Kmenové buňky a regenerativní plastická medicína

Dnes existuje jen málo praktikujících lékařů, kteří by nevěděli o vývoji nového směru v léčbě nejzávažnějších onemocnění, dříve nevyléčitelných tradiční i alternativní medicínou. Mluvíme o regenerativně-plastické medicíně, založené na využití regeneračního potenciálu kmenových buněk. Kolem rozvíjejícího se směru se rozpoutala nebývalá vědecká diskuse a pseudovědecký humbuk, z velké části vytvořený díky informačním hyperbolám World Wide Webu. Ve velmi krátké době laboratorní studie terapeutických schopností kmenových buněk překročily rámec experimentu a začaly být aktivně zaváděny do praktické medicíny, což vyvolalo řadu problémů vědecké, etické, náboženské, právní a legislativní povahy. Státní a veřejné instituce se zjevně ukázaly jako nepřipravené na rychlost přechodu kmenových buněk z Petriho misek do systémů pro intravenózní podávání, což není prospěšné ani pro společnost jako celek, ani pro konkrétního trpícího člověka. Není snadné pochopit nepředstavitelné množství informací o možnostech kmenových buněk, a to jak kvantitativních, tak i kvalitativních, a to ani pro specialisty (kterých není, protože se každý snaží nový vědecký trend zvládnout sám), nemluvě o lékařích, kteří se regenerativní plastické medicíně přímo nepodílejí.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Proč jsou takové experimenty potřeba a jsou vůbec potřeba?

Na první pohled je vytvoření buněčných mezidruhových chimér plodem nespoutané fantazie fanatického vědce, který zapomněl na bioetiku. Právě tento přístup však výrazně rozšířil naše základní znalosti o embryogenezi, protože umožnil vypočítat počet buněk nezbytných pro organogenezi (tvorbu jater, mozku, kůže a orgánů imunitního systému). Navíc (možná je to v biologii embryonálních kmenových buněk to hlavní) genetici dostali k dispozici unikátní nástroj, s jehož pomocí lze během chimerizace embryí stanovit funkční účel genů. Nejprve se pomocí speciální techniky dvojitého knockoutu „vypne“ studovaný pár genů v embryích. Poté se takové embryo zavede do blastocysty a sledují se změny, které probíhají v těle vyvíjejícího se chimérického embrya. Tímto způsobem byly stanoveny funkce genů sf-1 (vývoj nadledvin a pohlavních orgánů), urt-l (útvar ledvin), muoD (vývoj kosterního svalstva) a gata-l-4 (útvar erytropoézy a lymfopoézy). Kromě toho lze do ESC laboratorních zvířat zavést (transfekovat) lidské geny, které dosud nebyly studovány, a určit tak jejich funkci pomocí chimérického embrya.

Ale zpravidla ospravedlnění experimentu získáním nových základních poznatků nenachází podporu u širokého publika. Uveďme příklad aplikovaného významu chimerizace pomocí embryonálních kmenových buněk (ESC). V první řadě se jedná o xenotransplantaci, tj. transplantaci zvířecích orgánů člověku. Teoreticky umožňuje vytvoření chimér lidsko-prasečích buněk získat zvíře, které je svými antigenními vlastnostmi mnohem bližší dárci ESC, což v různých klinických situacích (diabetes mellitus, jaterní cirhóza) může zachránit život nemocného člověka. K tomu se však musíme nejprve naučit, jak vrátit vlastnost totipotence genomu zralé somatické buňky, a poté ji lze zavést do vyvíjejícího se prasečího embrya.

Dnes se schopnost embryonálních kmenových buněk dělit se téměř donekonečna za speciálních kultivačních podmínek využívá k produkci totipotentní buněčné hmoty s její následnou diferenciací na specializované buňky, jako jsou dopaminergní neurony, které jsou následně transplantovány pacientovi s Parkinsonovou chorobou. V tomto případě transplantaci nutně předchází cílená diferenciace získané buněčné hmoty na specializované buňky potřebné k ošetření a čištění těchto buněk od nediferencovaných buněčných elementů.

Jak se později ukázalo, hrozba karcinogeneze nebyla zdaleka jedinou překážkou transplantace buněk. ESC v embryoidních tělíscích se spontánně diferencují heterogenně, tj. tvoří deriváty široké škály buněčných linií (neurony, keratinocyty, fibroblasty, endoteliocyty). V zorném poli mikroskopu v tomto případě vynikají kardiomyocyty mezi buňkami různých fenotypů, z nichž každý se stahuje ve svém vlastním rytmu. Pro léčbu pacienta je však nutné mít čisté buněčné populace: neurony - v případě mrtvice, kardiomyocyty - v případě infarktu myokardu, β-buňky slinivky břišní - v případě diabetu mellitus, keratinocyty - v případě popálenin atd.

Další fáze vývoje buněčné transplantologie byla spojena s vývojem technologií pro získání dostatečného počtu (miliony buněk) takových čistých buněčných populací. Hledání faktorů způsobujících řízenou diferenciaci ESC mělo empirický charakter, protože sekvence jejich syntézy během embryogeneze zůstávala neznámá. Nejprve bylo zjištěno, že tvorba žloutkového vaku je indukována přidáním cAMP a kyseliny retinové do kultury ESC. Hematopoetické buněčné linie byly vytvořeny v přítomnosti 1L-3, SCF, fibroblastového růstového faktoru (FGH), inzulínu podobného růstového faktoru (IGF-1), 1L-6 a faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-СSF) v kultivačním médiu. Buňky nervového systému byly vytvořeny z ESC po odstranění LIF a vrstvy fibroblastů, která sloužila jako podpůrný materiál. Po ošetření kyselinou retinovou v přítomnosti fetálního séra se ESC začaly diferencovat na neurony a kardiomyocyty byly získány přidáním dimethylsulfoxidu (DMSO), který zajišťuje cílené dodávání hydrofobních signálních molekul do buněčného jádra. V tomto případě akumulace aktivních forem kyslíku v kultivačním médiu, stejně jako elektrická stimulace, přispěla k tvorbě zralých kontraktilních kardiomyocytů.

