Embryonální kmenové buňky

Objev embryonálních kmenových buněk nevznikl náhodou, ale objevil se na připravené půdě vědeckého výzkumu v oblasti vývojové biologie. Termín „kmenová buňka“ byl do medicíny zaveden v roce 1908 na kongresu hematologické společnosti v Berlíně Alexandrem Maximovem ve vztahu k hematopoetickým buňkám. Dlouho před izolací a produkcí stabilních linií pluripotentních embryonálních kmenových buněk byly kmenové terato-(embryokarcinomové) buňky používány ve studiích raných vývojových procesů, s jejichž pomocí byly studovány neznámé mechanismy embryogeneze, včetně sekvence exprese raných genů a proteinových produktů jejich aktivity.

Ale je totipotence lidského genomu v procesu evoluce nenávratně ztracena? Ne, a embryogeneze je toho důkazem. Pokud je tomu tak, kdy se pak v principu uskuteční druhá cesta evolučního vývoje? Pravděpodobně až člověk vstoupí do vesmíru, kde budou podmínky prostředí po dostatečně dlouhou dobu relativně konstantní. Ztráta kostní tkáně (demineralizace kostí ve stavu beztíže), která velmi pomalu podléhá remodelaci a regeneraci, může být považována za první krok v procesu adaptace člověka jako druhu na existenci v kosmických podmínkách. Cena za druhou cestu evolučního vývoje však bude jiná - cenou za návrat totipotence a absolutní plasticity všem buňkám bude sterilita. Takže v tomto světě „evolučních chameleonů“ se budeme muset rozmnožovat bez meiózy, pučením. Ale budeme žít dlouho. Telomerázová nesmrtelnost je nesmrtelností améby. V mnohobuněčném organismu jsou kmenové buňky substrátem kvantitativní a kvalitativní dlouhověkosti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Zdroje embryonálních kmenových buněk

Zdrojem embryonálních kmenových buněk pro laboratorní výzkum jsou dnes linie myšího teratokarcinomu (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) a lidského teratokarcinomu (klon NTERA-2, TERA-2, H-9), stejně jako linie Trauneon ESC. Dostupnost podrobného buněčného pasu s uvedením imunitního fenotypu, výsledků chromozomální analýzy, profilů exprese mRNA, exponovaných receptorů a intracelulárních signálních proteinů však nekompenzuje významné nedostatky linií ESC teratokarcinomu - rychlou ztrátu totipotence a nemožnost jejich použití v klinických studiích, zatímco smíšená diferenciace v kultuře velmi ztěžuje izolaci čisté specializované linie z heterogenní buněčné populace. Zdrojem linií ESC vytvářených pro klinické účely je proto obvykle vnitřní buněčná hmota blastocysty, jednotlivé blastomery embryí v 8buněčném stádiu, buňky moruly pozdějších stádií a také primordiální zárodečné buňky.

Je třeba poznamenat, že buňky teratokarcinomu, ačkoli mají vlastnost pluripotence, se vyznačují výrazně nižším pluripotentním potenciálem ve srovnání s embryonálními kmenovými buňkami (ESC). Jejich integrace s embryonálními buňkami zřídka vede k tvorbě chimér, které navíc nikdy netvoří gamety s genotypem buněk teratokarcinomu. Předpokládá se, že je to způsobeno častým výskytem chromozomálních abnormalit během kultivace buněk teratokarcinomu: ztráta chromozomu Y, různé trisomie, delece nebo translokace.

Pokusy o izolaci linie lidských embryí (ESC) byly opakovaně prováděny, ale tento úkol nebyl vyřešen, protože normální lidské blastocysty jsou obtížně dostupné. Kromě toho je četnost chromozomálních abnormalit u lidí vyšší než v embryogenezi u zvířat. Drtivá většina raných lidských embryí získaných po oplodnění in vitro vykazuje chaotickou chromozomální mozaiku a často má numerické a strukturní aberace. I později, ve stádiu blastocysty, se pouze 20–25 % lidských embryí skládá z buněk s normálním karyotypem. Použití takových embryí k vytvoření ESC bylo prakticky nemožné, protože zygoty byly obvykle kultivovány do stádia dvou nebo čtyř blastomer a poté transplantovány do dělohy. Teprve relativně nedávno byla vyvinuta spolehlivá technika pro kultivaci oplodněných lidských vajíček do stádia blastocysty. Zavedení této techniky do praxe oplodnění in vitro nejen zvýšilo četnost úspěšných implantací, ale také učinilo normální blastocysty dostupnějším objektem.

Dalším zdrojem pluripotentních kmenových buněk jsou primordiální zárodečné buňky, které na rozdíl od pokročilejších progenitorových populací zárodečného epitelu nemají na svém povrchu beta-integrin, ale exprimují vysokou aktivitu alkalické fosfatázy. Je třeba poznamenat, že populace kmenových buněk, které vznikly z primordiálních zárodečných buněk, jsou experimentálně studovány od 80. let 20. století. V té době byla vyvinuta technika pro izolaci primordiálních zárodečných buněk z rudimentu gonády myšího embrya. První neúspěšné výsledky kultivace primordiálních zárodečných buněk in vitro naznačovaly marnost těchto pokusů, protože buňky sice přežily, ale neproliferovaly a uhynuly během prvního dne. Později bylo zjištěno, že myší primordiální zárodečné buňky se in vitro reprodukují pouze za přítomnosti rozpustných a membránově vázaných specifických polypeptidových růstových faktorů v kultivačním médiu. Výsledky četných studií ukázaly, že pro přežití a proliferaci primárních zárodečných buněk je nezbytná přítomnost nejen LIF, ale také membránově vázaných a rozpustných Steel faktorů (SIF) v kultivačním médiu. Tyto peptidy jsou produkovány somatickými buňkami embryí homozygotních pro Steel mutaci a jeden z nich je ligandem protoonkogenu cKit.

Primární zárodečné buňky savců a lidí mají extragonadální původ a jsou zdrojem klonálního vývoje linie zárodečných buněk. Původem primordiální linie zárodečných buněk, stejně jako všech embryonálních tkání a extraembryonálního mezodermu, je epiblast (primární ektoderm) raných embryí, který má mozaikovou strukturní organizaci. Metodou mikrochirurgického odstranění různých částí raného embrya byla v epiblastu stanovena lokalizační zóna klonu komitovaných prekurzorů primordiálních zárodečných buněk. Pomocí rhodamin dextranu, který byl použit jako buněčný marker, bylo zjištěno, že prekurzory primordiálních zárodečných buněk jsou lokalizovány v proximální oblasti epiblastu, poblíž extraembryonálního ektodermu. Primordiální linie zárodečných buněk vzniká ze 45buněčného klonu, jehož alokace probíhá na samém začátku gastrulace. Poté se klon oddělí a během gastrulace vstupují primární zárodečné buňky do extraembryonálního mezodermu a nacházejí se na bázi rudimentu allantois, za primárním pruhem. Odtud migrují primární zárodečné buňky směrem k ventrální části endodermu zadního střeva a poté se aktivně pohybují podél mesenteria a na konci migrace osidlují genitální výběžky. Během migrace, stejně jako v prvních 2–3 dnech lokalizace v rudimentu gonády, se primární zárodečné buňky aktivně množí a procházejí osmi replikačními cykly. Pokud je na začátku migrace asi 50 primárních zárodečných buněk, pak v genitálních výběžcích myších embryí dvanáctidenního vývoje počet primárních zárodečných buněk přesahuje 25 000.

Funkční podobnost ESC a primordiálních zárodečných buněk je doložena úplnou integrací těchto buněk do blastocysty s nahrazením vnitřní buněčné hmoty a následným plnohodnotným vývojem embrya, jehož tkáně se skládají pouze z potomků primordiálních zárodečných buněk. V dalších vlastnostech se myší primordiální zárodečné buňky ukázaly být identické s ESC a prokázaly schopnost diferencovat se v různých směrech, tvořit embryoidní tělíska in vitro a tvořit teratomy in vivo při subkutánním podání imunodeficitním myším, což se podobá spontánním testikulárním teratomům u myší 129/ter.

Bylo zjištěno, že když se do média přidají LIF, membránově vázaný a rozpustný SIF, izolované primární zárodečné buňky 8denních myších embryí přežijí a reprodukují se v kultuře 4 dny, ale poté odumírají. Navíc období, kdy je v kultuře pozorována smrt primárních zárodečných buněk, se shoduje se stádiem vývoje myších embryí (12,5–13,5 dne), kdy samičí primární zárodečné buňky vstupují do meiózy v zárodcích pohlavních žláz a u samčích primárních zárodečných buněk je blokováno mitotické dělení. Pokud se však do média přidají nejen růstové faktory LIF a SIF, ale také FGF2, primární zárodečné buňky dále proliferují a v subkulturách se tvoří kolonie buněk schopných množení i po odstranění růstových faktorů (SIF a FGF) z média. Takové buňky lze dlouhodobě kultivovat na substrátu embryonálních fibroblastů bez přidání rozpustného růstového faktoru LIF. Bylo navrženo nazývat tyto stabilní buněčné linie získané z primordiálních zárodečných buněk embryonálními zárodečnými buňkami. Tento termín není vůbec úspěšný, protože při kultivaci EG buněk není možné získat embryonální zárodečné buňky schopné provádět následné fáze oogeneze nebo spermatogeneze. To je dáno tím, že EG buněčné linie sice pocházejí z primordiálních zárodečných buněk, ale v kultuře získávají vlastnosti embryonálních pluripotentních kmenových buněk, ale ztrácejí schopnost vázat se na zárodečné linie. Jinými slovy, primordiální zárodečné buňky po kultivaci ztrácejí vlastnosti prekurzorů gamet a transformují se do pluripotentních buněk podobných ESC.

Bylo zjištěno, že teratomy nevznikají, když jsou EG buňky zavedeny do imunodeficientních myší. Předpokládá se, že ztráta schopnosti lidských EG buněk vytvářet teratomy je způsobena skutečností, že tyto linie nebyly vytvořeny přímo z kultivovaných primárních zárodečných buněk, ale byly získány z buněk izolovaných z embryoidních tělísek. Je proto možné, že jsou potomky pluripotentních, ale již kommitovaných buněk.

Je třeba poznamenat, že mezi EG buňkami a primordiálními zárodečnými buňkami existují zásadní rozdíly. Ty neumožňují získání chimérických myších embryí, což naznačuje nedostatečnou schopnost primordiálních zárodečných buněk integrovat se do vnitřní buněčné hmoty nebo trofektodermu. Charakteristiky populace primordiálních zárodečných buněk se více podobají komitovaným liniím somatických buněk pozdějších embryí, jejichž zavedení do blastocysty také nevede k tvorbě chimérických embryí.

Modifikace techniky kultivace embryoidních tělísek získaných agregací EG buněk umožnila získat pomocí selekce na selektivních médiích další populaci pluripotentních buněk, nazývaných „buňky odvozené z embryoidních tělísek“ (EBD buňky). Schopnost EBD buněk dlouhodobě proliferovat v kultuře umožnila vytvořit stabilní buněčné linie kommitovaných buněk. Byly získány klony buněk exprimujících širokou škálu mRNA a proteinových markerů specializovaných buněk. Tento přístup nakonec prokázal, že lidské primární zárodečné buňky jsou pluripotentní a diferencují se in vitro na různé buněčné typy: neurony, neuroglie, cévní endotel, hematopoetické buňky, svalové a endodermální buňky.

Alternativní zdroje embryonálních kmenových buněk

Alternativním zdrojem lidských ESC linií mohou být hybridní buňky. Implantace heterogenního konstruktu získaného fúzí elektroporací somatických buněk lidského plodu s kravským vejcem, ze kterého byl předem odstraněn pronukleus, do dělohy pseudo-březích krav umožňuje získat vnitřní buněčnou hmotu z umělého embrya v preimplantačních stádiích vývoje. Za tímto účelem se v první fázi získá blastocysta z kravského vajíčka s transplantovaným jádrem lidské buňky.

