml aspirátu to.

Nicméně, populace stromálních buněk kostní dřeně je heterogenní, která se projevuje jako variabilita ve velikosti kolonií, jiné rychlosti jejich vzniku a různé buněčné morfologie, který zahrnuje řadu fibroblastového jako vřetena pro velké ploché buňky. Při vývoji těchto plodin po 20 dnech je také zaznamenána fenotypová heterogenita. Část kolonie se vyznačuje vysokou expresi alkalické fosfatázy, jiné ne vyjádřit, a kolonie třetího typu jsou fosfatazopozitivnymi v centrální oblasti a fosfatazonegativnymi na okraji. Samostatné kolonie tvoří uzliny kostní tkáně (začátek matrixové mineralizace je vyznačen, když je obarvený alizarinovou červenou barvou nebo vápníkem Van-Kossem). V jiných koloniích dochází k akumulaci tuku, která je identifikována barvením G s červenou barvou. Méně často kolonie mezenchymálních kmenových buněk tvoří chrupavky, které jsou barveny alkánovou modří).

Po ektopické transplantaci u pokusných zvířat polyklonální MGK vytvoří linie ektopické kosti stroma s setchatoobraznoy spojené s myelopoiesis a adipocytů, a také, ale jen zřídka, s chrupavkové tkáně. V monoklonální linií transplantaci stromální buňky kostní dřeně v některých případech chimérismus, vyznačující se tím, de novo tvořen kostní tkáně složené z kostních buněk, adipocyty obsahuje stroma a dárce původu, zatímco buněčné linie hematopoetických a cévního systému jsou odvozeny od příjemce.

Výsledky těchto studií potvrzují kmenovou povahu prekurzoru stromální kostní dřeně, z níž byla získána klonová linie. Současně také ukazují, že ne všechny klonování v kulturních buňkách jsou opravdu multipotentní kmenové buňky. Někteří vědci se domnívají, jsme vyjádřili svůj názor, že nejpřesnější informace o skutečném potenciálu odlišení jednotlivých klonů lze získat pouze in vivo po transplantaci, spíše než stanovením fenotypu jejich derivátů in vitro. Exprese v osteo- kultura fenotypových markerů hondro- nebo adipogeneze (stanoveno z mRNA, nebo prostřednictvím histochemické techniky), a to i výroba mineralizované matrice neodráží stupeň pluripotentním jednoho klonu in vivo. Z tohoto důvodu budou k dispozici identifikace kmenových buněk stromatu skupině pouze a posteriori, za vhodných podmínek transplantátu biologickém vzorku. Zejména chondrogenesis velmi zřídka pozorovány v transplantačních otevřených systémech, zatímco tvorba chrupavky není neobvyklé v uzavřených systémech, jako jsou například difúzní komory, nebo v mikromassnyh kulturách stromálních buněk in vitro, vyznačující se tím dosáhne místně nízký tlak kyslíku, přispívají k tvorbě chrupavky. Proto i transplantace techniky, stejně jako nespecifická vitro kultivační podmínky výrazně ovlivnit rozsah diferenciace MSC.

Experimentální transplantace s dodržením daných experimentálních podmínek je zlatým standardem pro stanovení potenciálu diferenciace stromálních buněk kostní dřeně a klíčovým prvkem jejich správné identifikace. Historicky byly studie transplantace kostní dřeně kostní dřeně spojené s běžným problémem transplantace kostní dřeně. Bylo zjištěno, že hemopoetické mikroprostředí vzniká transplantací stromálních buněk kostní dřeně a poskytuje ektopický vývoj hemopoetické tkáně v transplantační zóně. Původ mikroprostředí od dárce a hematopoetické tkáně - od hostitele nám umožňuje léčit ektopickou kosti jako skutečnou "obrácenou" transplantaci kostní dřeně. Lokální transplantace stromálních buněk kostní dřeně podporuje účinnou korekci kostních defektů, výraznější než při spontánní regenerační regeneraci. V několika preklinických studiích na zvířecích modelech přesvědčivě prokázaly možnost transplantace stromální buňky kostní dřeně v ortopedii, i když pro optimalizaci těchto metod, a to i v nejjednodušších případech vyžadují nejpečlivější práci a analýzu. Zvláště nejsou dosud stanoveny optimální podmínky pro expanzi osteogenních stromálních buněk ex vivo, struktura a složení ideálního nosiče zůstávají nevyužité, stejně jako počet buněk nezbytných pro regeneraci objemových kostí.

