Corynebacterium

Záškrt je akutní infekční onemocnění, postihující převážně děti, které se projevuje hlubokou intoxikací těla záškrtovým toxinem a charakteristickým fibrinózním zánětem v místě lokalizace patogena. Název onemocnění pochází z řeckého slova difthera - kůže, film, protože v místě rozmnožování patogenu se tvoří hustý, šedobílý film.

Původce záškrtu - Corynebacterium diphtheriae - byl poprvé objeven v roce 1883 E. Klebsem v řezech filmu a v čisté kultuře byl získán v roce 1884 F. Lefflerem. V roce 1888 E. Roux a A. Yersin objevili jeho schopnost produkovat exotoxin, který hraje hlavní roli v etiologii a patogenezi záškrtu. Výroba antitoxického séra E. Behringem v roce 1892 a jeho používání od roku 1894 k léčbě záškrtu umožnilo výrazně snížit úmrtnost. Úspěšný útok na toto onemocnění začal po roce 1923 v souvislosti s vývojem metody pro získávání záškrtového anatoxinu G. Raionem.

Původce záškrtu patří do rodu Corynebacterium (třída Actinobacteria). Morfologicky se vyznačuje tím, že buňky mají kyjovitý tvar a jsou na koncích ztluštělé (řecky coryne - kyj), tvoří větve, zejména ve starých kulturách, a obsahují zrnité inkluze.

Rod Corynebacterium zahrnuje velké množství druhů, které se dělí do tří skupin.

• Korynebakterie jsou paraziti lidí i zvířat a jsou pro ně patogenní.
• Korynebakterie patogenní pro rostliny.
• Nepatogenní korynebakterie. Mnoho druhů korynebakterií je normálními obyvateli kůže, sliznic hltanu, nosohltanu, očí, dýchacích cest, močové trubice a genitálií.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologie korynebakterií

C. diphtheriae jsou rovné nebo mírně zakřivené nepohyblivé tyčinky o délce 1,0–8,0 μm a průměru 0,3–0,8 μm; netvoří spory ani kapsle. Často mají na jednom nebo obou koncích zduření a často obsahují metachromatická granula – volutinová zrna (polymetafosfáty), která po obarvení methylenovou modří získávají modrofialové zbarvení. Pro jejich detekci byla navržena speciální Neisserova metoda barvení. V tomto případě jsou tyčinky zbarveny slámově žlutě a volutinová zrna jsou tmavě hnědá a obvykle se nacházejí na pólech. Corynebacterium diphtheriae se dobře barví anilinovými barvivy, je grampozitivní, ale ve starých kulturách se často zbarvuje a má negativní barvení podle Grama. Vyznačuje se výrazným polymorfismem, zejména ve starých kulturách a pod vlivem antibiotik. Obsah G+C v DNA je asi 60 mol %.

Biochemické vlastnosti korynebakterií

Bacil záškrtu je aerob nebo fakultativně anaerob, teplotní optimum pro růst je 35–37 °C (limity růstu jsou 15–40 °C), optimální pH je 7,6–7,8. Není příliš náročný na živná média, ale lépe roste na médiích obsahujících sérum nebo krev. Selektivní pro bakterie záškrtu jsou sražená sérová média Roux nebo Loeffler, růst na nich se objevuje po 8–12 hodinách ve formě konvexních kolonií o velikosti špendlíkové hlavičky, šedobílé nebo nažloutlé krémové barvy. Jejich povrch je hladký nebo mírně zrnitý, na obvodu jsou kolonie poněkud průhlednější než ve středu. Kolonie se nesplývají, v důsledku čehož kultura získává vzhled shagreenové kůže. Na bujónu se růst projevuje rovnoměrným zákalem, nebo bujón zůstává průhledný a na jeho povrchu se vytváří jemný film, který postupně houstne, drolí se a usazuje se ve vločkách na dně.