Ve druhé fázi je z blastocysty izolován embryoblast a z něj jsou pomocí Thomsonovy metody izolovány ESC. Je pozoruhodné, že nejlepších výsledků při izolaci linií ESC touto metodou bylo dosaženo s použitím jader folikulárních buněk nebo primárních zárodečných buněk, které zůstávají v lidském těle ve stavu hibernace. To je dáno tím, že jádra lidských buněk transplantovaných do kravského vajíčka musí mít nezkrácené telomery a vysokou telomeázovou aktivitu, což pomáhá zabránit předčasnému stárnutí klonů ESC získaných z hybridního vajíčka (Repin, 2001). Je známo, že nejdůležitějšími intracelulárními markerovými proteiny ESC jsou Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, které patří mezi tzv. proteiny tlumiče chromatinu. Tlumiče poskytují obzvláště kompaktní balení heterochromatinu, které zabraňuje tvorbě euchromatinových smyček. Balení chromatinu zprostředkované těmito proteiny koreluje s totipotenci genomu ESC. Dosud bylo zjištěno, že zralé bovinní a lidské oocyty jsou jediným typem specializovaných buněk, které obsahují v cytoplazmě vysoké koncentrace tlumících proteinů. Na tomto základě byla vyvinuta metoda pro získání hybridních embryonálních kmenových buněk (ESC) přenosem jader somatických buněk do enukleovaných bovinních oocytů. Předběžné studie in vitro ukázaly, že cytoplazma bovinních oocytů po 12–24 hodinách kultivace obnovuje totipotenci genomu lidských somatických buněčných jader.

Obzvláště zajímavá jsou data o zvláštnostech preimplantačního vývoje lidských embryí, která naznačují pozdější nahrazení totipotentních buněk populací pluripotentních buněk než u myší. Studie buněčných transformací ukázala, že kromě embryonálních kmenových buněk (ESC) vznikají z buněk vnitřní buněčné hmoty lidských blastocyst také trofoblastové buňky, což naznačuje jejich celkovou potenci.

Je známo, že ve stádiu blastocysty vznikají dvě různě vázané buněčné populace. Jedna z nich tvoří vnější vrstvu blastocysty - trofektoderm, jehož deriváty jsou buňky trofoblastu a další embryonální složky placenty. Druhá populace buněk je seskupena do husté hmoty, která se dotýká vnitřního povrchu trofektodermu. Deriváty populace buněk vnitřní buněčné hmoty jsou všechny tkáně a rudimenty orgánů embrya. Ve stádiu pozdní blastocysty se z vnitřní buněčné hmoty tvoří extraembryonální endoderm a vzniká epiblast (primární ektoderm). V tomto případě si buňky epiblastu zachovávají pluripotenci, zatímco schopnost diferenciace buněk extraembryonálního endodermu je omezená.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Získání lidských embryonálních kmenových buněk

Až donedávna se věřilo, že je nemožné získat embryonální kmenové buňky (ESC) z trofoblastu. Linie diploidních kmenových buněk trofektodermu izolovaných z blastocysty však proliferuje a transformuje se na kmenové buňky v médiu obsahujícím FGF2 a heparin místo LIF. Pokud je FGF2 z média odstraněn, buňky trofektodermu se přestanou množit, začne v nich endoreduplikace chromozomů a buněčné elementy trofektodermu se postupně transformují na obří buňky trofoblastu. LIF pravděpodobně nestimuluje proliferaci buněk trofektodermu, protože FGF2 spouští jiný transsignální mechanismus, protože FGF2, vázající se na plazmatický receptor (FGFR2), aktivuje MAP kinázy v cytoplazmě - ERK1 a ERK2. V důsledku toho, když je v buňkách blastocysty aktivována jedna signální dráha (LIF - gpl30 - JAK kináza - STAT3), buňky vnitřní buněčné hmoty se transformují na pluripotentní embryonální kmenové buňky (ESC) a když je aktivován druhý mechanismus transmembránové signální transdukce (FGF2 - FGFR2 - MAP kináza ERK1/ERK2), v blastocystě se tvoří trofektodermální kmenové buňky. Volba signální dráhy zase závisí na aktivitě genu oct4. Tento gen, který patří do domény POU, se nachází v lokusu t autosomu 17 a je exprimován během oogeneze, během období štěpení, stejně jako v buňkách vnitřní buněčné hmoty blastocysty a v primárních zárodečných buňkách. Funkční rolí genu oct4 je kódovat transkripční faktor nezbytný pro vznik pluripotentních buněk, jejich diferenciaci a dediferenciaci.

Exprese genu oct4 v embryonálních kmenových buňkách (ESC) se liší v závislosti na interakci tohoto transkripčního faktoru s kofaktory. Řízená regulace exprese oct4 v blastocystách ukázala, že při snížení jeho aktivity polovina buněk tvoří trofektoderm, zatímco při zvýšení indukované exprese oct4 vznikají převážně ESC.

V experimentu nelze ESC přenést do linie během kultivace totipotentních blastomer ve fázi štěpení, stejně jako ve fázi gastrulace a pozdějších fázích embryonálního vývoje. Myší ESC se obvykle izolují 3,5-4,5 dne březosti, což odpovídá šestému (jednovrstvá blastocysta) a sedmému stádiu (dvouvrstvá blastocysta - raný vaječný válec) normální embryogeneze. Je zřejmé, že pouze v preimplantačním období myší embrya obsahují buněčné populace schopné transformace na ESC. V důsledku toho je izolace linií ESC možná pouze v určitých fázích embryogeneze. Zygota a blastomery vznikající během štěpení jsou totipotentní z hlediska možnosti vývoje životaschopného embrya s embryonálními membránami a placentou. Ztráta celkové potence zárodečných buněk začíná v pozdním stádiu moruly, kdy další vázání blastomer závisí na jejich umístění. Rané blastomery moruly si zachovávají totipotenci, protože experimentální manipulace se změnami v jejich lokalizaci, jako je inverze jejich umístění, nebrání vývoji plnohodnotného embrya.

Bylo zjištěno, že účinnost izolace embryonálních kmenových buněk (ESC) do linie je ovlivněna stavem blastocyst v době jejich explantace. Použití blastocyst po modelování sedmidenní diapauzy v reprodukčním traktu myší ovariektomovaných 3,5 dne březosti, kterým byl podán progesteron, usnadňuje úspěšnější izolaci linií embryonálních kmenových buněk. Předpokládá se, že za takových podmínek se zvyšuje počet blastomer tvořících vnitřní buněčnou hmotu. Je také možné, že se buněčný cyklus prodlužuje a většina blastomer vstupuje do fáze G0.

Kromě toho, vytvoření stabilních pluripotentních ESC linií závisí na genotypu embryí: ESC se poměrně snadno izolují z blastocyst myší linie 129, je mnohem obtížnější je získat pomocí myší CS7BL/6 a je prakticky nemožné izolovat ESC linii z blastocyst myší CBA/Ca. Je zřejmé, že raná embrya mají některé genetické vlastnosti, které ovlivňují vývoj pluripotentní ESC linie. Nicméně při kultivaci izolovaných epiblastů, stejně jako selektivním výběrem diferenciačních buněk, byly ESC linie izolovány z raných embryí myší CBA/Ca.

Osvědčená standardní technika pro získávání ESC linií z blastocyst je uvedena v laboratorních manuálech o technice experimentů s časnými embryi. Experimentální ESC linie lze také získat kultivací izolovaného epiblastu (primárního ektodermu) 4,5denních myších embryí za použití poměrně složité mikrochirurgické techniky a modifikovaných kultivačních podmínek. Pracovní náročnost tohoto postupu je opodstatněná, protože frekvence tvorby ESC linií se v tomto případě ukázala být výrazně vyšší než v pracích s vnitřní buněčnou hmotou blastocysty.

Pro izolaci ESC linií se každý klon přenese do mikrojamky, vypěstuje se agregát 40–60 buněk a poté se znovu dispergují. Vícenásobné opakování tohoto postupu nám umožňuje získat imortalizovanou ESC linii s maximální rychlostí proliferace normokaryotypických buněk připojených k plastu, které si po 50–100 pasážích zachovávají totipotenci a vysokou telomerázovou aktivitu. V procesu udržování ESC linií je největším nebezpečím kontaminace média nebo séra bakteriálními endotoxiny – i stopové koncentrace endotoxinu v kultivačním médiu způsobují hromadnou smrt nezralých zárodečných buněk. Při pečlivém sledování lineárního růstu a včasné disperzi jsou ESC v kultuře schopny symetrického dělení, při kterém obě dceřiné buňky zůstávají pluripotentní a schopné provádět neomezený počet buněčných cyklů, přičemž si zachovávají diploidní karyotyp a celkovou potenci.

Selekci čisté populace lidských ESC lze provést po transfekci jejich genomu rekombinantními molekulami DNA obsahujícími gen kódující syntézu zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Exprese GFP se zvyšuje, pokud jsou ESC pěstovány za podmínek podporujících jejich proliferaci, zatímco s nástupem diferenciace hladina exprese tohoto genu klesá, což umožňuje selekci čistých stabilních pluripotentních buněčných linií na selektivním médiu. Při kultivaci ESC izolovaných pomocí GFP selekce se frekvence tvorby kolonií mnohonásobně zvyšuje, protože silný antiproliferační účinek diferencovaných buněk je za podmínek selekčních kultur eliminován.

Translace lidských embryonálních kmenových buněk do linie se provádí metodou jejich izolace z preimplantačních embryí (ve stádiu 80-120 buněk), která zůstanou po oplodnění in vitro. Za tímto účelem se uměle získaná „přebytečná“ embrya mechanicky dispergují v Delbecco-Eagleově médiu. Po značení buněk selektivními monoklonálními protilátkami s fluorescenční značkou se izolují embryoblastové buňky. Embryoblast se disperguje do jednotlivých buněk pomocí směsi dispázy a kolagenázy. Disociované buňky se pěstují ve speciálním médiu (80% Delbeccovo médium + 20% fetální telecí sérum za přítomnosti 500 μg/ml IL-6, LIF a SCF) přes podpůrnou monovrstvu embryonálních fibroblastů z prvních 3 pasáží. V tomto případě je přežití a proliferace kmenových a progenitorových buněk zachována díky účinku IL-6, LIF a SCF. V takovém médiu rostou ESC jako suspenzní klony nepřipojených srolovaných buněk, které musí být disociovány měkkým, opakovaným pipetováním. Nové klony se v suspendované kultuře objevují 5. až 7. den. Maximální rychlost růstu ESC se dosahuje opakovanou disociací klonů ve stádiu 10–15 buněk. Poté se každý klon přenese do mikrojamky a kultivuje se do agregátu 40–50 buněk. Postup se v pasážích mnohokrát opakuje, čímž se objem kultury zvyšuje na hustotu 5–10 milionů buněk na 6cm misku. Pomocí takového pasážování Thomson izoloval 10 nesmrtelných klonů lidských ESC, které si po 100 pasážích zachovaly vysokou telomerázovou aktivitu, schopnost bujné proliferace, minimální fenotypové charakteristiky a celkovou účinnost se schopností diferencovat se na kteroukoli z 350 specializovaných buněčných linií odvozených z ekto-, mezo- a endodermu. Diferenciace lidských ESC začala (po změně média, přidání séra a eliminaci LIF) připojením buněk k substrátu, což naznačuje vývoj cytoskeletu a expresi adhezních receptorů. Důležité je, že i při neomezené proliferaci si lidské ESC zachovaly normální karyotyp.

Druhá metoda izolace lidských ESC linií je založena na použití primárních zárodečných buněk. Experimentální studie ukázaly, že linie E buněk lze získat z genitálních záhybů 12,5denních myších embryí. V těchto případech však byla frekvence tvorby progenitorových buněčných linií výrazně nižší než v experimentech s dřívějšími embryi. Zároveň primární zárodečné buňky z gonád myších embryí ve 13,5denním gestačním věku nejsou schopny se vůbec transformovat do linií.