Kromě použití vypěstované ex vivo kostní stromálních buněk pro regeneraci tkání mesenchymálního původu neortodoxní duktility MSC otevírá potenciální použití pro regeneraci nervových buněk, nebo dodání genových produktů v CNS. V zásadě to zjednodušuje buněčnou terapii při porážce nervového systému, protože není zapotřebí získávat autologické neurální kmenové buňky od lidí. Zprávu o možnost použití buněk kostní dřeně pro generování kardiomyocytů a myogenních progenitorů jako skutečně stromální tak vnestromalnogo původu.

Pokusy probíhají o systémové transplantaci stromálních buněk kostní dřeně pro léčbu běžných onemocnění skeletu. Není pochyb o tom, že stromální buňky kostní dřeně jsou populace zodpovědné za genetických poruch onemocnění skeletu, který je dobře vidět do přenosového vektoru pomocí genetické informace buněk, což vede k tvorbě patologické kostní tkáně u pokusných zvířat. Nicméně, dosud prokázána schopnost buněk stromatu implantovaných, prizhivlyatsya, proliferují a diferencují se do kosterních kostí po injekci do krevního řečiště.

To je částečně způsobeno tím, že standardní postup stromatu kostní dřeně nejsou transplantovány krvetvorné tkáně, takže přísná kritéria pro hodnocení úspěšné přihojení systémové podávání stromální buňky mají být ještě vyvinuty. Je třeba si uvědomit, že přítomnost markerových genů v tkáňových extraktech nebo izolace buněk donorového původu v kultuře neznamená, že by se buněčné štěpení, ale pouze jejich přežití. I intraarteriální injekce stromální buňky kostní dřeně v myším končetiny může vést k prakticky nulové výsledek štěpu, a to navzdory skutečnosti, že buňky dárce odvozené nachází ve velkém množství v rámci sítě mikrovaskulární kostní dřeně. Bohužel se takové buňky obvykle popisují jako "engrafované" pouze na základě výsledků stanovení markerových donorových genů v podmínkách ex vivo kultury. Kromě toho je třeba poskytnout přesvědčivý důkaz o dlouhodobé integraci diferencovaných a funkčně aktivních buněk původu dárců. V mnoha publikovaných pracích, kde je uvedeno, že se v kostře objevují stromální buňky kostní dřeně, je nedostatek jasných dat tohoto druhu nápadný. Nicméně je třeba poznamenat, že v některých správných experimentech na zvířatech byla stanovena omezená, ale reálná štěpení stromálních progenitorových buněk po jejich systémovém podání.

Tato data jsou v souladu s výsledky studie o možnosti přivádění myogenních prekurzorových buněk kostní dřeně do svalů cévním systémem. Nesmí se však zapomínat na to, že jak kostní, tak svalová tkáň se tvoří během vývoje a růstu na základě extravaskulárních buněčných pohybů, které používají migrační procesy, které nezahrnují cirkulaci v krvi. Pokud skutečně existuje nezávislá oběhová cesta pro dodávání prekurzorových buněk do tkání v pevné fázi, je možné dovolit existenci fyziologicky cirkulujících mesenchymálních progenitorových buněk? Jaký je původ těchto buněk v rozvíjejícím se a postnatálním organismu a jak pronikají do cévní stěny? Řešení těchto otázek je naprosto nezbytné a vyžaduje nejdůkladnější předklinickou analýzu. I po nalezení odpovědi na tyto otázky zůstávají problematické kinetické aspekty spojené s růstem skeletu a remodelací pojivové tkáně nevyřešeny. Současně se zdá, že léčba poruch osteogeneze nahrazením celé populace mutovaných skeletálních progenitorových buněk zdravými stromálními buňkami je skutečnou klinickou perspektivou. V tomto případě mohou být lokální zóny zlomeniny nebo deformace způsobené patologickou osteogenezí stejně jako destruktivní změny kostní tkáně korigovány kultivovanými stromálními kmenovými buňkami in vitro. Proto by měl být směr budoucího výzkumu zaměřen na problémy transformace nebo genetické korekce autologních mutovaných osteogenních progenitorových buněk ex vivo.