Obrovské úsilí a zdroje byly vynaloženy na nalezení podmínek pro diferenciaci embryonálních kmenových buněk (ESC) na buňky slinivky břišní produkující inzulín. Brzy se však ukázalo, že řada specializovaných buněčných linií (β-buňky pankreatu, imunitní a endokrinní buňky, adipocyty) nevzniká z ESC, pokud jsou stimulovány podle principu „jeden stimulační faktor - jedna buněčná linie“. Tento princip se ukázal být platný pouze pro omezený počet buněčných linií. Zejména tvorbu neuronů lze indukovat kyselinou retinovou, svalovou buněčnou linii transformujícím růstovým faktorem β (TCP-β), erytroidní linie 1L-6 a monocytární myeloidní linii 1L-3. Navíc se ukázalo, že účinky těchto faktorů na diferenciaci ESC jsou striktně závislé na dávce.

Začala fáze hledání kombinací růstových faktorů, které by posunuly embryogenezi (ESC) do pozdějších stádií embryogeneze s tvorbou mezodermu (zdroj kardiomyocytů, kosterních svalů, epitelu ledvinových tubulů, myeloerytropoézy a buněk hladkého svalstva), ektodermu (epidermis, neurony, sítnice) a endodermu (epitel tenkého střeva a sekrečních žláz, pneumocytů). Příroda jako by nutila vědce postupovat po cestě embryogeneze, opakovat její fáze v Petriho misce a nedávat jim možnost okamžitě a snadno dosáhnout požadovaného výsledku. A takové kombinace růstových faktorů byly nalezeny. Aktivin A v kombinaci s TGF-β se ukázal jako silný stimulátor tvorby mezodermálních buněk z ESC a zároveň blokovat vývoj endodermu a ektodermu. Kyselina retinová a kombinace signálů morfogenetického proteinu kostní dřeně (BMP-4) a epidermálního růstového faktoru (EGF) aktivují tvorbu ekto- a mezodermálních buněk a zastavují vývoj endodermu. Je pozorován intenzivní růst buněk všech tří zárodečných vrstev za současného působení dvou faktorů na embryonální kmenové buňky (ESC) - hepatocytárního růstového faktoru (HGF) a nervového růstového faktoru.

Pro získání potřebných buněčných linií je tedy nutné nejprve přenést embryonální kmenové buňky do stádia tvorby buněk nějaké zárodečné vrstvy a poté vybrat novou kombinaci růstových faktorů schopných indukovat řízenou diferenciaci ekto-, mezo- a endodermu do specializovaných buněk nezbytných pro transplantaci pacientovi. Počet kombinací růstových faktorů se dnes pohybuje v tisících, většina z nich je patentována, některé biotechnologické společnosti vůbec nezveřejňují.

Nastal čas purifikovat získané buňky od nediferencovaných buněčných nečistot. Buňky diferencované v kultuře byly označeny markery zralých buněčných linií a prošly vysokorychlostním laserovým imunofenotypovým třídičem. Laserový paprsek je našel v celkovém buněčném proudu a nasměroval je samostatnou cestou. Laboratorní zvířata byla první, která obdržela získaný purifikovaný buněčný materiál. Nastal čas vyhodnotit účinnost použití derivátů ESC na modelech onemocnění a patologických procesů. Jedním z takových modelů byla experimentální Parkinsonova choroba, která se u zvířat dobře reprodukuje pomocí chemických sloučenin, které ničí dopaminergní neurony. Vzhledem k tomu, že onemocnění u lidí je založeno na získaném deficitu dopaminergních neuronů, bylo použití substituční buněčné terapie v tomto případě patogeneticky opodstatněné. U zvířat s experimentálním hemiparkinsonismem se uchytila přibližně polovina dopaminergních neuronů získaných z ESC a zavedených do mozkových struktur. To stačilo k významnému snížení klinických projevů onemocnění. Pokusy o obnovení funkce poškozených struktur CNS při experimentálních mrtvicích, úrazech a dokonce i rupturách míchy se ukázaly jako poměrně úspěšné.

Je však třeba poznamenat, že téměř všechny případy úspěšného použití diferencovaných derivátů ESC pro korekci experimentální patologie byly provedeny v akutním období simulované patologické situace. Výsledky léčby na dálku nebyly tak uklidňující: po 8-16 měsících pozitivní efekt transplantace buněk zmizel nebo prudce poklesl. Důvody jsou zcela jasné. Diferenciace transplantovaných buněk in vitro nebo in loco morbi nevyhnutelně vede k expresi buněčných markerů genetické cizorodosti, což vyvolává imunitní útok ze strany těla příjemce. K vyřešení problému imunologické nekompatibility byla použita tradiční imunosuprese, souběžně s ní se v klinických studiích začal realizovat potenciál transdiferenciace a genetické korekce autologních hematopoetických a mezenchymálních kmenových buněk, které nezpůsobují imunitní konflikt.