První stabilní linie pluripotentních lidských EG buněk byly získány z primárních gonocytů izolovaných z gonád 5-9 týdnů starých embryí. Izolované buňky byly kultivovány na substrátu inaktivovaných myších embryonálních fibroblastů v médiu DMEM s fetálním sérem doplněným merkaptoethanolem, forskolinem a rekombinantními lidskými růstovými faktory (FGF a LIF). Po 7-12 dnech se v kultuře objevily mnohobuněčné kolonie, které morfologickými znaky a molekulárními markery odpovídaly lidským EG buňkám. Po agregaci tyto buňky vytvořily embryoidní tělíska, s jejichž dalším vývojem se objevily specializované buňky charakteristické pro deriváty všech tří zárodečných vrstev. V průběhu 10-20 pasáží si EG buněčné linie zachovaly normální karyotyp a neztratily pluripotenci.

Bylo také prokázáno, že kombinované působení LIF, membránově vázaných a rozpustných Steel faktorů a TGF-β mění vývojový program primordiálních zárodečných buněk. Místo toho, aby primordiální zárodečné buňky zastavily mitotické dělení a začaly se diferencovat směrem k oogenezi nebo spermatogenezi, pokračují v proliferaci. Po několika dalších mitotických cyklech se stanou podobnými buňkám epiblastů a ztrácejí vlastnosti prekurzorů zárodečných buněk a transformují se do pluripotentních embryonálních kmenových EG buněk.

V roce 1998 byly tedy z genitálního rudimentu tkáně lidského plodu z autopsie poprvé izolovány imortalizované linie primordiálních zárodečných buněk. V lidské embryogenezi se primordiální zárodečné buňky objevují ve žloutkovém vaku ve 3. týdnu vývoje a ve 4.–5. týdnu tyto buňky migrují do zóny genitálního tuberkulu, kde tvoří dormantní populace primárních gonocytů. V neaktivním stavu se primordiální zárodečné buňky v embryu uchovávají až do narození. Linie primordiálních zárodečných buněk se izolují z fetálního genitálního tuberkulu 5–9týdenních embryí, jejichž extrahovaná tkáň se ex tempore ošetří směsí kolagenáz typu IV–V, hyaluronidázy a DNázy pro zvýšení kvantitativního a kvalitativního výtěžku buněk. Primordiální zárodečné buňky v tkáni fetálního genitálního tuberkulu jsou obklopeny stromálními (mezenchymálními) Sertoliho buňkami. Funkčním účelem Sertoliho buněk je produkce antiapoptotických faktorů (ligand Fas), mitogenů a imunosupresiv, které chrání zárodečné buňky před imunitním útokem těla. Stromální mikroprostředí genitálního tuberkulu navíc hraje důležitou roli v zrání gamet. Izolované primární zárodečné buňky se v kultuře vysázejí na podpůrnou stromální vrstvu sestávající z fetálních fibroblastů z prvních tří pasáží. Nejúčinnější kombinací mitogenů je komplex sestávající z LIF, FGF a forskolinu (stimulátor tvorby cAMP). Proliferace primárních zárodečných buněk in vitro vyžaduje přidání fetálního séra, v jehož přítomnosti je reprodukce primárních gonocytů v kultuře doprovázena tvorbou klonů sférických buněk nepřipojených k substrátu.

V Národních institutech zdraví USA byl na základě shrnutí existujících údajů o metodách izolace linií lidských embryonálních kmenových buněk (ESC) z blastocyst učiněn předběžný závěr, že úspěšná izolace ESC je nejpravděpodobnější při kultivaci blastocyst s dobře vytvořenou vnitřní buněčnou hmotou (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Z tohoto hlediska je optimálním zdrojem ESC pro tvorbu linií lidské blastocysty 5. dne vývoje, ze kterých by měl být při izolaci vnitřní buněčné hmoty opatrně odstraněn trofektoderm. Izolovaná vnitřní buněčná hmota, v této fázi sestávající z 30–35 buněk, by měla být kultivována na substrátu z embryonálních myších fibroblastů, což je rozhodující podmínkou pro tvorbu kolonií ESC v kultuře.

Analýza fenotypových znaků embryonálních kmenových buněk

Obzvláště zajímavá je mezidruhová srovnávací analýza fenotypových znaků embryonálních kmenových buněk (ESC). Bylo zjištěno, že kolonie lidských ESC jsou husté shluky zploštělých buněk podobných epitelu, zatímco myší embryoidní těla se skládají z řídkého konglomerátu zaoblených buněk. V lidských ESC je index poměru jádra k plazmě nižší než v myších ESC. Embryonální kmenové buňky opic tvoří plošší kolonie buněk s nerovnými okraji. Jednotlivé buňky jsou snadno viditelné v raných klonech ESC primátů. Proliferující ESC všech studovaných druhů zvířat neexprimují molekuly MHC třídy I a II. Zároveň lidské ESC pozitivně reagují na protilátky TERA 1-60 a GCTM-2, což naznačuje přítomnost proteoglykanů keratin/chondroitin sulfát na jejich povrchu, charakteristických pro kmenové buňky embryo-(terato)-karcinomu. Exprese genu oct4 v ESC všech druhů zvířat naznačuje, že navzdory fenotypovým rozdílům je v lidských a myších ESC zřejmě aktivována stejná sada genů zodpovědných za udržení pluripotence (Peru, 2001). Kromě toho mají ESC linie izolované z embryí potkanů, prasat, králíků, primátů a skotu podobné morfologické vlastnosti, podobnou sadu molekulárních identifikačních markerů a téměř identický molekulární mechanismus pro implementaci programů embryogeneze, což nám umožňuje nový pohled na problém xenotransplantace.

Na rozdíl od normální embryogeneze in vivo není proliferace embryonálních kmenových buněk (ESC) in vitro doprovázena tvorbou zárodečných vrstev a probíhá na pozadí blokování homeotických Hoxgenů, tj. bez organogeneze. Vzhledem k tomu, že segmentační geny nefungují, není možné v kultuře ESC reprodukovat taková období embryogeneze, jako je kladení somitů, segmentace embrya, tvorba žloutkového vaku, allantois a dalších provizorních orgánů a tkání. Kultivované ESC jako by zmrazily na začátku procesu tvorby 350 restrikčních linií specializovaných buněk. Klon dceřiných progenitorových buněk a centrálně lokalizovaná ESC tedy představují pouze model embrya, během jehož vývoje se v různých oblastech tkání současně tvoří různé linie specializovaných buněk, které však pocházejí ze společných prekurzorů. Navzdory minimální hladině receptorů na povrchu ESC si zachovávají schopnost provádět primitivní morfogenetické procesy, které napodobují volumetrické struktury raného embrya: suspenze ESC v kultuře se agreguje a tvoří struktury připomínající blastocysty nebo i pozdější embrya (vaječné válce). Takové suspenzní agregáty se nazývají jednoduchá a komplexní embryoidní tělíska.

Ve smíšené diferenciaci jsou časné geny ektodermu (oct3, fgf-5, nodal), endodermu (gata-4), mezodermu (brachyury), kardiogenního mezodermu (pkh-2.5), neurální trubice (msx3) a hematopoézy (elkf) současně exprimovány v různých buňkách jednoho embryoidního tělíska. Použitím různých kombinací růstových faktorů a cytokinů pro cílené působení na tvorbu buněk zárodečné vrstvy in vitro bylo v řadě případů možné získat embryoidní tělíska, ve kterých byly přednostně exprimovány geny ektodermu nebo mezodermu, což otevírá cestu k modelování gastrulace a počátečních fází organogeneze.

Klonální růst ESC je důkazem asymetrického buněčného dělení, kdy si pouze jedna ESC ve středu klonu zachovává neomezený proliferační potenciál, zatímco druhá dceřiná buňka generuje generaci progenitorových buněk, které již procházejí diferenciací. Proto je rychlost proliferace klonů na periferii embryoidního těla vyšší než ve středu. Okrajové buňky rostoucího klonu procházejí spontánní neuspořádanou diferenciací, migrují nebo hynou apoptotickými mechanismy. Tyto události určují osud klonu: pokud rychlost proliferace překročí rychlost migrace a apoptotické buněčné smrti, klon se dále zvětšuje, ke stabilizaci dochází, když jsou rychlost apoptózy a rychlost tvorby nových buněk stejné, a k regresi dochází, když je poměr těchto procesů inverzní. Progenitorové buňky se dělí symetricky, tj. obě dceřiné buňky se následně diferencují na zralé specializované buněčné linie. Poměr ESC k progenitorovým buňkám se liší, ale počet ESC je vždy jen zlomkem procenta populace progenitorových buněk. Proto pouze pečlivé pipetování a včasná disagregace klonů může zvýšit počet ESC v kultuře. Disagregace klonů ve stádiu 10-12 buněk se ukázala jako nejúčinnější pro dosažení maximálního výtěžku ESC. Směr a stupeň diferenciace buněk v embryoidním těle závisí na jejich umístění. Vnější buňky embryoidního těla neexprimují gen oct4 a podléhají diferenciaci do buněk primárního endodermu, ze kterých se následně tvoří epiteliální buňky parietálního a viscerálního extraembryonálního endodermu. Vnitřní buňky embryoidního těla exprimují gen oct4 a zachovávají si pluripotenci po dobu 48 hodin kultivace. Kultura je však poté morfologicky restrukturalizována do epiteliální monovrstvy a začíná exprese genů řídících vývoj primárního ektodermu. Následně začíná proces totální neuspořádané cytodiferenciace s výskytem různých typů buněk, které jsou deriváty všech tří zárodečných vrstev. V procesu spontánní diferenciace buněk embryoidního těla se jako první objevují agregáty s endodermálními markery ve formě fragmentů (cyst) žloutkového vaku. V těchto strukturách se poté objevují angioblasty a endotelové buňky rostoucích kapilár. V závěrečných fázích spontánní diferenciace se z vnitřních buněk embryoidního tělíska vyvíjejí různé terminálně diferencované buňky, včetně neuronů, gliových elementů, kardiomyocytů, makrofágů a erytrocytů. Do určité míry (s přihlédnutím k prostorové inverzi tvorby vrstev zárodečné tkáně) je možné pomocí embryoidních tělísek studovat morfogenetické procesy in vitro a analyzovat molekulární mechanismy počátečních období embryonální cytodiferenciace.a také stanovit roli specifických genů při realizaci těchto procesů.

V rámci klonu se tedy nacházejí buňky, u kterých byly objeveny různé genetické vývojové programy - ESC, časné progenitory a diferencující se progenitorové populace. Kultivace ESC metodou visící kapky nebo masové kultivace bez podpůrné vrstvy a bez přidání LIF do média nevyhnutelně vede k tvorbě embryoidních tělísek. Morfologie buněk vnější a vnitřní vrstvy embryoidních tělísek se liší. Vnější vrstva se skládá z velkých, rozvětvených buněk. Jejich povrch směřující do prostředí je pokryt četnými mikroklky. Vnější vrstva buněk je od vnitřní vrstvy oddělena bazální membránou připomínající Reichertovu membránu, zatímco buňky vnitřní vrstvy embryoidních tělísek jsou tvořeny cylindrickým epitelem. Morfologicky se vnitřní vrstva, ačkoli obsahuje mnoho dělících se buněk, více podobá nediferencovaným koloniím ESC.

Charakteristika lidských embryonálních kmenových buněk

Absence parenchymatózně-mezenchymálních signálních interakcí na pozadí blokování genů homeózy vede k narušenému růstu embryonálních kmenových buněk (ESC) v kultuře, protože to narušuje tvorbu a vývoj infrastruktury provizorních orgánů. Neorganizovaný růst a narušená spontánní diferenciace ESC v kultuře jsou způsobeny absencí mezenchymálního značení stromální kostry budoucích orgánů: in vitro je docela možné vytvořit miliony hepatocytů, ale je nemožné získat jediný jaterní lalok, který by obsahoval takové strukturní a funkční prvky, jako jsou sinusy, Disseho prostory a Kupfferovy buňky.

