Úloha enzymů a cytokinů v patogenezi osteoartrózy

V posledních letech se velká pozornost výzkumníků zaměřuje na identifikaci proteáz zodpovědných za degradaci ECM kloubní chrupavky při osteoartróze. Podle moderních konceptů hrají matrixové metaloproteinázy (MMP) důležitou roli v patogenezi osteoartrózy. U pacientů s osteoartrózou je detekována zvýšená hladina tří MMP - kolagenáz, stromelysinů a želatináz. Kolagenáza je zodpovědná za degradaci nativního kolagenu, stromelysin - kolagenu typu IV, proteoglykanů a lamininu, želatináza - za degradaci želatiny, kolagenů IV, Vh XI typů, elastinu. Kromě toho se předpokládá přítomnost dalšího enzymu - agrekanázy, která má vlastnosti MMP a je zodpovědná za proteolýzu agregátů chrupavčitých proteoglykanů.

V lidské kloubní chrupavce byly identifikovány tři typy kolagenáz, jejichž hladiny jsou u pacientů s osteoartrózou významně zvýšené: kolagenáza-1 (MMP-1), kolagenáza-2 (MMP-8) a kolagenáza-3 (MMP-13). Koexistence tří různých typů kolagenáz v kloubní chrupavce naznačuje, že každá z nich hraje svou specifickou roli. Kolagenázy-1 a -2 jsou lokalizovány hlavně v povrchové a horní střední zóně kloubní chrupavky, zatímco kolagenáza-3 se nachází v dolní střední zóně a v hluboké zóně. Výsledky imunohistochemické studie navíc ukázaly, že s postupující osteoartrózou hladina kolagenázy-3 dosahuje plató a dokonce klesá, zatímco hladina kolagenázy-1 postupně roste. Existují důkazy o tom, že u osteoartrózy se kolagenáza-1 podílí hlavně na zánětlivém procesu v kloubní chrupavce, zatímco kolagenáza-3 se podílí na remodelaci tkání. Kolagenáza-3, exprimovaná v chrupavce pacientů s osteoartrózou, degraduje kolagen typu II intenzivněji než kolagenáza-1.

Z představitelů druhé skupiny metaloproteináz byly v lidském stromelysinu identifikovány také tři: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) a stromelysin-3 (MMP-11). Dnes je známo, že do patologického procesu při osteoartróze se zapojuje pouze stromelysin-1. Stromelysin-2 není detekován v synoviální membráně pacientů s osteoartrózou, ale nachází se ve velmi malém množství v synoviálních fibroblastech pacientů s revmatoidní artritidou. Stromelysin-3 se také nachází v synoviální membráně pacientů s revmatoidní artritidou v blízkosti fibroblastů, zejména ve fibrózních zónách.

Ve skupině želatináz v lidské chrupavčité tkáni byly identifikovány pouze dvě: 92 kD želatináza (gelatinaza B neboli MMP-9) a 72 kD želatináza (gelatinaza A neboli MMP-2); u pacientů s osteoartrózou je stanoveno zvýšení hladiny 92 kD želatinázy.

Nedávno byla identifikována další skupina MMP, které jsou lokalizovány na povrchu buněčných membrán a nazývají se MMP membránového typu (MMP-MT). Tato skupina zahrnuje čtyři enzymy - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Exprese MMP-MT byla nalezena v lidské kloubní chrupavce. Ačkoli má MMP-MT-1 kolagenázové vlastnosti, oba enzymy, MMP-MT-1 a MMP-MT-2, jsou schopny aktivovat želatinázu-72 kDa a kolagenázu-3. Úloha této skupiny MMP v patogenezi osteoartrózy vyžaduje objasnění.

Proteinázy jsou vylučovány ve formě zymogenu, který je aktivován jinými proteinázami nebo organickými sloučeninami rtuti. Katalytická aktivita MMP závisí na přítomnosti zinku v aktivní zóně enzymu.

Biologická aktivita MMP je řízena specifickými TIMP. Dosud byly identifikovány tři typy TIMP, které se nacházejí v lidských kloubních tkáních: TIMP-1–TIMP-3. Čtvrtý typ TIMP byl identifikován a klonován, ale dosud nebyl v lidských kloubních tkáních detekován. Tyto molekuly se specificky vážou na aktivní místo MMP, ačkoli některé z nich jsou schopny vázat se na aktivní místo 72 kD progelatinázy (TIMP-2, -3, -4) a 92 kD progelatinázy (TIMP-1 a -3). Důkazy naznačují, že u osteoartrózy existuje nerovnováha mezi MMP a TIMP v kloubní chrupavce, což vede k relativnímu nedostatku inhibitorů, pravděpodobně částečně v důsledku zvýšení hladiny aktivních MMP v tkáni. TIMP-1 a -2 se nacházejí v kloubní chrupavce a jsou syntetizovány chondrocyty. U osteoartózy je v synoviální membráně a synoviální tekutině detekován pouze TIMP typu I. TIMP-3 se nachází výhradně v extracelulární matrici (ECM). TIMP-4 sdílí téměř 50 % své aminokyselinové sekvence s TIMP-2 a 38 % s TIMP-1. V jiných cílových buňkách je TIMP-4 zodpovědný za modulaci aktivace 72 kD progelatinázy na buněčném povrchu, což naznačuje důležitou roli tkáňově specifického regulátoru remodelace ECM.