Co je regenerativní plastická medicína?

Evoluce určila dvě hlavní možnosti ukončení života buňky - nekrózu a apoptózu, které na úrovni tkání odpovídají procesům proliferace a regenerace. Proliferaci lze považovat za druh oběti, kdy dochází k vyplnění defektu poškozené tkáně v důsledku její náhrady elementy pojivové tkáně: při zachování strukturální integrity tělo částečně ztrácí funkci postiženého orgánu, což určuje následný rozvoj kompenzačních reakcí s hypertrofií nebo hyperplazií strukturálních a funkčních prvků, které zůstávají nedotčené. Délka kompenzačního období závisí na objemu strukturálních lézí způsobených faktory primární a sekundární alterace, po kterých v naprosté většině případů dochází k dekompenzaci, prudkému zhoršení kvality a zkrácení doby trvání lidského života. Fyziologická regenerace zajišťuje remodelační procesy, tj. nahrazení stárnoucích a umírajících buněk mechanismy přirozené buněčné smrti (apoptózy) novými, pocházejícími z rezerv kmenových buněk lidského těla. Procesy reparativní regenerace zahrnují také buněčné zdroje kmenových prostorů, které se však mobilizují za patologických stavů spojených s onemocněním nebo poškozením tkáně a iniciují buněčnou smrt prostřednictvím mechanismů nekrózy.

Zvýšená pozornost vědců, lékařů, tisku, televize a veřejnosti k problému studia biologie embryonálních kmenových buněk (ESC) je dána především vysokým potenciálem buněčné nebo, jak ji nazýváme, regenerativně-plastické terapie. Vývoj metod léčby nejzávažnějších lidských onemocnění (degenerativní patologie centrálního nervového systému, poranění míchy a mozku, Alzheimerova a Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza, infarkt myokardu, arteriální hypertenze, diabetes mellitus, autoimunitní onemocnění a leukémie, popáleniny a neoplastické procesy tvoří zdaleka ne úplný seznam) je založen na jedinečných vlastnostech kmenových buněk, které umožňují vytváření nových tkání, které nahrazují, jak se dříve věřilo, nevratně poškozené oblasti tkání nemocného organismu.

Pokrok teoretického výzkumu biologie kmenových buněk za posledních 10 let byl realizován spontánně se rozvíjejícími oblastmi nově vznikající regenerativně-plastické medicíny, jejíž metodologie je nejen docela dobře přístupná systematizaci, ale také ji vyžaduje. První a nejrychleji se rozvíjející oblastí praktického využití regeneračního potenciálu kmenových buněk se stala substituční regenerativně-plastická terapie. Její cestu lze ve vědecké literatuře poměrně snadno vysledovat - od experimentů na zvířatech s nekrózou myokardu až po práce posledních let zaměřené na obnovu postinfarktového deficitu kardiomyocytů nebo doplnění ztráty β-buněk slinivky břišní a dopaminergních neuronů centrálního nervového systému.

Transplantace buněk

Základem substituční regenerativně-plastické medicíny je transplantace buněk. Tuto transplantaci je třeba definovat jako komplex léčebných opatření, během nichž má tělo pacienta po krátkou nebo dlouhou dobu přímý kontakt s životaschopnými buňkami auto-, alo-, izo- nebo xenogenního původu. Prostředkem transplantace buněk je suspenze kmenových buněk nebo jejich derivátů, standardizovaná počtem transplantačních jednotek. Transplantační jednotka je poměr počtu jednotek tvořících kolonie v kultuře k celkovému počtu transplantovaných buněk. Metody transplantace buněk: intravenózní, intraperitoneální, subkutánní podání suspenze kmenových buněk nebo jejich derivátů; podání suspenze kmenových buněk nebo jejich derivátů do mozkových komor, lymfatických cév nebo mozkomíšního moku.

Alo- a autologní transplantace buněk využívají dva zásadně odlišné metodologické přístupy k realizaci pluri-, multi- nebo polypotentního potenciálu kmenových buněk – in vivo nebo in vitro. V prvním případě se zavedení kmenových buněk do těla pacienta provádí bez jejich předběžné diferenciace, ve druhém – po reprodukci v kultuře, cílené diferenciaci a purifikaci od nediferencovaných elementů. Mezi četnými metodologickými technikami substituční buněčné terapie lze poměrně jasně rozlišit tři skupiny metod: náhrada kostní dřeně a krevních buněk, náhrada buněk orgánů a měkkých tkání, náhrada tuhých a pevných prvků těla (chrupavka, kost, šlachy, srdeční chlopně a kapacitní cévy). Druhý směr by měl být definován jako rekonstrukční a regenerativní medicína, protože diferenciační potenciál kmenových buněk je realizován na matrici – biologicky inertní nebo vstřebatelné struktuře tvarované připomínající nahrazenou oblast těla.

Dalším způsobem, jak zvýšit intenzitu regeneračně-plastických procesů v poškozených tkáních, je mobilizace vlastních kmenových zdrojů pacienta pomocí exogenních růstových faktorů, jako jsou faktory stimulující kolonie granulocytů a granulocytů a makrofágů. V tomto případě vede ruptura stromálních spojení ke zvýšení uvolňování hematopoetických kmenových buněk do celkového krevního oběhu, které v oblasti poškození tkáně zajišťují regenerační procesy díky své inherentní plasticitě.

Metody regenerativní medicíny jsou tedy zaměřeny na stimulaci procesů obnovy ztracených funkcí - buď mobilizací vlastních kmenových rezerv pacienta, nebo zavedením alogenního buněčného materiálu.