Charakteristickým znakem bakterií záškrtu je jejich dobrý růst na krevních a sérových médiích obsahujících takové koncentrace teluritu draselného, že potlačují růst jiných typů bakterií. To je způsobeno tím, že C. diphtheriae redukují telurit draselný na kovový telur, který se usazuje v mikrobiálních buňkách a dává koloniím charakteristickou tmavě šedou nebo černou barvu. Použití takových médií zvyšuje procento očkování bakterií záškrtu.

Corynebacterium diphtheriae fermentují glukózu, maltózu, galaktózu za tvorby kyseliny bez plynu, ale nefermentují (zpravidla) sacharózu, mají cystinázu, nemají ureázu a netvoří indol. Podle těchto charakteristik se liší od koryneformních bakterií (difteroidů), které se nejčastěji nacházejí na sliznici oka (Corynebacterium xerosus) a nosohltanu (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum), a od ostatních difteroidů.

V přírodě existují tři hlavní varianty (biotypy) záškrtového bacilu: gravis, intermedins a mitis. Liší se morfologickými, kulturními, biochemickými a dalšími vlastnostmi.

Rozdělení bakterií záškrtu na biotypy bylo provedeno s ohledem na formy záškrtu, u kterých jsou izolovány s největší frekvencí. Typ gravis je nejčastěji izolován u pacientů s těžkou formou záškrtu a způsobuje skupinová ohniska. Typ mitis způsobuje mírnější a sporadické případy onemocnění a typ intermedius zaujímá mezi nimi střední pozici. Corynebacterium belfanti, dříve přiřazovaný k biotypu mitis, je izolován jako samostatný, čtvrtý biotyp. Jeho hlavní rozdíl od biotypů gravis a mitis je schopnost redukovat dusičnany na dusitany. Kmeny Corynebacterium belfanti mají výrazné adhezivní vlastnosti a vyskytují se mezi nimi jak toxigenní, tak netoxigenní varianty.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigenní struktura korynebakterií

Corynebacterium je velmi heterogenní a mozaikové. U všech tří typů patogenů záškrtu bylo nalezeno několik desítek somatických antigenů, podle kterých jsou rozděleny do sérotypů. V Rusku byla přijata sérologická klasifikace, podle které se rozlišuje 11 sérotypů bakterií záškrtu, z nichž 7 je hlavních (1-7) a 4 jsou doplňkové, vzácně se vyskytující sérotypy (8-11). Šest sérotypů (1, 2, 3, 4, 5, 7) patří k typu gravis a pět (6, 8, 9, 10, 11) k typu mitis. Nevýhodou metody sérotypizace je, že mnoho kmenů, zejména netoxigenních, má spontánní aglutinaci nebo polyaglutinaci.

[ 11 ]

Fágová typizace Corynebacterium diphtheriae

Pro diferenciaci bakterií záškrtu byla navržena různá schémata fágové typizace. Podle schématu M. D. Krylové je možné s použitím sady 9 fágů (A, B, C, D, F, G, H, I, K) typovat většinu toxigenních i netoxigenních kmenů typu gravis. S ohledem na citlivost na specifikované fágy, jakož i na kulturní, antigenní vlastnosti a schopnost syntetizovat koryciny (baktericidní proteiny) M. D. Krylová identifikovala 3 nezávislé skupiny korynebakterií typu gravis (I-III). Každá z nich obsahuje podskupiny toxigenních a jejich netoxigenní analogy patogenů záškrtu.

Rezistence korynebakterií

Corynebacterium diphtheriae vykazuje vysokou odolnost vůči nízkým teplotám, ale při vysokých teplotách rychle hyne: při 60 °C - během 15-20 minut, při varu - po 2-3 minutách. Všechny dezinfekční prostředky (lysol, fenol, chloramin atd.) v obvykle používané koncentraci jej ničí během 5-10 minut. Původce záškrtu však dobře snáší sušení a může zůstat dlouho životaschopný v zaschlém hlenu, slinách a prachových částicích. V jemném aerosolu zůstávají bakterie záškrtu životaschopné 24-48 hodin.