Dalším mechanismem pro řízení biologické aktivity MMP je jejich fyziologická aktivace. Předpokládá se, že enzymy z rodiny serinových a cysteinových proteáz, jako je AP/plazmin a kathepsin B, jsou fyziologickými aktivátory MMP. Zvýšené hladiny urokinázy (uAP) a plazminu byly nalezeny v kloubní chrupavce pacientů s osteoartrózou.

Přestože se v kloubních tkáních nachází několik typů katepsinů, katepsin-B je považován za nejpravděpodobnější aktivátor MMP v chrupavce. V lidských kloubních tkáních byly nalezeny fyziologické inhibitory serinových a cysteinových proteáz. Aktivita inhibitoru AP-1 (IAI-1), stejně jako cysteinových proteáz, je u pacientů s osteoartrózou snížena. Podobně jako u MMP/TIMP, je to nerovnováha mezi serinovými a cysteinovými proteázami a jejich inhibitory, která může vysvětlovat zvýšenou aktivitu MMP v kloubní chrupavce pacientů s osteoartrózou. MMP se navíc dokáží navzájem aktivovat. Například stromelysin-1 aktivuje kolagenázu-1, kolagenázu-3 a 92 kD gelatinázu; kolagenáza-3 aktivuje 92 kD gelatinázu; MMP-MT aktivuje kolagenázu-3 a gelatináza-72 kDa tuto aktivaci zesiluje; MMP-MT také aktivuje 72 kDa gelatinázu. Cytokiny lze rozdělit do tří skupin – destruktivní (zánětlivé), regulační (včetně protizánětlivých) a anabolické (růstové faktory).

Typy cytokinů (podle van den Berg WB et al)

Destruktivní	Interleukin-1 TNF-α Inhibiční faktor leukémie Interleukin-17
Regulační	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Inhibitory enzymů
Anabolický	Inzulínu podobné růstové faktory TGF-β Kostní morfogenetické proteiny Morfogenetické proteiny odvozené z chrupavky

Destruktivní cytokiny, zejména IL-1, indukují zvýšené uvolňování proteáz a inhibují syntézu proteoglykanů a kolagenů chondrocyty. Regulační cytokiny, zejména IL-4 a -10, inhibují produkci IL-1, zvyšují produkci antagonisty receptoru IL-1 (IL-1RA) a snižují hladinu NO syntázy v chondrocytech. IL-4 tedy působí proti IL-1 ve třech směrech: 1) snižuje produkci a brání jeho účinkům, 2) zvyšuje produkci hlavního „scavengeru“ IL-1RA a 3) snižuje produkci hlavního sekundárního „posla“ NO. Kromě toho IL-4 snižuje enzymatickou degradaci tkání. In vivo se optimálního terapeutického účinku dosahuje kombinací IL-4 a IL-10. Anabolické faktory, jako jsou TGF-β a IGF-1, ve skutečnosti neovlivňují produkci ani působení IL-1, ale vykazují opačnou aktivitu, například stimulují syntézu proteoglykanů a kolagenu, potlačují aktivitu proteáz a TGF-β také inhibuje uvolňování enzymů a stimuluje jejich inhibitory.

Prozánětlivé cytokiny jsou zodpovědné za zvýšenou syntézu a expresi MMP v kloubních tkáních. Jsou syntetizovány v synoviální membráně a poté difundují do kloubní chrupavky synoviální tekutinou. Prozánětlivé cytokiny aktivují chondrocyty, které jsou zase schopny produkovat prozánětlivé cytokiny. V kloubech postižených osteoartrózou hrají roli efektoru zánětu především buňky synoviální membrány. Jsou to synovocyty makrofágového typu, které vylučují proteázy a zánětlivé mediátory. Mezi nimi se na patogenezi osteoartrózy nejvíce „podílejí“ IL-f, TNF-a, IL-6, leukemický inhibiční faktor (LIF) a IL-17.

Biologicky aktivní látky, které stimulují degradaci kloubní chrupavky při osteoartróze

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-α
• Faktory stimulující kolonie: makrofágy (monocyty) a granulocyty-makrofágy
• Látka P
• Strana ₂
• Aktivátory plazminogenu (tkáňového a urokinázového typu) a plazmin
• Metaloproteinázy (kolagenázy, ellastázy, stromelysiny)
• Katepsiny A a B
• Trilsin
• Bakteriální lipopolysacharidy
• Fosfolipáza Ag

Literární údaje naznačují, že IL-1 a pravděpodobně i TNF-a jsou hlavními mediátory destrukce kloubní tkáně při osteoartróze. Dosud však není známo, zda působí nezávisle na sobě, nebo zda mezi nimi existuje funkční hierarchie. Zvířecí modely osteoartrózy ukázaly, že blokáda IL-1 účinně zabraňuje destrukci kloubní chrupavky, zatímco blokáda TNF-a vede pouze ke snížení zánětu v kloubních tkáních. Zvýšené koncentrace obou cytokinů byly nalezeny v synoviální membráně, synoviální tekutině a chrupavce pacientů. V chondrocytech jsou schopny zvýšit syntézu nejen proteáz (zejména MMP a AP), ale i vedlejších kolagenů, jako jsou typy I a III, a snížit syntézu kolagenů typu II a IX a proteoglykanů. Tyto cytokiny také stimulují reaktivní formy kyslíku a zánětlivé mediátory, jako je PGE2 _. Výsledkem těchto makromolekulárních změn v kloubní chrupavce při osteoartróze je neúčinnost reparačních procesů, což vede k další degradaci chrupavky.