Důležitým praktickým výsledkem objevu embryonálních kmenových buněk je terapeutické klonování založené na pochopení spouštěčů embryogeneze. Pokud je počátečním signálem pro zahájení embryogeneze komplex pre-mRNA nacházející se v cytoplazmě oocytu, pak by zavedení jádra jakékoli somatické buňky do enukleovaného vajíčka mělo spustit program vývoje embrya. Dnes již víme, že na realizaci programu embryogeneze se podílí asi 15 000 genů. Co se s nimi děje později, po narození, v obdobích růstu, zralosti a stárnutí? Odpověď na tuto otázku dala ovečka Dolly: jsou konzervovány. Pomocí nejmodernějších výzkumných metod bylo prokázáno, že jádra dospělých buněk si zachovávají všechny kódy nezbytné pro tvorbu embryonálních kmenových buněk, zárodečných vrstev, organogenezi a restrikční zrání (přechod k diferenciaci a specializaci) buněčných linií mezenchymálního, ekto-, endo- a mezodermálního původu. Terapeutické klonování jako směr vzniklo již v nejranějších fázích vývoje buněčné transplantologie a umožňuje návrat totipotence k vlastním somatickým buňkám pacienta za účelem získání geneticky identického transplantačního materiálu.

Objev kmenových buněk začal „od konce“, protože termín zavedený do biologie a medicíny A. Maksimovem označoval kmenové buňky kostní dřeně, které dávají vzniknout všem zralým buněčným elementům periferní krve. Hematopoetické kmenové buňky však, stejně jako buňky všech tkání dospělého organismu, mají také svého vlastního, méně diferencovaného předchůdce. Společným zdrojem pro absolutně všechny somatické buňky je embryonální kmenová buňka. Je třeba poznamenat, že pojmy „embryonální kmenové buňky“ a „embryonální kmenové buňky“ nejsou v žádném případě totožné. Embryonální kmenové buňky byly izolovány J. Thomsonem z vnitřní buněčné hmoty blastocysty a přeneseny do dlouhověkých buněčných linií. Pouze tyto buňky mají faksimile „ESC“. Leroy Stevens, který objevil embryonální kmenové buňky v experimentech na myších, je nazval „embryonálními pluripotentními kmenovými buňkami“, což odkazovalo na schopnost ESC diferencovat se na deriváty všech tří zárodečných vrstev (ekto-, mezo- a endoderm). Všechny buňky embrya v pozdějších fázích vývoje jsou však také kmenové buňky, protože dávají vzniknout obrovskému množství buněk, které tvoří tělo dospělého jedince. Pro jejich definování navrhujeme termín „embryonální pluripotentní progenitorové buňky“.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Typy kmenových buněk

Moderní klasifikace kmenových buněk je založena na principu jejich dělení podle schopnosti (potence) dávat vznik buněčným liniím, která je definována jako toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- a unipotence. Totipotenci, tj. schopnost znovu vytvořit geneticky naprogramovaný organismus jako celek, mají zygotní buňky, blastomery a embryonální kmenové buňky (buňky vnitřní hmoty blastocysty). Další skupinu totipotentních buněk, které se tvoří v pozdějších fázích embryonálního vývoje, představují primární zárodečné buňky embryonální genitální zóny (genitální tuberkulózy). Pluripotence, což je schopnost diferencovat se do buněk jakéhokoli orgánu nebo tkáně, je vlastní embryonálním buňkám tří zárodečných vrstev - ekto-, mezo- a endodermu. Předpokládá se, že multipotence, tj. schopnost tvořit jakékoli buňky v rámci jedné specializované linie, je charakteristická pouze pro dva typy buněk: tzv. mezenchymální kmenové buňky, které se tvoří v nervové liště a jsou prekurzory všech buněk pojivové tkáňové báze těla, včetně neurogliových buněk, a také hematopoetické hematopoetické kmenové buňky, které dávají vzniknout všem liniím krevních buněk. Dále se rozlišují bi- a unipotentní kmenové buňky, zejména prekurzorové buňky myeloidních, lymfoidních, monocytárních a megakaryocytárních hematopoetických klíčků. Existence unipotentních kmenových buněk byla jasně prokázána na příkladu jaterních buněk - ztráta významné části jaterní tkáně je kompenzována intenzivním dělením diferencovaných polyploidních hepatocytů.

Během vývoje se všechny orgány a tkáně tvoří v důsledku proliferace a diferenciace vnitřní buněčné hmoty blastocysty, jejíž buňky jsou v užším slova smyslu totipotentní embryonální kmenové buňky. První práci na izolaci embryonálních kmenových buněk provedl Evans, který ukázal, že blastocysty implantované do mozku myší dávají vzniknout teratokarcinomům, jejichž buňky po klonování tvoří linie pluripotentních embryonálních kmenových buněk (původní název těchto buněk - embryonální karcinomové buňky nebo zkratka ECС - se v současnosti nepoužívá). Tato data byla potvrzena v řadě dalších studií, ve kterých byly embryonální kmenové buňky získávány kultivací buněk blastocyst myší a dalších živočišných druhů, ale i lidí.