Faktory patogenity korynebakterií

Patogenita Corynebacterium diphtheriae je určena přítomností řady faktorů.

Faktory adheze, kolonizace a invaze

Struktury zodpovědné za adhezi nebyly identifikovány, ale bez nich by difterický bacil nebyl schopen kolonizovat buňky. Jejich roli plní některé složky buněčné stěny patogenu. Invazivní vlastnosti patogenu jsou spojeny s hyaluronidázou, neuraminidázou a proteázou.

Toxický glykolipid obsažený v buněčné stěně patogenu. Jedná se o 6,6'-diester trehalózy obsahující kyselinu korynemykolovou (C32H64O3) a kyselinu korynemykolovou (C32H62O3) v ekvimolárních poměrech (trehalosa-6,6'-dikorynemikolát). Glykolipid má destruktivní účinek na tkáňové buňky v místě rozmnožování patogenu.

Exotoxin, který určuje patogenitu patogenu a povahu patogeneze onemocnění. Netoxigenní varianty C. diphtheriae záškrt nezpůsobují.

Exotoxin je syntetizován jako neaktivní prekurzor - jediný polypeptidový řetězec s molekulovou hmotností 61 kD. Aktivuje ho samotná bakteriální proteáza, která polypeptid štěpí na dva peptidy spojené disulfidovými vazbami: A (mw 21 kD) a B (mw 39 kD). Peptid B plní akceptorovou funkci - rozpoznává receptor, váže se na něj a vytváří intramembránový kanál, kterým peptid A proniká do buňky a realizuje biologickou aktivitu toxinu. Peptid A je enzym ADP-ribosyltransferáza, který zajišťuje přenos adenosin-difosfát-ribózy z NAD na jeden z aminokyselinových zbytků (histidin) elongačního faktoru proteinu EF-2. V důsledku modifikace EF-2 ztrácí svou aktivitu, což vede k potlačení syntézy proteinů ribozomy ve fázi translokace. Toxin je syntetizován pouze těmi C. diphtheriae, kteří ve svém chromozomu nesou geny středně silně konvertujícího profága. Operan kódující syntézu toxinu je monocistronický, skládá se z 1,9 tisíce nukleotidových párů a má promotor toxP a 3 oblasti: toxS, toxA a toxB. Oblast toxS kóduje 25 aminokyselinových zbytků signálního peptidu (zajišťuje uvolňování toxinu přes membránu do periplazmatického prostoru bakteriální buňky), toxA - 193 aminokyselinových zbytků peptidu A a toxB - 342 aminokyselinových zbytků peptidu B toxinu. Ztráta profágu buňkou nebo mutace v tox operonu činí buňku mírně toxigenní. Naopak lyzogenizace netoxigenních C. diphtheriae konvertujícím fágem je mění v toxigenní bakterie. To bylo jednoznačně prokázáno: toxigenita bakterií záškrtu závisí na jejich lyzogenizaci tox-konvertujícími korynefágy. Korynefágy se integrují do chromozomu korynebakterií pomocí mechanismu místně specifické rekombinace a kmeny bakterií záškrtu mohou ve svých chromozomech obsahovat 2 rekombinační místa (attB) a korynefágy se integrují do každého z nich se stejnou frekvencí.

Genetická analýza řady netoxigenních kmenů bakterií záškrtu, provedená za použití značených DNA sond nesoucích fragmenty korynefágového tox operonu, ukázala, že jejich chromozomy obsahují sekvence DNA homologní s korynefágovým tox operonem, ale buď kódují neaktivní polypeptidy, nebo jsou v „tichém“ stavu, tj. neaktivní. V této souvislosti vyvstává velmi důležitá epidemiologická otázka: mohou se netoxigenní bakterie záškrtu za přirozených podmínek (v lidském těle) transformovat na toxigenní, podobně jako se to děje in vitro? Možnost takové transformace netoxigenních kultur korynebakterií na toxigenní pomocí fágové konverze byla prokázána v experimentech na morčatech, kuřecích embryích a bílých myších. Zda k tomu však dochází během přirozeného epidemického procesu (a pokud ano, jak často), dosud nebylo stanoveno.