Genové inženýrství buňky, dočasně nebo trvale, se stal základem buněčné a molekulární biologie, zdroj mnoha vědeckých poznatků týkajících se role jednotlivých proteinů v buněčném metabolismu in vitro látkami a in vivo. Využití molekulárních technik pro korekci dědičné choroby a lidských onemocnění je velmi slibné pro praktické medicíně, protože vlastnosti stromální kmenové buňky kostní dřeně se nechá vyvíjet jedinečné obvodů transplantaci pro korekci genetických onemocnění skeletu. V tomto případě mezenchymální progenitorové buňky lze získat poměrně snadno z budoucího příjemce, jsou přístupné genetické manipulace a jsou schopny množit ve velkém množství v krátkém časovém období. Použití mezenchymálních kmenových buněk zabraňuje omezením a rizikům spojeným s dodáním genetického informačního materiálu přímo k pacientovi prostřednictvím vektorových struktur. Tato strategie je použitelná pro pi embryonálních kmenových buněk, ale postnatální autologní stromální buňky kostní dřeně - výhodný materiál, protože jejich podávání vylučuje možné imunologické po transplantaci komplikace. Za účelem dosažení krátkodobý efekt, například za účelem urychlení regenerace kostí, optimální metoda je genetická modifikace mezenchymálních kmenových buněk za použití elektroporatsrsh, chemické syntézy, lipofekce, plasmidů a adenovirové konstrukty. Zejména virové transfekce ve stromálních buněk kostní dřeně BMP-2 byl účinný při urychlování regenerace kosti v experimentální polytraumat. Tvorba adenovirových vektorových struktur je výhodná kvůli nepřítomnosti toxicity. Nicméně genetická modifikace stromálních buněk kostní dřeně je v tomto případě charakterizována extrémně nízkou stabilitou. Kromě toho, normální transformované stromální buňky kostní dřeně vyžadují použití vektorových nosičů genetické informace 10 krát více infekční než jiné typy buněk, což výrazně zvyšuje procento smrti buněk po transfekci.

Pro léčbu recesivní onemocnění způsobených nízkou nebo žádnou biologickou aktivitu určitých genů třeba delší nebo trvalé modifikace mezenchymálních kmenových buněk, což vyžaduje použití adeno-asociované viry, retroviry, lentiviry a adeno-retrovirové chiméry. Místo transportu těchto virů je schopno nést velké transfekce DNA (až 8 kb). V odborné literatuře se již objevily informace o biologické aktivitě exogenních stromální buňky kostní dřeně transfektovaných retrovirové konstrukty kódující syntézu regulačních molekul, a markerů - IL-3, CD2, faktor VIII, a enzymy podílející se na syntéze L-DOPA. V těchto dílech však autoři poukazují na řadu omezení, která musí být překonána dříve, než začne praktická aplikace této technologie. Prvním problémem je optimalizace procesu modifikace MCK ex vivo. Je známo, že prodloužení (3-4 týdnů) proliferace stromálních buněk kostní dřeně in vitro snižuje jejich transfekci. Ve stejné době, aby se dosáhlo vysoké úrovně genetické modifikace MSC je nutné provést několik transfitsirovadiya cyklů. Druhý problém spočívá v délce trvání exprese terapeutického genu, který dosud nepřesahuje čtyři měsíce. Přirozené snížení efektivní genové exprese je způsobeno inaktivací promotorů a smrtí modifikovaných buněk. Obecně vyhlídky přenosu genetické informace pomocí mezenchymálních kmenových buněk Výsledky předběžných studií ukazují, že je třeba pro další optimalizaci transfekčních metod ex vivo, výběrem odpovídající promotor reguluje biologické aktivity ve správném směru, a zvyšuje schopnost modifikovaných kostní stromálních buněk kostní dřeně samoobnoveni in vivo po transplantaci. Je třeba poznamenat, že použití retrovirových konstrukcí pro modifikaci stromálních buněk kostní dřeně správným směrem nemusí vždy vyžadovat jejich povinné uchopení. Transfektované mesenchymální kmenové buňky mohou provést korekční funkci na pozadí stabilního pobytu a bez povinného aktivního fyzického začlenění a fungování v pojivové tkáni. V takovém případě je třeba je považovat za biologickou mini pumpu, která produkuje in vivo faktor, jehož deficit určuje projev genetické patologie.