V posledních letech se v literatuře stále častěji objevuje témata plasticity kmenových buněk, která je chápána nejen jako schopnost těchto buněk diferencovat se na různé typy buněk v různých fázích vývoje, ale také podléhat dediferenciaci (transdiferenciaci, retrodiferenciaci). To znamená, že se připouští zásadní možnost návratu somatické diferencované buňky do stádia embryonálního vývoje s rekapitulací (návratem) pluripotence a jejím uplatněním v opakované diferenciaci s tvorbou buněk jiného typu. Zejména se uvádí, že hematopoetické kmenové buňky jsou schopné transdiferenciace s tvorbou hepatocytů, kardiomyoblastů a endoteliocytů.

Vědecké debaty o dělení kmenových buněk podle jejich plasticity pokračují, tj. terminologie a glosář buněčné transplantace jsou v procesu formování, což má přímý praktický význam, protože většina metod regenerativní plastické medicíny je založena na využití plastických vlastností a schopnosti kmenových buněk diferencovat se do různých buněčných linií.

Počet publikací v oblasti základních a aplikovaných problémů regenerativně-plastické medicíny rychle roste. Již byla nastíněna řada různých metodologických přístupů zaměřených na co nejoptimálnější využití regenerativně-plastického potenciálu kmenových buněk. Kardiologové a endokrinologové, neurologové a neurochirurgové, transplantologové a hematologové identifikovali oblasti svého naléhavého zájmu. Oftalmologové, ftizeologové, pneumologové, nefrologové, onkologové, genetici, pediatři, gastroenterologové, terapeuti a pediatři, chirurgové a porodníci-gynekologové hledají řešení naléhavých problémů v plastických schopnostech kmenových buněk - všichni zástupci moderní medicíny doufají, že získají příležitost vyléčit nemoci, které byly dříve považovány za smrtelné.

Je transplantace buněk dalším „všelékem“?

Tato otázka zcela oprávněně vyvstává u všech přemýšlivých lékařů a vědců, kteří analyzují současný stav lékařské vědy. Situaci komplikuje fakt, že na jedné straně pole vědecké konfrontace stojí „zdraví konzervativci“, na druhé straně „nemocní fanatici“ buněčné transplantologie. Pravda je zjevně jako vždy mezi nimi – v „zemi nikoho“. Aniž bychom se dotýkali otázek práva, etiky, náboženství a morálky, zvažme klady a zápory určených oblastí regenerativně-plastické medicíny. „Lehký vánek“ prvních vědeckých zpráv o terapeutických možnostech embryonálních kmenových buněk se rok po jejich objevení změnil v „bouřlivý vítr“, který se v roce 2003 rozvinul v „informační tornádo“. První série publikací se zabývala otázkami kultivace embryonálních kmenových buněk, jejich reprodukce a řízené diferenciace in vitro.

Ukázalo se, že pro neomezenou reprodukci embryonálních kmenových buněk v kultuře je nutné striktně dodržovat řadu podmínek. V podmíněném médiu musí být přítomny tři faktory: interleukin-6 (IL-6), faktor kmenových buněk (SCF) a faktor inhibující leukázu (LIF). Kromě toho musí být embryonální kmenové buňky pěstovány na substrátu (podpůrné vrstvě buněk) embryonálních fibroblastů a za přítomnosti fetálního telecího séra. Pokud jsou tyto podmínky splněny, ESC v kultuře rostou jako klony a tvoří embryoidní tělíska - agregáty suspenzních klonů sférických buněk. Nejdůležitějším rysem klonu ESC je, že v kultuře embryoidní tělísko přestává růst, když se v agregátu nahromadí 50-60, maximálně 100 buněk. Během tohoto období nastává rovnovážný stav - rychlost buněčného dělení uvnitř klonu se rovná rychlosti apoptózy (programované buněčné smrti) na jeho periferii. Po dosažení takové dynamické rovnováhy dochází u periferních buněk embryoidního tělíska ke spontánní diferenciaci (obvykle s tvorbou endodermálních fragmentů žloutkového vaku, angioblastů a endoteliocytů) se ztrátou totipotence. Proto, aby se získalo dostatečné množství totipotentní buněčné hmoty, musí být embryoidní tělo každý týden disagregováno transplantací jednotlivých embryonálních kmenových buněk do nového živného média - což je poměrně pracný proces.

Objev embryonálních kmenových buněk neodpověděl na otázku, co přesně a jak spouští programy embryogeneze zašifrované v DNA zygoty. Zůstává nejasné, jak se genomový program odvíjí během lidského života. Zároveň studium embryonálních kmenových buněk umožnilo rozvinout koncept mechanismů pro udržení toti-, pluri- a multipotence kmenových buněk během jejich dělení. Hlavním rozlišovacím znakem kmenové buňky je její schopnost sebereprodukce. To znamená, že kmenová buňka se na rozdíl od diferencované buňky dělí asymetricky: jedna z dceřiných buněk dává vznik specializované buněčné linii a druhá si zachovává toti-, pluri- nebo multipotenci genomu. Zůstává nejasné, proč a jak k tomuto procesu dochází v nejranějších fázích embryogeneze, kdy je dělící se vnitřní buněčná hmota blastocysty zcela totipotentní a genom ESC je v dormantním (spícím, inhibovaném) stavu. Pokud během dělení běžné buňky procesu duplikace nutně předchází aktivace a exprese celého komplexu genů, pak během dělení ESC k tomu nedochází. Odpověď na otázku „proč“ byla získána po objevu preexistující mRNA (pre-mRNA) v embryonálních kmenových buňkách (ESC), z nichž některé se tvoří ve folikulárních buňkách a jsou uloženy v cytoplazmě vajíčka a zygoty. Druhý objev odpověděl na otázku „jak“: v ESC byly nalezeny speciální enzymy zvané „editázy“. Editázy plní tři důležité funkce. Za prvé, zajišťují alternativní epigenetické (bez účasti genomu) čtení a duplikaci pre-mRNA. Za druhé, realizují proces aktivace pre-mRNA (sestřih - vystřižení intronů, tj. neaktivních úseků RNA, které inhibují proces syntézy proteinů na mRNA), po kterém začíná v buňce sestavování proteinových molekul. Za třetí, editázy podporují tvorbu sekundárních mRNA, které jsou represory mechanismů genové exprese, čímž se udržuje husté balení chromatinu a neaktivní stav genů. Proteinové produkty syntetizované na těchto sekundárních mRNA a nazývané tlumicí proteiny nebo strážci genomu, jsou přítomny v lidských vajíčkových buňkách.