Předpokládá se, že pluripotence embryonálních kmenových buněk (ESC) se realizuje výhradně v embryogenezi s tvorbou tkání a orgánů embrya, zatímco placenta a pupeční šňůra jsou deriváty trofoblastu. ESC uzavřené v trofektodermální membráně postupně generují klony provizorních buněk, které realizují vývojový program prostřednictvím kombinatorické mRNA volumetrické topografické matice Nochtejova syndromu, která předurčuje prostorové uspořádání, tvar a velikost, počet buněk provizorních a definitivních orgánů, jakož i sestavení parenchymu do strukturních a funkčních jednotek. Zároveň ESC zůstávají jediným typem buněk, u kterých je molekulární mechanismus realizace jejich potencí zcela odpojen od genetického vývojového programu a samotné ESC jsou zbaveny schopnosti interagovat s jinými buňkami v důsledku blokování jak receptorového vnímání, tak transsignálních systémů. Adekvátní aktivace ESC však vede k postupnému rozvoji embryogenezního programu, který končí zrozením plně formovaného organismu, sestávajícího z miliard buněk, připraveného k mimoděložnímu životu. Na této krátkodobé, ale nepředstavitelně dlouhodobé cestě v buněčném prostoru nevyhnutelně vznikají chyby jak v molekulárních mechanismech, které zajišťují životně důležitou činnost buněk, tak v programech, které řídí jejich proliferaci, diferenciaci a specializaci. Proto se v moderní farmakogenomice onemocnění molekulární struktury a onemocnění buněčného programování posuzují odděleně. Navíc působení většiny nových léků je zaměřeno na korekci programů diferenciace, proliferace a organogeneze, stejně jako na regeneraci orgánů a tkání. V dospělém organismu umožňují embryonální kmenové buňky (ESC) řídit chování kmenových/progenitorových buněk transplantovaných do mozku, jater, sleziny, kostní dřeně a dalších lidských orgánů s cílem obnovit poškozený parenchym orgánů příjemce diferenciací a specializací dárcovských buněk na zachované mezenchymální matrici. V podstatě se program totipotence začíná realizovat na úrovni genomů oocytů, zygot a blastomer; tyto buňky však dosud nebyly klonovány a pasážovány v množství nezbytném pro potřeby experimentální i praktické medicíny. ESC proto zůstávají jedinečným zdrojem genetické informace obsahující kódy pro trojrozměrnou mapu embrya a kódy pro lineární restrikci specializovaných buněčných linií během gastrulace.

Prakticky neomezený regenerační potenciál embryonálních kmenových buněk (ESC) je dán skutečností, že jejich genom si na rozdíl od genetického aparátu diferencovaných somatických buněk zachovává pluripotenci. Jedním z projevů dormantního stavu genetické informace obsažené v ESC je tzv. minimální fenotyp - na povrchu ESC je exprimován omezený počet receptorů, a proto je pro interakci jaderného aparátu buňky s jejím mikroprostředím nasazeno jen velmi málo transsignálních programů. Na pozadí hibernace genů zodpovědných za restrikci specializovaných buněčných linií a buněčnou diferenciaci je aktivováno pouze asi 30 z 500 genů, jejichž produkty zajišťují spojení buňky s okolním mikroprostředím. Metodou sériové analýzy genové exprese bylo prokázáno, že při společné práci hlavních funkčních boxů genomu regulujících energetiku a metabolismus v somatických buňkách a ESC mají ESC velmi nízkou hladinu mRNA receptorů, G proteinů, sekundárních poslů, transkriptáz, kofaktorů exprese a represe, tj. celého systému transmembránového přenosu regulačního signálu do buňky. To je způsobeno absencí nebo velmi nízkou expresí transsignálních genů. Během období indukované diferenciace v genomu ESC synchronně přestane fungovat 18 funkčních genů na pozadí aktivace 61 transsignálních genů řídících syntézu receptorů buněčné adheze, složek extracelulární matrix, restrikčních transkriptáz a messengerových prvků systému přenosu signálu do jaderného aparátu z receptorů buněčné plazmatické membrány. Současně je blokována exprese genů zodpovědných za syntézu tlumicích proteinů a také koinhibitorů genové exprese, které zajišťují totipotenci genomu ESC.

Genové markery byly nalezeny u buněk všech tří zárodečných vrstev. Identifikace ektodermální buněčné vrstvy se provádí expresí genů nodal, oct3 a fgf-5, mezodermálních buněk - geny brachyury, zeta-globin, endoderm - expresí genu gata-4. V normální embryogenezi během gastrulačního období je pozorována aktivní migrace nezralých populací kmenových a progenitorových buněk, které lokálně značí vývojové zóny obličejových kostí lebky, některých částí mozku, periferního nervového systému, srdečního převodního systému a brzlíku, jejichž tkáně jsou tvořeny z klonů migrujících buněk. Značení buněk časnými geny zárodečných vrstev usnadňuje topografickou analýzu procesů migrace prekurzorových buněk ve vyvíjejícím se embryu. Zejména bylo zjištěno, že v agregátech buněk embryokarcinomu P19 začíná exprese prvního mezodermálního genu brachyurie v období snížené exprese genů tkáňového aktivátoru plazminogenu, a-fetoproteinu, keratinu 8 a keratinu 19, které jsou markery prvních migrujících mezodermálních populací. V důsledku toho začíná tvorba tkání mezodermálního původu až po dokončení procesu bodové migrace a disperze mezodermálních progenitorových buněk.

Navzdory extrémně omezeným fenotypovým rysům a absenci většiny trans-signálních jednotek, ESC stále exprimují některé receptorové molekuly, které lze použít k jejich identifikaci. Je pozoruhodné, že markerové antigeny ESC u lidí a primátů se ukázaly jako běžné. Nejčastěji se pro značení ESC používají značené protilátky proti membránově vázaným antigenům SSEA-3, SSEA-4 (unikátní lipidové antigeny představující komplex glykolipidu GL7 s kyselinou sialovou), stejně jako vysokopolymerní glykoproteiny TRA-1-81, TRA-1-60. Kromě toho ESC exprimují specifický embryonální antigen SSEA-1 a endogenní alkalickou fosfatázu, stejně jako specifický transkripční faktor Oct4. Ten je nezbytný pro udržení mechanismů proliferace ESC - specifický transkripční faktor Oct4 aktivuje expresi genu fibroblastového růstového faktoru 4 a stabilizuje expresi boxu genů zodpovědných za neomezenou replikaci DNA v nezralých buňkách. Nejdůležitějšími intracelulárními markerovými proteiny jsou Oct3, Oct4, Tcf a Groucho, které souvisejí s proteiny tlumiči chromatinu.

Téměř okamžitě po mnoha letech úspěšných pokusů o kultivaci embryonálních kmenových buněk (ESC) mimo tělo a po získání prvních kultur kmenových buněk izolovaných z myších blastocyst a kultur primárních zárodečných buněk začala fáze výzkumu pluripotentního potenciálu ESC, když byly zavedeny do embryí v raných stádiích vývoje. Bylo prokázáno, že ve stádiu moruly a blastocysty jsou ESC schopny tvořit chimérická embrya, ve kterých jsou potomci dárcovských ESC detekováni ve všech somatických tkáních a dokonce i v gametách. Ve vývojové biologii tak byl s využitím ESC vytvořen „most“ mezi experimentálními studiemi in vivo a in vitro, což významně rozšířilo možnosti studia procesů ukládání primárních tkání a orgánů, jejich diferenciace a embryonální organogeneze.

Je jasně prokázáno, že in vivo během embryogeneze jsou embryonální kmenové buňky (ESC) integrovány do buněčné hmoty raného embrya a jejich deriváty se nacházejí ve všech orgánech a tkáních. ESC kolonizují linii zárodečných buněk v chimérickém embryu, jehož potomci tvoří plnohodnotná vajíčka a spermie. Embryonální kmenové buňky jsou klonogenní – jedna ESC je schopna vytvořit geneticky identickou kolonii buněk s molekulárními markery, mezi které patří exprese genu oct4 a alkalické fosfatázy, vysoká aktivita telomerázy a exprese určitých embryonálních antigenů.

Pro studium mechanismů embryogeneze s využitím embryonálních kmenových buněk (ESC) byla vyvinuta metoda chimerizace morul vytvořením biologického konstruktu, vně kterého se nachází vrstva tetraploidních blastomer příjemce a dovnitř jsou zavedeny ESC dárce. Z potomků tetraploidních blastomer příjemce se tak tvoří trofoblast, který zajišťuje implantaci a placentaci, a ESC dárce fungují jako vnitřní buněčná masa, ze které se tvoří tělo životaschopného embrya a linie primárních progenitorových zárodečných buněk. Výzkumná hodnota ESC spočívá nejen v tom, že při in vitro manipulacích s jejich genomem je zachována pluripotence, ale také v tom, že je zachována schopnost ESC podílet se na tvorbě primárních zárodečných buněk chimérického embrya. Bylo prokázáno, že potomci pouze jedné geneticky modifikované ESC osídlují všechny primární rudimenty a vyvíjející se tkáně chimérického embrya získaného agregací nebo kokultivací této buňky s 8buněčným embryem. Když byly ESC transfekované genem pro zelený fluorescenční protein transplantovány do moruly myší, byli fluorescenční potomci této buňky nalezeni ve všech studovaných tkáních vyvíjejícího se embrya (Shimada, 1999). Transplantace ESC do moruly umožňuje vytvoření životaschopných myší, jejichž organismus se skládá pouze z potomků dárcovské ESC, což otevírá perspektivy pro různé možnosti terapeutického klonování. Tento metodologický přístup se nyní úspěšně používá ke studiu problémů vývojové biologie, zejména se používá k analýze mechanismů genetické inaktivace chromozomu X nebo epigenetické nestability ESC. Transplantace ESC do raného embrya se také používá v zemědělské biotechnologii a také v experimentech genové terapie.

Transplantace geneticky modifikovaných embryonálních kmenových buněk (ESC) se používá k testování cílových buněk mutantních genů. ESC kultivované in vitro se používají v biotechnologiích k vytvoření knockout myší. Za tímto účelem se studovaný gen z ESC odstraní homologní rekombinací (knockoutem) a buňky, kterým tento gen chybí, se izolují na selektivním médiu. Knockoutované ESC se poté zavedou do blastocysty nebo se agregují s blastomerami moruly. Chimérická raná embrya získaná tímto způsobem se transplantují do recipientních samic a z novorozených myší se vyberou jedinci s gametami nulizygotními pro daný gen. Tato technologie byla použita k vytvoření mnoha linií knockout myší, které se široce používají v experimentální biologii a experimentální medicíně. Takové biologické modely se používají ke studiu významu určitých genů v embryonálním vývoji, stejně jako jejich role v mechanismech lidských onemocnění a patologických stavů. Kromě toho se knockoutované zvířecí linie používají v preklinickém testování nových metod genové terapie. Například transfekcí normální alely mutantního genu do genomu ESC je možné účinně korigovat mutaci ovlivňující hematopoetický systém. Zavedení cizích genů do ESC umožňuje rychlé vytváření linií homozygotních transgenních laboratorních zvířat. Je však třeba poznamenat, že technika cílené rekombinační delece genů byla dosud spolehlivě vyvinuta pouze ve vztahu k myším ESC. Pomocí dvojitě knockoutovaných myších ESC byla stanovena funkční role oblasti genového klastru na chromozomu 7 (kopie genomové oblasti na lidském chromozomu 19) a proximální oblasti chromozomu 11 (kopie lidského chromozomu 5g) - delece těchto genů v myších ESC umožnila vyhodnotit funkci jejich analogů u lidí.