Použití transformovaných kostní stromálních buněk kostní dřeně pro léčení dominantní genetické onemocnění, které se vyznačuje tím, exprese genu nebo abnormální patologické biologické aktivity, je mnohem více problematické, protože v tomto případě je nutné blokovat přenos nebo prodej genetické informace zkreslený. Jednou z metod genetického inženýrství - homologní rekombinace z embryonálních kmenových buněk pro generování transgenních zvířat. Nicméně, velmi nízká úroveň homologní rekombinanty, v kombinaci s problematikou identifikace, oddělení a rozšíření těchto rekombinantů je nepravděpodobné, že by podporovat široké využití této techniky v blízké budoucnosti, a to i v případě, při vývoji nových technologických postupů. Druhý přístup ke genové terapii je založen na dominantní patologii automatické korekce poškozené DNA jako genetické mutace mohou být opraveny zavedení exogenní DNA s požadovanou sekvencí (krátké DNA oligonukleotidů, nebo chimérické RNA / DNA oligonukleotidů), které se vážou na homolog v poškozené genomu. Třetí provedení tohoto vynálezu poskytuje patologické nálezy přenosový zámek, jehož je dosaženo pomocí speciálně navržených oligonukleotidů, které se váží na určitý gen za vzniku ternárního šroubovicovou strukturu, která vylučuje možnost transkripce.

I když je korekce genetických chorob na úrovni genomu, je optimální a výhodné léčebná metoda, mRNA je také slibným vektor (možná ještě přístupné) pro blokování dominantní negativní gen. Aby bylo možné inhibici translace a / nebo při zvýšení degradace mRNA již dlouho používá se proteinové molekuly antisense oligonukleotidových sekvencí nebo plné blokování navázání mRNA biosyntetického aparátu buňky. Dvojvláknová RNA navíc indukuje rychlou degradaci mRNA, jejíž mechanismus zůstává nejasný. Nicméně je nepravděpodobné, že by pouhá eliminace mRNA transkribovaná z mutantní alely s krátkými nebo jedinými mutacemi usnadnila expresi normální alelové mRNA. Alternativou je použití ribozinov hammerhead a vlásenka, mají schopnost vázat se na vysoce specifických místech mRNA s následnou indukcí jejich štěpení a inaktivaci během překladu. V současnosti je studována možnost použití této metody při léčbě patologické osteogeneze. Bez ohledu na to, co je přesně cíl - genomové nebo cytoplazmatické prvky úspěch nových technologií genové terapie bude stanovena účinnost zahrnutím činidel v kostní stromálních buněk kostní dřeně ex vivo, optimální volbu konkrétního vektoru a stabilní schopnosti mesenchymálních kmenových buněk, které exprimují požadovaný faktorů in vivo.

Objev mezenchymálních kmenových buněk s jejich neočekávanými vlastnostmi vytváří nový koncepční schéma pro vývoj buněčných linií. Ale pochopit biologickou roli stromálních kmenových buněk, na jejich povahu, schopnost transdiferenciace nebo dediferenciaci, jejich fyziologický význam v procesu embryonálního vývoje, postnatální růst, zrání a stárnutí, jakož i v lidských nemocí vyžadují další interdisciplinární výzkum.