Takto je dnes prezentován mechanismus vzniku nesmrtelných buněčných linií embryonálních kmenových buněk. Jednoduše řečeno, signál ke spuštění programu embryogeneze, jehož počáteční fáze spočívají ve vzniku totipotentní buněčné hmoty, pochází z cytoplazmy vajíčka. Pokud je v této fázi vnitřní buněčná hmota blastocysty, tj. ESC, izolována od dalších regulačních signálů, probíhá proces sebereprodukce buněk v uzavřeném cyklu bez účasti genů buněčného jádra (epigeneticky). Pokud je takové buňce poskytnut živinový materiál a izolována od vnějších signálů, které podporují diferenciaci buněčné hmoty, bude se dělit a reprodukovat svůj druh donekonečna.

První výsledky experimentálních pokusů o použití totipotentních buněk pro transplantaci byly poměrně působivé: zavedení embryonálních kmenových buněk do tkání myší s imunitním systémem oslabeným imunosupresivy vedlo ve 100 % případů k rozvoji nádorů. Mezi buňkami novotvaru, jejichž zdrojem byly embryonální kmenové buňky (ESC), se vyskytovaly diferencované deriváty totipotentního exogenního buněčného materiálu, zejména neurony, ale růst teratokarcinomů snižoval hodnotu získaných výsledků na nulu. Zároveň v pracích L. Stevense ESC zavedené do břišní dutiny tvořily velké agregáty, ve kterých se fragmentárně formovaly embryonální svaly, srdce, vlasy, kůže, kosti, svaly a nervová tkáň. (Chirurgové, kteří otevírali dermoidní cysty, by měli být s tímto obrázkem obeznámeni). Zajímavé je, že suspendované myší embryonální buňky se chovají úplně stejně: jejich zavedení do tkání dospělých imunokompromitovaných zvířat vždy způsobuje vznik teratokarcinomů. Pokud je ale z takového nádoru izolována čistá linie ESC a zavedena do břišní dutiny, pak se opět vytvoří specializované somatické deriváty všech tří zárodečných vrstev bez známek karcinogeneze.

Dalším problémem, který bylo nutné vyřešit, tedy bylo čištění buněčného materiálu od nečistot nediferencovaných buněk. Avšak i při velmi vysoké účinnosti cílené buněčné diferenciace si až 20 % buněk v kultuře zachovává svůj totipotentní potenciál, který se in vivo bohužel realizuje při růstu nádoru. Další „prak“ přírody – na škále lékařského rizika se záruka uzdravení pacienta vyvažuje zárukou jeho smrti.

Vztah mezi nádorovými buňkami a embryonálními pluripotentními progenitorovými buňkami (EPPC), které jsou ve vývoji pokročilejší než ESC, je poměrně nejednoznačný. Výsledky našich studií ukázaly, že zavedení EPPC do různých transplantabilních nádorů u potkanů může vést k rozpadu nádorové tkáně (G), rychlému nárůstu nádorové hmoty (D), její redukci (E-3), nebo neovlivňuje velikost spontánní centrální fokální nekrózy neoplastické tkáně (I, K). Je zřejmé, že výsledek interakce EPPC a nádorových buněk je určen celkovou sadou cytokinů a růstových faktorů, které produkují in vivo.

Je pozoruhodné, že embryonální kmenové buňky, které reagují karcinogenezí na kontakt s dospělými tkáněmi, se dokonale asimilují s buněčnou hmotou embrya a integrují se do všech orgánů embrya. Takové chiméry, sestávající z vlastních buněk embrya a dárcovských ESC, se nazývají alofenní živočichové, ačkoli ve skutečnosti se nejedná o fenotypové chiméry. Hematopoetický systém, kůže, nervová tkáň, játra a tenké střevo podléhají maximální buněčné chimerizaci, když jsou ESC zavedeny do raného embrya. Byly popsány případy chimerizace genitálií. Jedinou nedotknutelnou zónou pro ESC jsou primární zárodečné buňky.

To znamená, že embryo si zachovává genetickou informaci svých rodičů, což chrání čistotu a pokračování rodu i druhu.

Za podmínek blokády buněčného dělení raného embrya pomocí cytoklazinu vede zavedení embryonálních kmenových buněk do blastocysty k vývoji embrya, jehož primární zárodečné buňky, stejně jako všechny ostatní, byly vytvořeny z dárcovských embryonálních kmenových buněk. V tomto případě je však samotné embryo zcela dárcovské, geneticky cizí tělu náhradní matky. Mechanismy takového přirozeného blokování potenciálu pro míšení vlastní a cizí dědičné informace dosud nebyly objasněny. Lze předpokládat, že v tomto případě je realizován program apoptózy, jehož determinanty nám dosud nejsou známy.