Vzhledem k tomu, že difterický toxin v těle pacientů má selektivní a specifický účinek na určité systémy (postižen je především sympaticko-adrenální systém, srdce, cévy a periferní nervy), je zřejmé, že nejen inhibuje biosyntézu bílkovin v buňkách, ale způsobuje i další poruchy jejich metabolismu.

K detekci toxicity bakterií záškrtu lze použít následující metody:

• Biologické testy na zvířatech. Intradermální infekce morčat filtrátem bujónové kultury záškrtových bakterií způsobuje nekrózu v místě vpichu. Jedna minimální letální dávka toxinu (20-30 ng) usmrtí morče o hmotnosti 250 g při subkutánní injekci 4.-5. den. Nejcharakterističtějším projevem účinku toxinu je poškození nadledvin, které jsou zvětšené a prudce hyperemické.
• Infekce kuřecích embryí. Záškrtový toxin způsobuje jejich smrt.
• Infekce buněčných kultur. Záškrtový toxin způsobuje výrazný cytopatický účinek.
• Enzymově vázaný imunosorbentní test na pevné fázi s použitím antitoxinů značených peroxidázou.
• Použití DNA sondy pro přímou detekci tox operonu v chromozomu bakterií záškrtu.

Nejjednodušší a nejběžnější metodou pro stanovení toxicity záškrtových bakterií je však sérologická - metoda gelové precipitace. Její podstata je následující. Proužek sterilního filtračního papíru o rozměrech 1,5 x 8 cm se navlhčí antitoxickým antidifterickým sérem obsahujícím 500 AE v 1 ml a nanese se na povrch živného média v Petriho misce. Miska se suší v termostatu po dobu 15-20 minut. Testovací kultury se vysejí plaky po obou stranách papíru. Na jednu misku se vyseje několik kmenů, z nichž jeden, zjevně toxický, slouží jako kontrola. Misky s kulturami se inkubují při 37 °C, výsledky se berou v úvahu po 24-48 hodinách. V důsledku protidifúze antitoxinu a toxinu v gelu se v místě jejich interakce vytvoří zřetelná precipitační linie, která splývá s precipitační linií kontrolního toxigenního kmene. Nespecifické precipitační pásy (vznikají, pokud jsou v séru kromě antitoxinu přítomny i další antimikrobiální protilátky v malém množství) se objevují pozdě, jsou slabě exprimovány a nikdy se neslučují s precipitačním pásem kontrolního kmene.

Postinfekční imunita

Silné, přetrvávající, prakticky celoživotní, opakované případy onemocnění jsou pozorovány vzácně - u 5-7 % těch, kteří onemocnění prodělali. Imunita je převážně antitoxická, antimikrobiální protilátky mají menší význam.

Schickův test byl dříve široce používán k posouzení úrovně imunity proti záškrtu. Za tímto účelem byla dětem intradermálně injekčně aplikována 1/40 morčecího toxinu v objemu 0,2 ml. Při absenci antitoxické imunity se v místě vpichu po 24–48 hodinách objeví zarudnutí a otok o průměru větším než 1 cm. Taková pozitivní Schickova reakce naznačuje buď úplnou absenci antitoxinu, nebo jeho obsah je menší než 0,001 AE/ml krve. Negativní Schickova reakce se pozoruje, když je obsah antitoxinu v krvi vyšší než 0,03 AE/ml. Pokud je obsah antitoxinu nižší než 0,03 AE/ml, ale vyšší než 0,001 AE/ml, může být Schickova reakce buď pozitivní, nebo někdy negativní. Kromě toho má samotný toxin výraznou alergenní vlastnost. Proto je pro stanovení úrovně imunity proti záškrtu (kvantitativní obsah antitoxinu) lepší použít RPGA s diagnostickým erytrocytem senzibilizovaným záškrtovým toxoidem.