Rozšířily se možnosti studia funkce genů lidské embryogeneze, jejichž transfekce do genomu embryonálních kmenových buněk (ESC) laboratorních zvířat umožnila zejména objasnit roli krypto genu při tvorbě a vývoji kardiogenního mezodermu, genu pax-6 - v embryogenezi oka. Sestavují se první mapy genové exprese v nezralých proliferujících ESC teratokarcinomu a blastocyst myší a byla potvrzena supresivní represe transsignálních genů v ESC. Kombinace 60-80 mutantních ESC a 20-30 buněk normálních preimplantačních myších embryí vede k vývoji chimérických embryí, v nichž orgánové primordie sestávají z dárcovských a recipientních buněk, což umožňuje objasnit roli neznámých genů v gastrulaci a organogenezi. Funkční mapa genů vyvíjejících se myších embryí byla doplněna informacemi o roli genu sf-1 při tvorbě nadledvin a pohlavních žláz, genu wt-1 při tvorbě ledvin, genů rodiny myoD při tvorbě kosterního svalstva a genů rodiny gata-1-4 při restrikční maturaci základů erytropoézy a lymfopoézy.

Řízené vypínání mateřských a otcovských alel genů v ESC pomocí vektorových rekombináz umožnilo objasnit funkce různých genů v raném období embryogeneze a technologie řízeného přenosu neznámých lidských genů do myších ESC přispívá k objevu nových mutantních genů zodpovědných za rozvoj závažné dědičné patologie. Pomocí metody knockout byl stanoven obligatorní význam některých genů pro tvorbu embryonálních tkání: gata-4 - pro myokard, gata-1 - pro erytroidní linii hematopoetické tkáně, myoD - pro kosterní svaly, brachyurie - pro mezoderm, restrikční transkriptázy hnf3 a hnf4 - pro jaterní kmenové buňky, rag-2 - pro tvorbu klonů T- a B-lymfocytů (Repin, 2001). Dvojitá delece genů v ESC otevřela přístup ke studiu funkční role genů zárodečné vrstvy, segmentace a homeózy a transplantace ESC umožnila získat životaschopná mezidruhová hybridní embrya. Pomocí vylepšené techniky transplantace jediné dárcovské ESC do 8buněčného embrya byl prokázán fakt chimerizace na buněčné úrovni mnoha orgánů recipientního embrya. Je třeba poznamenat, že po zavedení lidských hematopoetických kmenových buněk do blastocysty byly v orgánech recipientních myší nalezeny buněčné klíčky lidské tkáně. Bylo zjištěno, že pluripotentní ESC cirkulují v krvi myších embryí během období tvorby orgánů. Je možné, že jejich biologická funkce spočívá v embryonální organizaci budoucího imunitního systému. S pomocí ESC byly v laboratorních podmínkách reprodukovány adekvátní modely lidské genetické patologie: dvojitý knockout genu pro dystrofin modeluje Duchennovu svalovou dystrofii u myší a vypnutí genu atm (kontrola syntézy chromatinového signálního kinázy) - ataxii-teleangiektázii. U tohoto smrtelného dědičného onemocnění u dětí se v důsledku defektů v reparaci DNA vyvíjí degenerace Purkyňových buněk v mozečku, která je doprovázena involucí brzlíku v důsledku smrti proliferujících buněk. Klinický obraz, patofyziologie a patomorfologie ataxie-telangektázie, reprodukované zavedením patologické genetické informace do embryonálních kmenových buněk (ESC), u chimérických myší odpovídají těm u lidí. Kromě ataxie-telangektázie byly s využitím ESC a knockout myší vyvinuty experimentální modely některých dědičných homozygotních lidských onemocnění spojených s patologií metabolismu sacharidů a lipidů, katabolismu aminokyselin a vylučování mědi a bilirubinu, což významně rozšířilo možnosti experimentální medicíny ve fázi preklinického testování nových metod léčby odpovídajících lidských onemocnění.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Použití cytohybridů kmenových buněk

Hybridní buňky získané fúzí ESC se somatickými buňkami jsou adekvátním a slibným modelem pro studium pluripotence kmenových buněk a reprogramování chromozomů diferencovaných buněk. Cytohybridy získané fúzí ESC s diferencovanými buňkami dospělého zvířete umožňují studovat vztahy mezi genomy různého „věku“: jedinečná situace nastává, když se homologní chromozomy pocházející z buněk v různých stádiích diferenciace a různém stupni zralosti nacházejí ve stejném jádru, kde si mohou snadno vyměňovat trans-působící regulační signály. Je obtížné předpovědět, jak budou cisregulační epigenetické systémy homologních chromozomů, vytvořené během individuálního vývoje, reagovat na vliv trans-působících signálů vycházejících z embryonálně příbuzných genomů. Kromě toho v hybridních buňkách dochází k segregaci rodičovských chromozomů, což nám umožňuje studovat interakci genomů na úrovni jednotlivých chromozomů, tj. potenciálně identifikovat účast specifických chromozomů na udržení pluripotence nebo naopak na přechodu k diferenciaci.

Cytohybridy získané fúzí pluripotentního teratokarcinomu a diferencovaných somatických buněk byly použity jako první experimentální model pro studium interakce genomů s různou „vývojovou historií“. V některých případech si takové hybridní buňky zachovaly pluripotentní vlastnosti na poměrně vysoké úrovni. Zejména in vivo hybridní buňky teratokarcinomu a somatických buněk indukovaly vývoj pravých teratomů obsahujících deriváty všech tří zárodečných vrstev a in vitro v suspenzních kulturách tvořily embryoidní tělíska. I u interspecifických cytohybridů tohoto typu byla zaznamenána přítomnost embryonálních antigenů v případech, kdy somatickými partnery při fúzi s buňkami teratokarcinomu byly lymfocyty nebo thymocyty. Je pozoruhodné, že cytohybridy vytvořené fúzí buněk teratokarcinomu s fibroblasty odpovídaly fibroblastům fenotypem.

Nejdůležitějším zjištěným faktem je, že v hybridních buňkách teratokarcinom-somatické buňky se objevily známky přeprogramování diferencovaného buněčného genomu, které bylo charakterizováno reaktivací buď jednotlivých genů, nebo neaktivního chromozomu X somatického partnera. Výsledky studií cytohybridů typu teratokarcinom-somatické buňky tedy naznačují, že v hybridních buňkách je často zachována pluripotence a existují známky přeprogramování genomu somatického partnera.

V experimentech se získáváním intraspecifických embryonálních hybridních buněk fúzí myších ESC s dospělými splenocyty byly studovány vlastnosti těchto cytohybridů, analyzována segregace rodičovských chromozomů a posouzena pluripotence hybridního genomu. Intraspecifické hybridní buňky získané fúzí buněk teratokarcinomu se somatickými buňkami se obvykle vyznačují nízkou úrovní segregace chromozomů s tetraploidním nebo téměř tetraploidním karyotypem. Podobné chromozomální složení bylo pozorováno u cytohybridů během fúze primárních zárodečných buněk s lymfocyty. Zároveň interspecifické hybridní buňky získané fúzí buněk myšího teratokarcinomu s norkovými lymfocyty vykazovaly intenzivní segregaci chromozomů somatického partnera.

Kvalitativně nová etapa ve studiu segregace rodičovských chromozomů u intraspecifických hybridů začala po vývoji metody pro analýzu mikrosatelitů pomocí polymerázové řetězové reakce, díky které bylo u každého myšího chromozomu nalezeno několik stovek markerů, což umožňuje spolehlivé rozlišení jakéhokoli páru homologních chromozomů v hybridních buňkách.

Fúzí embryonálních kmenových buněk (HM-1 buňky s deficitem aktivity hypoxanthin-fosforibosyltransferázy, 2n = 40, XY, izolované z blastocyst myší 129/01a) se splenocyty kongenních myší DD/c bylo možné získat sadu hybridních klonů morfologicky podobných ESC. Všechny klony byly izolovány na selektivním médiu, ve kterém mohou růst pouze buňky s aktivní hypoxanthin-fosforibosyltransferázou. Elektroforetická analýza ukázala, že všechny klony měly alelickou variantu hypoxanthin-fosforibosyltransferázy charakteristickou pro myši DD/c. Cytogenetická analýza ukázala, že tři ze čtyř hybridních klonů měly téměř diploidní sadu chromozomů. Jeden téměř tetraploidní klon obsahoval dvě populace hybridních buněk, z nichž jedna byla tetraploidní a druhá, menší, diploidní.

Mikrosatelitní analýza, která umožňuje rozlišení libovolného páru homologních chromozomů myší 129/01a a DD/c v hybridních klonech s téměř diploidní sadou, ukázala, že ve dvou klonech došlo k jasné preferenční eliminaci autosomů somatického partnera. Většina autosomů v klonech HESS2 a HESS3 měla markery linie 129/01a, tj. pluripotentního partnera. Výjimkou byly chromozomy 1 a I: v klonech HESS2 a HESS3 byly spolu s markery buněk HM-1 přítomny v malém množství i markery somatického partnera. Tyto výsledky mohou odrážet neúplnou segregaci chromozomů 1 a I somatického partnera a jsou v souladu s cytogenetickými údaji, že trizomie pro tyto chromozomy je pozorována u 30–40 % buněk klonů HESS2 a HESS3. Klon HESS4 se významně lišil ve svém chromozomálním složení: mnoho autosomů v tomto klonu pocházelo z genomu ESC (chromozomy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 a 17), ale chromozomy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 a 19 byly reprezentovány homology obou rodičů. Kvantitativní poměr mikrosatelitů označujících tyto homologní chromozomy byl přibližně 1:1. To autorům umožnilo předpokládat, že jeden homolog pochází z genomu ESC a druhý z diferencovaných buněk. V některých subklonech klonu HESS4 byly přítomny pouze markery chromozomů 18 a 19 somatického partnera. Získané výsledky naznačují, že v buňkách klonu HESS4 došlo kromě segregace chromozomů somatického partnera k eliminaci jednoho nebo obou homologů výše uvedených chromozomů pluripotentního genomu, tj. došlo k bilaterální segregaci chromozomů obou rodičů - což je velmi neobvyklý jev, protože segregace chromozomů pouze jednoho z rodičů je charakteristická pro cytohybridy.

Navíc po 20. pasáži všechny klony hybridních buněk obsahovaly pouze markery chromozomu X somatického partnera, tj. chromozom ESC X byl v klonech nahrazen chromozomem X somatického partnera. Tuto důležitou skutečnost potvrzují data in situ hybridizace s použitím FITC-značené sondy specifické pro myší chromozom X: pozitivní signál byl detekován pouze na jednom chromozomu. Je třeba poznamenat, že v dřívějších fázích kultivace (před 15. pasáží) podle cytogenetických dat mnoho buněk obsahovalo dva chromozomy X. Použití selektivních médií proto umožňuje manipulovat s chromozomálním složením hybridních buněk a selektivně selektovat klony nesoucí jednotlivé chromozomy somatického partnera na pozadí genomu ESC.

Vzhledem k tomu, že unikátním rysem cytohybridního genomu je lokalizace rodičovských genomů v jednom jádře, přirozeně vyvstává otázka zachování pluripotentních vlastností embryonálního genomu u hybridů ESC a somatických buněk za podmínek jeho těsného kontaktu s genomem diferencované buňky. Morfologicky byly cytohybridy ESC a somatických buněk podobné rodičovské linii ESC. Hodnocení pluripotence ukázalo, že všechny klony s téměř diploidní sadou chromozomů byly schopny tvořit embryoidní tělíska v suspenzních kulturách, ve kterých byly přítomny deriváty tří zárodečných vrstev.

Většina hybridních buněk obsahovala antigen ECMA-7, marker charakteristický pro raná myší embrya, a také měla vysokou aktivitu alkalické fosfatázy. Nejpřesvědčivější údaje o vysokých pluripotentních vlastnostech hybridních buněk byly získány v experimentech se získáním série injekčních chimér zahrnujících hybridní buňky klonu HESS2. Analýza biochemických markerů ukázala, že potomci dárcovských hybridních buněk byli přítomni ve většině tkání chimér. Hybridní buňky získané fúzí embryonálních kmenových buněk (ESC) a somatických diferencovaných buněk si proto zachovávají vysokou pluripotenci, včetně schopnosti tvořit chiméry při injekci do dutiny blastocysty.