Je třeba poznamenat, že embryogeneze zvířat různých druhů nikdy neprobíhá koordinovaně: při realizaci dárcovského programu organogeneze v těle recipientního embrya xenogenních embryonálních kmenových buněk embryo umírá in utero a je resorbováno. Existenci chimér „krysa-myš“, „prase-kráva“, „člověk-krysa“ je proto třeba chápat jako buněčnou, nikoli však morfologickou mozaiku. Jinými slovy, když jsou ESC jednoho druhu savce zavedeny do blastocysty jiného druhu, vždy se vyvinou potomci mateřského druhu, u kterých se mezi vlastními buňkami téměř všech orgánů nacházejí inkluze a někdy i shluky strukturních a funkčních jednotek sestávajících z geneticky cizího materiálu derivátů ESC. Termín „humanizované prase“ nelze vnímat jako označení nějakého druhu monstra obdařeného inteligencí nebo vnějšími vlastnostmi člověka. Jedná se pouze o zvíře, jehož část tělních buněk pochází z lidských ESC zavedených do blastocysty prasete.

Perspektivy využití kmenových buněk

Dlouhodobě je známo, že onemocnění spojená s genopatologií buněk hematopoetické a lymfoidní linie jsou po alogenní transplantaci kostní dřeně často eliminována. Nahrazení vlastní hematopoetické tkáně geneticky normálními buňkami od příbuzného dárce vede k částečnému a někdy i úplnému uzdravení pacienta. Mezi genetickými onemocněními, která se léčí alogenní transplantací kostní dřeně, stojí za zmínku syndrom kombinované imunodeficience, X-vázaná agamaglobulinemie, chronická granulomatóza, Wiskott-Aldrichův syndrom, Gaucherova a Hurlerova choroba, adrenoleukodystrofie, metachromatická leukodystrofie, srpkovitá anémie, talasemii, Fanconiho anémii a AIDS. Hlavní problém při použití alogenní transplantace kostní dřeně v léčbě těchto onemocnění je spojen s výběrem HbA-kompatibilního příbuzného dárce, pro jehož úspěšné nalezení je zapotřebí průměrně 100 000 vzorků typované hematopoetické tkáně dárce.

Genová terapie umožňuje korekci genetické vady přímo v hematopoetických kmenových buňkách pacienta. Teoreticky poskytuje genová terapie stejné výhody v léčbě genetických onemocnění hematopoetického systému jako alogenní transplantace kostní dřeně, ale bez všech možných imunologických komplikací. To však vyžaduje techniku, která umožňuje efektivní přenos plnohodnotného genu do hematopoetických kmenových buněk a udržení požadované úrovně jeho exprese, která u některých typů dědičné patologie nemusí být příliš vysoká. V tomto případě i mírné doplnění proteinového produktu deficientního genu dává pozitivní klinický účinek. Zejména u hemofilie B je 10–20 % normální hladiny faktoru IX zcela dostačující k obnovení vnitřního mechanismu srážení krve. Genetická modifikace autologního buněčného materiálu se osvědčila při experimentálním hemiparkinsonismu (jednostranné zničení dopaminergních neuronů). Transfekce embryonálních fibroblastů potkanů retrovirovým vektorem obsahujícím gen tyrosinhydroxylázy zajistila syntézu dopaminu v centrálním nervovém systému: intracerebrální podání transfekovaných fibroblastů prudce snížilo intenzitu klinických projevů experimentálního modelu Parkinsonovy choroby u pokusných zvířat.

Perspektiva využití kmenových buněk pro genovou terapii lidských onemocnění představuje pro klinické lékaře a experimentátory mnoho nových výzev. Problematické aspekty genové terapie jsou spojeny s vývojem bezpečného a účinného systému pro transport genů do cílové buňky. V současné době je účinnost přenosu genů do velkých savčích buněk velmi nízká (1 %). Metodicky se tento problém řeší různými způsoby. Přenos genů in vitro zahrnuje transfekci genetického materiálu do buněk pacienta v kultuře s jejich následným návratem do těla pacienta. Tento přístup by měl být považován za optimální při použití genů zavedených do kmenových buněk kostní dřeně, protože metody přenosu hematopoetických buněk z těla do kultury a zpět jsou dobře zavedené. Retroviry se nejčastěji používají k přenosu genů do hematopoetických buněk in vitro. Většina hematopoetických kmenových buněk se však nachází v dormantním stavu, což komplikuje transport genetické informace pomocí retrovirů a vyžaduje hledání nových způsobů účinného transportu genů do dormantních kmenových buněk. V současné době se používají metody genového přenosu, jako je transfekce, přímá mikroinjekce DNA do buněk, lipofekce, elektroporace, „genová pistole“, mechanické spojení pomocí skleněných kuliček, transfekce hepatocytů s receptorově závislou vazbou DNA na asialoglykoprotein a aerosolové zavedení transgenu do buněk alveolárního epitelu plic. Účinnost přenosu DNA těmito metodami je 10,0–0,01 %. Jinými slovy, v závislosti na způsobu zavedení genetické informace lze očekávat úspěch u 10 pacientů ze 100 nebo u 1 pacienta z 10 000 pacientů. Je zřejmé, že účinná a zároveň bezpečná metoda přenosu terapeutických genů dosud nebyla vyvinuta.