Epidemiologie záškrtu

Jediným zdrojem infekce je člověk – nemocný, uzdravující se nebo zdravý nosič bakterie. K infekci dochází vzdušnými kapénkami, prachem a různými předměty používanými nemocnými nebo zdravými nosiči: nádobím, knihami, ložním prádlem, hračkami atd. V případě kontaminace potravin (mléko, krémy atd.) je infekce možná alimentární cestou. K nejmasivnějšímu vylučování patogena dochází u akutní formy onemocnění. Největší epidemiologický význam však mají osoby s latentními, atypickými formami onemocnění, protože často nejsou hospitalizovány a nejsou okamžitě detekovány. Pacient se záškrtem je infekční po celou dobu onemocnění a část období rekonvalescence. Průměrná doba nosičství bakterií u uzdravujících se osob se pohybuje od 2 do 7 týdnů, ale může trvat až 3 měsíce.

Zdraví nositelé hrají v epidemiologii záškrtu zvláštní roli. V podmínkách sporadické morbidity jsou hlavními distributory záškrtu a přispívají k zachování patogenu v přírodě. Průměrná doba přenosu toxigenních kmenů je o něco kratší (přibližně 2 měsíce) než u netoxigenních (přibližně 2–3 měsíce).

Důvod vzniku zdravého nosičství toxigenních a netoxigenních bakterií záškrtu nebyl zcela objasněn, protože ani vysoká úroveň antitoxické imunity ne vždy zajistí úplné osvobození těla od patogenu. Určitý význam má pravděpodobně úroveň antibakteriální imunity. Primární epidemiologický význam má nosičství toxigenních kmenů bakterií záškrtu.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Příznaky záškrtu

K záškrtu jsou náchylní lidé všech věkových kategorií. Patogen může do lidského těla proniknout sliznicemi různých orgánů nebo poškozenou kůží. V závislosti na lokalizaci procesu se rozlišuje záškrt hltanu, nosu, hrtanu, ucha, oka, genitálií a kůže. Možné jsou i smíšené formy, například záškrt hltanu a kůže atd. Inkubační doba je 2–10 dní. U klinicky projevené formy záškrtu se v místě lokalizace patogenu vyvíjí charakteristický fibrinózní zánět sliznice. Toxin produkovaný patogenem nejprve postihuje epitelové buňky a poté blízké cévy, čímž zvyšuje jejich propustnost. Vycházející exsudát obsahuje fibrinogen, jehož koagulace vede k tvorbě šedobílého filmového povlaku na povrchu sliznice, který je pevně srostlý s podkladovou tkání a po odtržení způsobuje krvácení. Důsledkem poškození cév může být rozvoj lokálního edému. Záškrt hltanu je obzvláště nebezpečný, protože může způsobit záškrtovou krupici v důsledku edému sliznice hrtanu a hlasivek, na kterou dříve umíralo 50–60 % dětí s záškrtem v důsledku asfyxie. Záškrtový toxin, který se dostává do krve, způsobuje celkovou hlubokou intoxikaci. Postihuje především kardiovaskulární, sympaticko-adrenální systém a periferní nervy. Příznaky záškrtu se tedy skládají z kombinace lokálních příznaků v závislosti na lokalizaci vstupní brány a obecných příznaků způsobených otravou toxinem, které se projevují ve formě adynamie, letargie, bledé kůže, nízkého krevního tlaku, myokarditidy, paralýzy periferních nervů a dalších poruch. Záškrt u očkovaných dětí, pokud se objeví, obvykle probíhá v mírné formě a bez komplikací. Úmrtnost v období před použitím séroterapie a antibiotik byla 50–60 %, nyní je to 3–6 %.

Laboratorní diagnostika záškrtu

Jedinou metodou mikrobiologické diagnostiky záškrtu je bakteriologická, s povinným testováním izolované kultury korynebakterií na toxicitu. Bakteriologické vyšetření záškrtu se provádí ve třech případech:

• pro diagnostiku záškrtu u dětí a dospělých s akutními zánětlivými procesy v hltanu, nose a nosohltanu;
• podle epidemiologických indikací osob, které byly v kontaktu se zdrojem patogenu záškrtu;
• osoby nově přijaté do sirotčinců, jeslí, internátních škol a dalších speciálních zařízení pro děti i dospělé, za účelem identifikace možných nositelů záškrtu mezi nimi.