Klony HESS2 a HESS4 se významně lišily ve složení rodičovských chromozomů, ale měly podobné pluripotentní vlastnosti. Dalo by se předpokládat, že pluripotence v hybridním genomu se projevuje jako dominantní znak, ale je možné, že ne všechny chromozomy embryonálního genomu jsou zapojeny do procesu udržování pluripotence. Pokud je tento předpoklad správný, pak lze očekávat, že eliminace některých chromozomů pluripotentního partnera z genomu hybridních buněk nebude doprovázena změnou jejich pluripotentního statusu. V tomto případě by nám analýza segregace rodičovských chromozomů v embryonálních hybridních buňkách umožnila blíže se přiblížit k identifikaci chromozomů zodpovědných za kontrolu pluripotence embryonálních buněk.

O. Serov a kol. (2001) nenalezli žádné potomky mezi 50 potomky získanými křížením chimér s normálními myšmi, které měly myší genotyp 129/01a a nesly chromozom X myší DD. Autoři se domnívají, že je to způsobeno snížením pluripotence v hybridních buňkách pod vlivem somatického genomu. Alternativním vysvětlením může být negativní vliv trisomie na některé autosomy a nerovnováha pohlavních chromozomů (XXY byly pozorovány v buňkách až do 15. pasáže) v hybridních buňkách během meiózy. Je známo, že buňky XXY nejsou schopny podstoupit meiózu a tvořit gamety. Trisomie může také způsobit snížení proliferativní aktivity hybridních buněk, v důsledku čehož selektivní výhodu ve vývoji chimér mohou mít buňky recipientního embrya. Z toho vyplývá, že pro adekvátní posouzení pluripotentního potenciálu hybridních buněk je nutné získat hybridní klony s normální diploidní sadou chromozomů.

V experimentech O. Serova a spoluautorů (2001) byla poprvé prokázána možnost přeprogramování chromozomu X somatické buňky v genomu hybridních buněk. Tento závěr autorů vyplývá z analýzy exprese genu hprt (marker chromozomu X) u chimér: přítomnost alelické varianty hprt myší DD/c byla detekována ve všech analyzovaných chimérických tkáních. Je vhodné zdůraznit, že po zavedení hybridních buněk do dutiny blastocysty se cytohybridy dostávají do neselektivních podmínek a zachování chromozomu X v genomu hybridních buněk znamená, že se stal jejich obligátní složkou a genom jej nerozlišuje od chromozomu Y pluripotentního partnera.

Autoři shrnují výsledky analýzy interakce somatických a pluripotentních genomů v hybridních embryonálních buňkách a docházejí k závěru, že u některých cytohybridů se pluripotence projevuje jako dominantní znak. Hybridní genom je schopen reprogramovat jednotlivé chromozomy diferencovaných buněk, což však nevylučuje možnost reverzního vlivu somatického genomu na pluripotenci embryonálního genomu. Při kultivaci hybridních buněk dochází k indukci diferenciace výrazně častěji než v původní rodičovské linii ESC HM-1. Podobný efekt je pozorován i během tvorby primárních kolonií: mnoho primárních kolonií embryonálních hybridních buněk se diferencuje v raných fázích tvorby s velkými ztrátami klonů během jejich selekce a reprodukce.

Cytohybridy vytvořené fúzí embryonálních kmenových buněk (ESC) se somatickými buňkami si tedy i přes těsný kontakt s genomem diferencovaných buněk zachovávají pluripotenci jako jedinečnou vlastnost embryonálního genomu. Navíc je v takových hybridních buňkách možné přeprogramování jednotlivých chromozomů pocházejících z diferencovaných buněk. Zůstává nejasné, do jaké míry jsou v hybridních buňkách zachovány pluripotentní vlastnosti embryonálního genomu, zejména jejich schopnost podílet se na tvorbě zárodečné linie u chimér. To vyžaduje získání embryonálních hybridních buněk s normálním karyotypem. V každém případě se pluripotentní embryonální hybridní buňky mohou stát skutečným genetickým modelem pro identifikaci chromozomů zapojených do udržování pluripotence nebo její kontroly, protože bilaterální segregace rodičovských chromozomů takovou příležitost potenciálně poskytuje.

Neméně atraktivní je studium jevu, který O. Serov a kol. (2001) definují jako „chromozomální paměť“. V hybridním genomu se homologní chromozomy nacházejí ve dvou alternativních konfiguracích: homology somatického partnera již jednou prošly diferenciací, zatímco u homologů pluripotentního partnera tento proces teprve začíná. Zachování vysokých pluripotentních vlastností hybridními buňkami tedy naznačuje, že „pluripotentní“ konfigurace ESC homologů je v hybridním genomu dostatečně stabilní, a to i přes vliv transakčních faktorů vycházejících ze somatického partnera. Výše popsané znaky přeprogramování homologních chromozomů diferencovaného genomu během vývoje chimér nevylučují možnost, že si v prvních fázích tvorby a kultivace cytohybridů in vitro zachovají svůj status získaný během diferenciace in vivo. Podle nedávno získaných údajů vykazují embryonální hybridní buňky při přenosu do neselektivního prostředí intenzivní eliminaci chromozomů pouze somatického partnera, tj. genom hybridních buněk snadno rozlišuje homology po kultivaci in vitro po dobu 10–15 pasáží. Embryonální hybridní buňky tak představují slibný experimentální model pro studium nejen takové zásadní vlastnosti embryonálního genomu, jako je pluripotence, ale i její alternativy - embryonální diferenciace.

Terapeutická účinnost transplantace embryonálních kmenových buněk

Před analýzou terapeutické účinnosti transplantace embryonálních kmenových buněk (ESC) a jejich derivátů shrneme výše uvedený materiál. Schopnosti ESC z hlediska plné realizace embryogeneze in vitro jsou nedostatečné, protože vývojové vady jsou v tomto případě způsobeny absencí mezenchymálních kmenových buněk, které v těle vznikají autonomně a nezávisle na ESC. Genetický potenciál ESC je menší než genetický potenciál zygoty, proto se ESC nepoužívají přímo pro klonování embryí. Unikátní biologický potenciál ESC jako jediných buněk, ve kterých jsou vývojové programy plně nasazeny v konzistentní implementaci, se využívá ve studiích genových funkcí. S pomocí ESC se dekódují první kombinace signálů aktivujících expresi časných a pozdních genů kódujících vývoj tří zárodečných vrstev. Zachování pluripotence genomu ESC in vitro z nich činí unikátní nástroj pro reparativní regeneraci, schopný automaticky doplňovat buněčné ztráty v případě poškození orgánů a tkání. V ideálním hypotetickém scénáři lze předpokládat, že „...při transplantaci dárcovských ESC jsou do těla příjemce přeneseny kompaktně sbalené programy, které se za příznivých podmínek realizují při konstrukci nové tkáně“7, schopné „...účinně se integrovat do těla příjemce na morfologické i funkční úrovni.“

Přirozeně, po vývoji metod monodiferenciace embryonálních kmenových buněk (ESC) začala in vivo studie funkční aktivity buněk získaných in vitro z jednoho specializovaného klonu. Proliferující klon ESC generuje populace migrujících progenitorových buněk, které jsou skutečně schopné aktivně se integrovat do oblastí poškození tkáně příjemce, což se využívá v regenerativně-plastické medicíně. Bylo zjištěno, že transplantace DOPA neuronů do substantia nigra snižuje klinické projevy experimentálního hemiparkinsonismu. Regionální transplantace nervových kmenových buněk dárce snižují stupeň motorických poruch způsobených traumatem nebo kontuzemi míchy a mozku. Byly také získány první pozitivní výsledky transplantace kmenových buněk u demyelinizačních onemocnění. Zdá se, že regenerativně-plastický potenciál ESC otevírá neomezené možnosti pro využití buněčné transplantace v praktické medicíně. Při transplantaci do ektopických zón se však ESC nevyhnutelně transformují v nádory. Teratomy vznikají, když jsou ESC injikovány subkutánně imunodeficitním myším. Při transplantaci suspenzí ESC pod pouzdro varlete u syngenních myší se také tvoří teratomy, sestávající z různých tkání, jejichž buňky jsou deriváty všech tří zárodečných vrstev. U takových teratomů jsou procesy snížené organogeneze extrémně vzácné.

Řada studií poskytuje informace o pozitivních výsledcích transplantace časných derivátů embryonálních tkání zvířatům s experimentální patologií. Buněčná neurotransplantace s použitím derivátů embryonálních tkání (ESC) je dále rozvíjena v experimentech a prvních klinických studiích pro korekci funkčních poruch při poranění mozku a míchy a pro léčbu syringomyelie a roztroušené sklerózy (Repin, 2001). S příchodem techniky in vitro neurogeneze z embryonálních tkání se namísto použití embryonální mozkové tkáně vyvíjejí metody pro transplantaci derivátů neurosfér získaných z embryonálních kultur nervové tkáně. Takové transplantační suspenze jsou výrazně homogennější a obsahují komitované prekurzory neuronů a neuroglií.

Při pravidelném přidávání kyseliny retinové v dávce 10 μg/ml do kultivačního média po dobu 6 týdnů se v linii lidského embryo-(terato)-karcinomu NTERA-2 tvoří více než 80 % postmitotických neuronů. Úplné homogenity neuronální populace je dosaženo flow sortingem zralých neuronů značených imunofenotypovými markery, což umožňuje zbavit se zbytků teratokarcinomu a nezralých buněk. Po transplantaci do různých oblastí mozku experimentálních zvířat tyto neurony nejen přežívají, ale také se integrují do regionálních neuronových sítí. U zvířat s experimentálními modely lokálních defektů CNS neurotransplantace snižuje klinické projevy takových lidských patologií, jako jsou následky traumatického poranění mozku, mrtvice, demyelinizační onemocnění, dědičné vady vývoje mozečku, onemocnění ukládání lipidů a polysacharidů.

Pro optimalizaci regeneračních procesů u degenerativních onemocnění centrálního nervového systému se vyvíjejí technologie pro získávání myelin produkujících oligodendrocytů z embryonálních kmenových buněk (ESC). První fáze tradičně zahrnuje proliferaci ESC s reprodukcí počtu buněk potřebných pro transplantaci. Ve druhé fázi se provádí cílená diferenciace buněk do populace myelin produkujících prekurzorů oligodendrocytů, která je řízena selektivními markerovými antigeny.

Otevírají se určité perspektivy pro využití derivátů embryonálních kmenových buněk (ESC) pro vývoj metod korekce imunodeficiencí způsobených genetickými defekty ve zrání brzlíku. Ve studiích na knockout (rag 1) myších s indukovaným genovým defektem - narušením rekombinačního mechanismu lokusů V(D)J genů TCR, vedoucím ke ztrátě funkce T-lymfocytů, transplantace časných derivátů ESC do brzlíku zvířat obnovuje zrání normálních populací imunitních klonů zodpovědných za buněčnou imunitu. Klinické studie transplantace in vitro preformovaných ESC pro léčbu fatálních dědičných anémií u dětí probíhají.

Námitky proti rychlému zavedení transplantace kmenových buněk do klinické praxe jsou založeny na omezeném počtu stabilních linií lidských embryonálních kmenových buněk a potřebě jejich standardizace. Pro zvýšení čistoty standardizovaných linií ESC, stejně jako dospělých lidských kmenových buněk, se navrhuje použít metodu výběru linií založenou na molekulárně genetické analýze krátkých tandemových opakování DNA. Je také nutné testovat linie ESC na přítomnost malých chromozomálních přeskupení a genetických mutací, jejichž potenciál pro výskyt v podmínkách buněčné kultury je poměrně vysoký. Je předložena teze o povinném testování vlastností všech typů ESC a regionálních pluripotentních kmenových buněk, protože jejich reprodukce in vitro může vést ke vzniku nových charakteristik, které nejsou vlastní embryonálním kmenovým buňkám ani definitivním tkáním. Zejména se předpokládá, že dlouhodobá kultivace v médiích s cytokiny přibližuje linie ESC k nádorovým buňkám, protože procházejí podobnými změnami v drahách regulace buněčného cyklu se získáním schopnosti provádět neomezený počet buněčných dělení. Někteří autoři, na základě potenciálu pro rozvoj nádoru, považují transplantaci derivátů raných embryonálních kmenových buněk lidem za bezohlednou. Podle jejich názoru je mnohem bezpečnější použít komitované potomky ESC, tj. linie diferencovaných buněčných progenitorů. V současné době však dosud nebyla vyvinuta spolehlivá technika pro získání stabilních lidských buněčných linií, které se diferencují požadovaným směrem.