Zásadně odlišným řešením problému odmítnutí alogenního buněčného materiálu v buněčné transplantologii je použití vysokých dávek embryonálních pluripotentních progenitorových buněk k dosažení efektu reinstalace systému kontroly antigenní homeostázy dospělého organismu (efekt Kukharčuka-Radčenka-Sirmana), jehož podstata spočívá v indukci imunologické tolerance vytvořením nové základny imunokompetentních buněk se současným přeprogramováním systému kontroly antigenní homeostázy. Po zavedení vysokých dávek EPPC jsou tyto fixovány v tkáních brzlíku a kostní dřeně. V brzlíku se EPPC pod vlivem specifického mikroprostředí diferencují na dendritické, interdigitální buňky a epiteliálně-stromální elementy. Během diferenciace EPPC v brzlíku příjemce se spolu s vlastními molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) příjemce exprimují i molekuly MHC, které jsou geneticky podmíněny v buňkách dárce, tj. vzniká dvojí standard molekul MHC, podle kterého se realizuje pozitivní a negativní selekce T-lymfocytů.

K obnově efektorového spojení imunitního systému příjemce tedy dochází prostřednictvím známých mechanismů pozitivní a negativní selekce T-lymfocytů, ale prostřednictvím dvojího standardu molekul MHC - EPPC příjemce a dárce.

Reprogramování imunitního systému pomocí EPPC nejen umožňuje transplantaci buněk bez následného dlouhodobého užívání imunosupresiv, ale také otevírá zcela nové perspektivy v léčbě autoimunitních onemocnění a poskytuje oporu pro rozvoj nových myšlenek o procesu stárnutí člověka. Pro pochopení mechanismů stárnutí jsme navrhli teorii vyčerpání kmenových prostorů těla. Podle hlavního ustanovení této teorie je stárnutí trvalé zmenšení velikosti kmenových prostorů těla, které se chápou jako zásobárna regionálních („dospělých“) kmenových buněk (mezenchymálních, neuronálních, hematopoetických kmenových buněk, progenitorových buněk kůže, trávicího traktu, endokrinního epitelu, pigmentových buněk ciliárních záhybů atd.), doplňujících buněčné ztráty odpovídající tkáně v procesu remodelace těla. Remodelace těla je obnova buněčného složení všech tkání a orgánů díky buňkám kmenových prostorů, která pokračuje po celý život mnohobuněčného organismu. Počet buněk v kmenových prostorech je určen geneticky, což určuje omezenou velikost (proliferační potenciál) každého kmenového prostoru. Velikost kmenových prostorů zase určuje rychlost stárnutí jednotlivých orgánů, tkání a tělesných systémů. Po vyčerpání buněčných rezerv kmenových prostorů je intenzita a rychlost stárnutí mnohobuněčného organismu určena mechanismy stárnutí somatických diferencovaných buněk v rámci Hayflickova limitu.

Proto ve fázi postnatální ontogeneze může rozšíření kmenových prostorů nejen významně prodloužit život, ale také zlepšit kvalitu života obnovením remodelačního potenciálu těla. Rozšíření kmenových prostorů lze dosáhnout zavedením velkých dávek alogenních embryonálních pluripotentních progenitorových buněk za předpokladu, že je současně přeprogramován imunitní systém příjemce, což významně zvyšuje životnost starých myší v experimentu.

Teorie deplece kmenového prostoru může změnit stávající představy nejen o mechanismech stárnutí, ale také o samotném onemocnění a důsledcích jeho medikamentózní léčby. Zejména se onemocnění může vyvinout v důsledku patologie buněk kmenového prostoru (onkopatologie). Deplece rezervy mezenchymálních kmenových buněk narušuje procesy remodelace pojivové tkáně, což vede k výskytu vnějších známek stárnutí (vrásky, ochablost kůže, celulitida). Deplece rezervy kmenového prostoru endotelových buněk způsobuje rozvoj arteriální hypertenze a aterosklerózy. Zpočátku malá velikost kmenového prostoru brzlíku určuje jeho časnou trvalou věkem podmíněnou involuci. Předčasné stárnutí je důsledkem počátečního patologického zmenšení velikosti všech kmenových prostorů těla. Léková i neléková stimulace rezerv kmenových buněk zlepšuje kvalitu života zkrácením jeho délky, protože zmenšuje velikost kmenových prostorů. Nízká účinnost moderních geroprotektorů je způsobena jejich ochranným účinkem na stárnoucí diferencované somatické buňky, a nikoli na kmenové prostory těla.

Závěrem bychom rádi ještě jednou poznamenali, že regenerativně-plastická medicína je nový směr v léčbě lidských onemocnění založený na využití regenerativně-plastického potenciálu kmenových buněk. V tomto případě se plasticita chápe jako schopnost exogenních nebo endogenních kmenových buněk implantovat se a vést ke vzniku nových specializovaných buněčných klíčků v poškozených oblastech tkáně nemocného organismu. Předmětem regenerativně-plastické medicíny jsou fatální lidská onemocnění, která jsou v současnosti neléčitelná, dědičné patologie, onemocnění, u kterých metody tradiční medicíny dosahují pouze symptomatického účinku, a také anatomické vady těla, jejichž obnova je cílem rekonstruktivně-plastické regenerační chirurgie. Podle našeho názoru je příliš brzy považovat první pokusy o znovuvytvoření celých a funkčně kompletních orgánů z kmenových buněk za samostatnou oblast praktické medicíny. Předmětem regenerativně-plastické medicíny jsou kmenové buňky, které v závislosti na zdroji jejich získání mají různý regenerativně-plastický potenciál. Metodologie regenerativně-plastické medicíny je založena na transplantaci kmenových buněk nebo jejich derivátů.