Materiálem pro studii je hlen z hltanu a nosu, film z mandlí nebo jiných sliznic, které jsou vstupním bodem pro patogen. Výsev se provádí na teluritové sérum nebo krevní média a současně na koagulované sérové médium Roux (koagulované koňské sérum) nebo Loefflerovo médium (3 díly bovinního séra + 1 díl cukerného vývaru), na kterém se růst korynebakterií objeví po 8–12 hodinách. Izolovaná kultura se identifikuje kombinací morfologických, kultivačních a biochemických vlastností, pokud možno s použitím metod sero- a fágového typování. Ve všech případech je povinný test toxicity s použitím jedné z výše uvedených metod. Morfologické znaky korynebakterií se nejlépe studují pomocí tří metod barvení nátěru: Gramovou, Neisserovou a methylenovou modří (nebo toluidinovou modří).

Léčba záškrtu

Specifickou léčbou záškrtu je použití antitoxického séra proti záškrtu s obsahem nejméně 2000 IU na 1 ml. Sérum se podává intramuskulárně v dávkách od 10 000 do 400 000 IU v závislosti na závažnosti onemocnění. Účinnou léčebnou metodou je použití antibiotik (peniciliny, tetracykliny, erythromycin atd.) a sulfonamidů. Pro stimulaci produkce vlastních antitoxinů lze použít anatoxin. Pro zbavení se bakteriálního nosiče by se měla používat antibiotika, na která je daný kmen korynebakterií vysoce citlivý.

Specifická profylaxe záškrtu

Hlavní metodou boje proti záškrtu je hromadné plánované očkování populace. K tomuto účelu se používají různé varianty vakcín, včetně kombinovaných, tj. zaměřených na současné vytvoření imunity proti několika patogenům. Nejrozšířenější vakcínou v Rusku je DPT. Jedná se o suspenzi bakterií černého kašle adsorbovaných na hydroxid hlinitý, usmrcených formalinem nebo thimerosalem (20 miliard v 1 ml), která obsahuje záškrtový toxoid v dávce 30 flokulačních jednotek a 10 jednotek vázajících tetanový toxoid v 1 ml. Děti se očkují od 3 měsíců věku a poté se provádějí revakcinace: první po 1,5-2 letech, další ve věku 9 a 16 let a poté každých 10 let.

Díky hromadnému očkování, které v SSSR začalo v roce 1959, se výskyt záškrtu v zemi do roku 1966 ve srovnání s rokem 1958 snížil 45krát a jeho ukazatel v roce 1969 činil 0,7 na 100 000 obyvatel. Následné snížení objemu očkování v 80. letech 20. století vedlo k vážným důsledkům. V letech 1993-1996 zasáhla Rusko epidemie záškrtu. Onemocněli dospělí, zejména neočkovaní, a děti. V roce 1994 bylo registrováno téměř 40 tisíc pacientů. V souvislosti s tím bylo obnoveno hromadné očkování. Během tohoto období bylo očkováno 132 milionů lidí, z toho 92 milionů dospělých. V letech 2000-2001 činila proočkovanost dětí ve stanovené lhůtě 96 % a revakcinace 94 %. Díky tomu se výskyt záškrtu v roce 2001 snížil 15krát ve srovnání s rokem 1996. Aby se však výskyt snížil na ojedinělé případy, je nutné očkovat alespoň 97–98 % dětí v prvním roce života a v následujících letech zajistit hromadné revakcinace. Je nepravděpodobné, že by záškrt v nadcházejících letech byl zcela eliminován kvůli širokému přenosu toxigenních i netoxigenních bakterií záškrtu. Vyřešení tohoto problému bude také nějakou dobu trvat.