V literatuře se tak objevuje stále více údajů o pozitivním terapeutickém účinku transplantace derivátů lidských embryonálních kmenových buněk. Mnoho z těchto studií je však recenzováno a kritizováno. Někteří vědci se domnívají, že výsledky raných klinických studií jsou předběžné a pouze naznačují, že kmenové buňky jsou schopny příznivě ovlivnit klinický průběh konkrétního onemocnění. Proto je nutné získat údaje o vzdálených výsledcích buněčné transplantace. Jako argument se uvádějí fáze vývoje klinické neurotransplantologie. Zpočátku skutečně v literatuře převládaly publikace o vysoké účinnosti transplantace embryonálních mozkových fragmentů u Parkinsonovy choroby, ale poté se začaly objevovat zprávy popírající terapeutickou účinnost embryonální nebo fetální nervové tkáně transplantované do mozku pacientů.

První klinické studie byly provedeny za účelem posouzení bezpečnosti transplantace neuroblastů odvozených z ESC teratokarcinomu NTERA-2, jejichž nezralé buňky byly podrobeny proliferaci v kultuře až do akumulace 100 milionů buněčné hmoty. Některé z takto získaných buněk byly použity k charakterizaci fenotypu a stanovení buněčných nečistot, jakož i k testování možné kontaminace viry a bakteriemi. LIF a podpůrná vrstva fetálních stromálních buněk byly odstraněny z kultivačního média a byly vytvořeny podmínky pro cílenou diferenciaci ESC na neuroblasty pomocí kombinace cytokinů a růstových faktorů. Následně byly neuroblasty purifikovány z nezralých buněk teratokarcinomu na průtokovém třídiči buněk. Po sekundární purifikaci a charakterizaci fenotypu transplantovaných buněk byla pacientům (v sedmém měsíci po hemoragické cévní mozkové příhodě) injekčně podána suspenze neuroblastů (10-12 milionů) do bazálního jádra mozku pomocí speciální mikrokanyly a stříkačky za stereotaktické a počítačové tomografické kontroly. Roční posttransplantační screening následků transplantace neuronů do zóny cévní mozkové příhody neodhalil žádné vedlejší ani nežádoucí účinky. U poloviny pacientů došlo ke zlepšení motorických funkcí v období od 6 do 12 měsíců po transplantaci. Pozitivní klinické změny byly doprovázeny zvýšeným prokrvením zóny cévní mozkové příhody po transplantaci buněk: průměrné zvýšení absorpce fluorescenčně značené 2-deoxyglukózy podle pozitronové emisní tomografie dosáhlo 18 % a u některých pacientů 35 %.

Americké Národní instituty zdraví (National Institutes of Health) však provedly nezávislou studii klinické účinnosti neurotransplantace u pacientů s parkinsonismem. Pacientům v první skupině byly transplantovány řezy embryonální nervové tkáně, které produkují dopamin, zatímco druhá skupina pacientů podstoupila simulovanou operaci. Výsledky naznačují nulovou klinickou účinnost takové neurotransplantace, a to i přes skutečnost, že embryonální neurony produkující dopamin v mozku příjemců přežily. Navíc 2 roky po transplantaci embryonální nervové tkáně se u 15 % pacientů vyvinula perzistující dyskineze, která u pacientů ve skupině s placebem chyběla (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Pozorování dalšího vývoje onemocnění u těchto pacientů stále probíhají.

Někteří autoři spojují protichůdné literární údaje o hodnocení klinické účinnosti neurotransplantace s různými přístupy k výběru skupin pacientů, nedostatečným výběrem metod pro objektivní posouzení jejich stavu a především s různými obdobími vývoje embryonální nervové tkáně a různými oblastmi mozku, ze kterých byla tato tkáň získána, různými velikostmi transplantátů a metodologickými rysy chirurgického zákroku.

Je třeba poznamenat, že pokusy o přímou transplantaci pluripotentních embryonálních kmenových buněk do oblasti striata v mozku potkanů s experimentálním hemiparkinsonismem byly doprovázeny proliferací embryonálních kmenových buněk (ESC) a jejich diferenciací na dopaminergní neurony. Lze předpokládat, že nově vytvořené neurony byly efektivně integrovány do neuronových sítí, jelikož po transplantaci ESC byla pozorována korekce behaviorálních anomálií a motorické asymetrie v apomorfinovém testu. Zároveň některá zvířata uhynula v důsledku transformace transplantovaných ESC na mozkové nádory.

Odborníci z Národní a lékařské akademie USA a specialisté z Národního institutu zdraví USA se domnívají, že klinický potenciál embryonálních kmenových buněk (ESC) si zaslouží nejvážnější pozornost, ale trvají na potřebě detailního studia jejich vlastností, pravděpodobnosti komplikací a dlouhodobých následků v experimentech na adekvátních biologických modelech lidských onemocnění (Kmenové buňky a budoucí regenerativní medicína, National Academy Press; Kmenové buňky a budoucí směry výzkumu. Nat. Inst, of Health USA).

Z tohoto hlediska je důležité, že srovnávací histologická analýza experimentálních teratomů získaných transplantací suspenze embryonálních kmenových buněk (ESC) do varlete s teratomy vzniklými v důsledku transplantace raného embrya, které také obsahuje ESC, ukázala, že ESC, bez ohledu na jejich zdroj původu nebo interakci s určitými okolními buňkami, realizují svůj tumorigenní potenciál stejným způsobem. Bylo prokázáno, že takové teratomy mají klonální původ, protože nádory sestávající z derivátů všech tří zárodečných vrstev mohou vzniknout z jedné ESC (Rega, 2001). Je pozoruhodné, že když byly klonované ESC s normálním karyotypem transplantovány imunodeficitním myším, vytvořily se také teratomy sestávající z různých typů diferencovaných somatických buněk. Tato experimentální data jsou bezchybným důkazem klonálního původu teratomů. Z hlediska vývojové biologie naznačují, že jako zdroj diferencovaných derivátů všech tří zárodečných vrstev, které tvoří teratom, nepůsobí vícenásobné kommitované progenitorové buňky, ale jediná pluripotentní kmenová buňka. Na cestě k praktické buněčné transplantaci jsou však výsledky těchto studií, ne-li prohibitivní, tak varovným signálem potenciálního nebezpečí, jelikož inokulace embryonálních kmenových buněk (ESC) nebo primordiálních zárodečných buněk do různých tkání dospělých imunodeficientních myší nevyhnutelně způsobuje rozvoj nádorů z transplantovaných kmenových buněk. Neoplastická degenerace ektopicky transplantovaných ESC je doprovázena vznikem satelitních populací diferencovaných buněk - v důsledku částečné diferenciace ESC a progenitorových klonů do specializovaných linií. Je zajímavé, že při transplantaci ESC do kosterních svalů se neurony nejčastěji tvoří vedle buněk teratokarcinomu. Zavedení ESC do dělícího se vajíčka nebo blastocysty je však doprovázeno úplnou integrací buněk do embrya bez tvorby neoplastických elementů. V tomto případě jsou ESC integrovány prakticky do všech orgánů a tkání embrya, včetně genitálního primordia. Taková alofenová zvířata byla poprvé získána zavedením buněk teratokarcinomu 129 do raných embryí ve stádiu 8-100 buněk. U myší s allofenem jsou populace heterogenních buněk odvozených z dárcovských ESC integrovány do tkání kostní dřeně, střeva, kůže, jater a genitálií, což umožňuje v experimentu vytvářet i mezidruhové buněčné chiméry. Čím kratší je vývojová doba raného embrya, tím vyšší je procento chimerizace buněk, přičemž nejvyšší stupeň chimerizace je pozorován v hematopoetickém systému, kůži, nervovém systému, játrech a tenkém střevě embrya s allofenem. V dospělém organismu jsou k chimerizaci náchylné tkáně chráněné před imunitním systémem příjemce histohematickými bariérami:Transplantace primárních zárodečných buněk do parenchymu varlat je doprovázena začleněním dárcovských kmenových buněk do zárodečné tkáňové vrstvy příjemce. Při transplantaci ESC do blastocysty však nedochází k tvorbě chimérických rudimentů pohlavních orgánů s generací dárcovských primárních zárodečných buněk. Pluripotence ESC, pokud jsou vytvořeny zvláštní podmínky, může být také využita pro klonování: transplantace myších ESC do 8-16buněčného myšího embrya, ve kterém jsou buněčné mitózy blokovány cytokalsinem, podporuje realizaci normální embryogeneze s vývojem embrya z dárcovských ESC.

Alternativou k alogenní transplantaci embryonálních kmenových buněk (ESC) je proto terapeutické klonování založené na transplantaci jader somatických buněk do enukleovaného vajíčka za účelem vytvoření blastocysty, z jejíž vnitřní buněčné hmoty se následně izolují linie ESC geneticky identické s dárcem somatického jádra. Technicky je tato myšlenka docela proveditelná, protože možnost vytvoření linií ESC z blastocyst získaných po transplantaci somatických jader do enukleovaných vajíček byla opakovaně prokázána v experimentech na laboratorních zvířatech (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Zejména u myší homozygotních pro mutaci genu rag2 byly jako dárci jader použity fibroblasty získané kultivací buněk subepidermální tkáně, které byly transplantovány do enukleovaných oocytů. Po aktivaci oocytů byla „zygota“ kultivována až do vzniku blastocysty, z jejíž vnitřní buněčné hmoty byly izolovány ESC a přeneseny do linie buněk nulizygotních pro mutantní gen (rag2~/~). Mutace jednoho alelického genu byla v takových ESC opravena metodou homologní rekombinace. V první sérii experimentů byla z ESC s rekombinantním obnoveným genem získána embryoidní tělíska, jejich buňky byly transfekovány rekombinantním retrovirem (HoxB4i/GFP) a po reprodukci byly injikovány do žíly myší rag2~/~. Ve druhé sérii byly tetraploidní blastomery agregovány s geneticky modifikovanými ESC a transplantovány do recipientních samic. Výsledné imunokompetentní myši sloužily jako dárci kostní dřeně pro transplantaci do mutantních myší rag2~/~. V obou sériích byl výsledek pozitivní: po 3-4 týdnech byly u všech myší nalezeny zralé normální myeloidní a lymfoidní buňky schopné produkovat imunoglobuliny. Transplantaci jader somatických buněk do oocytů lze tedy využít nejen k získání linií ESC, ale také pro cytogenoterapii - korekci dědičných anomálií s využitím ESC jako vektoru pro transport korekční genetické informace. Tento směr buněčné transplantace má však kromě bioetických problémů i svá omezení. Není jasné, jak bezpečná bude transplantace terapeuticky klonovaných buněk s genotypem identickým s genotypem konkrétního pacienta, protože takové buňky mohou zavádět mutace, které vytvářejí predispozici k jiným onemocněním. Normální lidská vajíčka zůstávají obtížně dostupným objektem, zatímco i při transplantaci somatických jader do enukleovaných zvířecích vajíček se do stádia blastocysty vyvine pouze 15–25 % konstruovaných „zygot“. Zatím není stanoveno, kolik blastocyst je potřeba k získání jedné linie pluripotentních klonovaných embryonálních kmenových buněk (ESC). Za zmínku stojí také vysoká úroveň finančních nákladů spojených se složitostí metodologie terapeutického klonování.

Závěrem je třeba poznamenat, že u ESC je pluripotence genomu s hypometylovanou DNA kombinována s vysokou telomerázovou aktivitou a krátkou C^ fází buněčného cyklu, což zajišťuje jejich intenzivní a potenciálně nekonečnou reprodukci, během níž si ESC zachovávají diploidní sadu chromozomů a „juvenilní“ sadu fenotypových charakteristik. Klonální růst ESC v kultuře nebrání jejich diferenciaci do žádné specializované buněčné linie organismu, když je proliferace zastavena a jsou přidány vhodné regulační signály. Restrikční diferenciace ESC do somatických buněčných linií in vitro probíhá bez účasti mezenchymu, obchází Nochtey, mimo organogenezi a bez tvorby embrya. Ektopické zavedení ESC in vivo nevyhnutelně vede k tvorbě teratokarcinomů. Transplantace ESC do blastocysty nebo raného embrya je doprovázena jejich integrací s embryonálními tkáněmi a stabilní chimerizací jeho orgánů.

Regenerativně-plastické technologie založené na transplantaci buněk jsou průsečíkem zájmů zástupců buněčné biologie, vývojové biologie, experimentální genetiky, imunologie, neurologie, kardiologie, hematologie a mnoha dalších odvětví experimentální i praktické medicíny. Nejdůležitější výsledky experimentálních studií dokazují možnost reprogramování kmenových buněk s cílenou změnou jejich vlastností, což otevírá perspektivy pro řízení procesů cytodiferenciace pomocí růstových faktorů - pro regeneraci myokardu, obnovu lézí CNS a normalizaci funkce ostrůvkového aparátu slinivky břišní. Pro široké zavedení transplantace derivátů embryonálních kmenových buněk (ESC) do praktické medicíny je však nutné podrobněji studovat vlastnosti lidských kmenových buněk a pokračovat v experimentech s ESC na experimentálních modelech onemocnění.

Bioetické otázky a problém odmítnutí alogenního buněčného transplantátu by mohly být vyřešeny objevenou plasticitou genomu regionálních kmenových buněk dospělého organismu. Nicméně původní informace, že při transplantaci izolovaných a pečlivě charakterizovaných hematopoetických autologních buněk do jater, ze kterých vznikají nové hepatocyty, integrující se do jaterních lalůčků, je nyní revidována a kritizována. Nicméně byly publikovány údaje, že transplantace nervových kmenových buněk do brzlíku způsobuje tvorbu nových klíčků T- a B-lymfocytů od dárce a transplantace mozkových nervových kmenových buněk do kostní dřeně vede k tvorbě hematopoetických klíčků s dlouhodobou myelo- a erytropoézou od dárce. V důsledku toho mohou v orgánech dospělého organismu přetrvávat pluripotentní kmenové buňky schopné přeprogramovat genom na potenciál embryonálních kmenových buněk (ESC).

Zdrojem získávání embryonálních kmenových buněk (ESC) pro lékařské účely zůstává lidské embryo, což předurčuje nevyhnutelnost nového průniku morálních, etických, právních a náboženských otázek v místě vzniku lidského života. Objev ESC dal silný impuls k obnovení náročných diskusí o tom, kde je hranice mezi živými buňkami a hmotou, bytostí a osobností. Zároveň neexistují žádné univerzální normy, pravidla a zákony týkající se používání ESC v medicíně, a to i přes opakované pokusy o jejich vytvoření a přijetí. Každý stát v rámci své legislativy řeší tento problém samostatně. Lékaři po celém světě se i nadále snaží posunout regenerativně-plastickou medicínu nad rámec takových diskusí, a to především využitím rezerv dospělých kmenových buněk namísto embryonálních kmenových buněk.

Trocha historie izolace embryonálních kmenových buněk

Buňky terato(embryo)karcinomu byly izolovány ze spontánně se vyskytujících testikulárních teratomů myší 129/ter-Sv, spontánních ovariálních teratomů myší Lt/Sv a z teratomů odvozených z ektopicky transplantovaných embryonálních buněk nebo tkání. Mezi stabilními buněčnými liniemi myšího terato(embryo)karcinomu získanými tímto způsobem byly některé pluripotentní, jiné se diferencovaly pouze do jednoho specifického buněčného typu a některé byly zcela neschopné cytodiferenciace.

V jednu dobu se pozornost soustředila na studie, jejichž výsledky naznačovaly možnost návratu buněk terato-(embryo)-karcinomu k normálnímu fenotypu po jejich zavedení do tkání vyvíjejícího se embrya, a také na práce na in vitro tvorbě geneticky modifikovaných buněk terato-(embryo)-karcinomu, s jejichž pomocí byly získány mutantní myši pro biologické modelování lidské dědičné patologie.

K izolaci buněčných linií terato-(embryo)-karcinomu byla použita kultivace v podmíněné suspenzi. V kultuře buňky terato-(embryo)-karcinomu, podobně jako ESC, rostou za vzniku embryoidních tělísek a vyžadují povinnou disociaci pro přenos do linie, zachování pluripotence na podpůrné vrstvě embryonálních fibroblastů nebo během kultivace v suspenzi v podmíněném médiu. Buňky pluripotentních linií terato-(embryo)-karcinomu jsou velké, sférické, vyznačují se vysokou aktivitou alkalické fosfatázy, tvoří agregáty a jsou schopné vícesměrné diferenciace. Po zavedení do blastocysty agregují s morulou, což vede k tvorbě chimérických embryí, v jejichž složení se nacházejí deriváty buněk terato-(embryo)-karcinomu. Drtivá většina těchto chimérických embryí však umírá in utero a v orgánech přežívajících novorozených chimér jsou cizí buňky detekovány jen zřídka a v nízké hustotě. Současně prudce stoupá výskyt nádorů (fibrosarkom, rabdomyosarkom, další typy maligních nádorů a adenom pankreatu) a k degeneraci nádoru často dochází během období intrauterinního vývoje chimérických embryí.

Většina buněk terato-(embryo)-karcinomu v mikroprostředí normálních embryonálních buněk téměř přirozeně získává maligní neoplastické vlastnosti. Předpokládá se, že ireverzibilní malignita je způsobena aktivací protoonkogenů v procesu strukturálních přeskupení. Jednou z výjimek jsou buňky linie embryokarcinomu SST3, získané z myších testikulárních teratomů (linie 129/Sv-ter), které vykazují vysokou schopnost integrace do tkání a orgánů embrya bez následné tvorby nádoru u chimérických myší. Deriváty buněčných linií terato-(embryo)-karcinomu u chimérických myší se prakticky nepodílejí na tvorbě primárních gonocytů. Zřejmě je to způsobeno vysokou frekvencí chromozomálních aberací charakteristických pro většinu linií terato-(embryo)-karcinomu, v jejichž buňkách jsou pozorovány jak aneuploidie, tak chromozomální abnormality.

V laboratorních podmínkách bylo získáno několik stabilních linií buněk lidského terato-(embryo)-karcinomu, které se vyznačují pluripotencí, vysokou proliferační aktivitou a schopností diferenciace během růstu v kulturách. Zejména linie buněk lidského terato-(embryo)-karcinomu NTERA-2 byla použita ke studiu mechanismů nervové cytodiferenciace. Po transplantaci buněk této linie do subventrikulární oblasti předního mozku novorozených potkanů byla pozorována jejich migrace a neurogeneze. Dokonce byly učiněny pokusy o transplantaci neuronů získaných kultivací buněk linie terato-(embryo)-karcinomu NTERA-2 pacientům s cévní mozkovou příhodou, což podle autorů vedlo ke zlepšení klinického průběhu onemocnění. Zároveň nebyly u pacientů s cévní mozkovou příhodou zaznamenány žádné případy malignity transplantovaných buněk linie terato-(embryo)-karcinomu NTERA-2.

První linie nediferencovaných pluripotentních myších embryonálních kmenových buněk získali na začátku 80. let 20. století Evans a Martin, kteří je izolovali z vnitřní buněčné hmoty blastocysty - embryoblastu. Izolované ESC linie si po dlouhou dobu zachovaly pluripotenci a schopnost diferencovat se do různých buněčných typů pod vlivem faktorů ve speciálním kultivačním médiu.

Samotný termín „embryonální pluripotentní kmenová buňka“ patří Leroyovi Stevensovi, který při studiu vlivu tabákového dehtu na výskyt vývoje nádorů upozornil na spontánní výskyt testikulárního teratokarcinomu u lineárních (129/v) myší kontrolní skupiny. Buňky testikulárních teratokarcinomů se vyznačovaly vysokou rychlostí proliferace a v přítomnosti tekutiny z břišní dutiny se spontánně diferencovaly za vzniku neuronů, keratinocytů, chondrocytů, kardiomyocytů, stejně jako vlasových a kostních fragmentů, ale bez známek uspořádané cytoarchitektury odpovídající tkáně. Po umístění do kultury rostly buňky teratokarcinomu jako pluripotentní klony nepřipojené k substrátu a tvořily embryoidní tělíska, načež přestaly dělit a podléhaly spontánní neuspořádané diferenciaci na neurony, glii, svalové buňky a kardiomyocyty. Stevens zjistil, že myší teratokarcinom 129/v obsahuje méně než 1 % buněk schopných diferenciace do různých specializovaných somatických linií a samotná diferenciace závisí na faktorech, které je ovlivňují (složení peritoneální tekutiny, produkty zralých buněk nebo tkáně přidané do kultury). Hypotéza Leroye Stevensona o přítomnosti embryonálních progenitorových buněk zárodečné linie mezi buňkami teratokarcinomu byla potvrzena: suspenze embryoblastových buněk z preimplantačních embryí v tkáních dospělých myší vytvořila teratokarcinomy a čisté buněčné linie izolované z nich po intraperitoneálním podání recipientním zvířatům se diferencovaly na neurony, kardiomyocyty a další somatické buňky odvozené ze všech tří zárodečných vrstev. V experimentech in vivo vedla transplantace embryonálních kmenových buněk (ESC) (získaných z embryoblastu, ale nikoli trofoblastu) do myších embryí jiné linie ve stádiích blastomer 8-32 k narození chimerických zvířat (bez vývoje nádorů), v jejichž orgánech byly nalezeny klíčky dárcovské tkáně. Chimerismus byl pozorován i v linii zárodečných buněk.

Primární progenitorové zárodečné buňky izolované z genitálního rudimentu myšího embrya odpovídaly morfologií, imunologickým fenotypem a funkčními vlastnostmi embryonálním kmenovým buňkám (ESC) získaným Stevensonem z teratokarcinomu a embryoblastu. U chimér narozených po zavedení ESC do blastocysty byla alofenová morfogeneze orgánů charakterizována mozaikovým střídáním strukturních a funkčních jednotek dárce a příjemce – jater, plic a ledvin. V některých případech byla pozorována tvorba střevních krypt nebo jaterních lalůčků sestávajících z buněk příjemce i dárce. Morfogeneze však vždy probíhala podle genetického programu druhu, ke kterému příjemce patřil, a chimerismus byl omezen výhradně na buněčnou úroveň.

Poté bylo zjištěno, že proliferace embryonálních kmenových buněk (ESC) bez cytodiferenciace na podpůrné vrstvě buněk odvozených z mezenchymu (fetální fibroblasty) probíhá za povinné přítomnosti LIF v selektivních živných médiích, která selektivně zajišťují přežití pouze kmenových a progenitorových buněk, zatímco drtivá většina specializovaných buněčných elementů odumírá. Pomocí těchto metod v roce 1998 James Thomson izoloval pět imortalizovaných linií embryonálních kmenových buněk z vnitřní buněčné hmoty lidské blastocysty. Ve stejném roce vyvinul John Gerhart metodu pro izolaci nesmrtelných linií ESC z genitálního tuberkulu čtyř až pěti týdnů starých lidských embryí. Díky svým jedinečným vlastnostem se embryonální kmenové buňky a kmenové buňky definitivních tkání začaly používat v praxi regenerativní medicíny a genové terapie.