Výše uvedené prozánětlivé cytokiny modulují procesy suprese/aktivace MMP u osteoartrózy. Například nerovnováha mezi hladinami TIMP-1 a MMP v chrupavce u osteoartrózy může být zprostředkována IL-1, protože studie in vitro prokázala, že zvýšení koncentrací IL-1 beta vede ke snížení koncentrací TIMP-1 a zvýšení syntézy MMP chondrocyty. Syntéza AP je také modulována IL-1 beta. Stimulace chondrocytů kloubní chrupavky pomocí IL-1 in vitro způsobuje na dávce závislé zvýšení syntézy AP a prudký pokles syntézy iAP-1. Schopnost IL-1 snižovat syntézu iAP-1 a stimulovat syntézu AP je účinným mechanismem pro tvorbu plazminu a aktivaci MMP. Plazmin navíc není jen enzym, který aktivuje jiné enzymy, ale také se podílí na procesu degradace chrupavky přímou proteolýzou.

IL-ip je syntetizován jako neaktivní prekurzor o hmotnosti 31 kD (pre-IL-ip) a poté se po odštěpení signálního peptidu přemění na aktivní cytokin o hmotnosti 17,5 kD. V kloubních tkáních, včetně synoviální membrány, synoviální tekutiny a kloubní chrupavky, se IL-ip nachází v aktivní formě a studie in vivo prokázaly schopnost synoviální membrány při osteoartróze tento cytokin vylučovat. Některé serinové proteázy jsou schopny přeměnit pre-IL-ip na jeho bioaktivní formu. U savců byly tyto vlastnosti zjištěny pouze u jedné proteázy, která patří do rodiny enzymů specifických pro cystein-aspartát a nazývá se IL-1β-konvertující enzym (ICF nebo kaspáza-1). Tento enzym je schopen specificky přeměnit pre-IL-ip na biologicky aktivní „zralý“ IL-ip o hmotnosti 17,5 kD. ICF je proenzym (p45) o hmotnosti 45 kD, který je lokalizován v buněčné membráně. Po proteolytickém štěpení proenzymu p45 se vytvoří dvě podjednotky známé jako p10 a p20, které se vyznačují enzymatickou aktivitou.

TNF-α je také syntetizován jako membránově vázaný prekurzor s hmotností 26 kDa; proteolytickým štěpením se z buňky uvolňuje jako aktivní rozpustná forma s hmotností 17 kDa. Proteolytické štěpení se provádí pomocí enzymu konvertujícího TNF-α (TNF-AC), který patří do rodiny adamalizinů. AR Amin a kol. (1997) zjistili zvýšenou expresi mRNA TNF-AC v kloubní chrupavce pacientů s osteoartritidou.

Biologická aktivace chondrocytů a synovocytů IL-1 a TNF-a je zprostředkována vazbou na specifické receptory na povrchu buněk - IL-R a TNF-R. Pro každý cytokin byly identifikovány dva typy receptorů - IL-IP typu I a II a TNF-R typu I (p55) a II (p75). IL-1PI a p55 jsou zodpovědné za přenos signálu v buňkách kloubní tkáně. IL-1R typu I má mírně vyšší afinitu k IL-1beta než k IL-1a; IL-1R typu II má naopak vyšší afinitu k IL-1a než k IL-ip. Zůstává nejasné, zda IL-IP typu II může zprostředkovávat signály IL-1, nebo slouží pouze ke kompetitivní inhibici asociace IL-1 s IL-1R typu I. Chondroitidy a synoviální fibroblasty pacientů s osteoartrózou obsahují velké množství IL-1PI a p55, což zase vysvětluje vysokou citlivost těchto buněk na stimulaci odpovídajícími cytokiny. Tento proces vede jak ke zvýšené sekreci proteolytických enzymů, tak k destrukci kloubní chrupavky.

Účast IL-6 v patologickém procesu osteoartrózy nelze vyloučit. Tento předpoklad je založen na následujících pozorováních:

• IL-6 zvyšuje počet zánětlivých buněk v synoviální membráně,
• IL-6 stimuluje proliferaci chondrocytů,
• IL-6 zesiluje účinky IL-1 při zvyšování syntézy MMP a inhibici syntézy proteoglykanů.

IL-6 je však schopen indukovat produkci TIMP, ale neovlivňuje produkci MMP, proto se předpokládá, že tento cytokin se podílí na procesu inhibice proteolytické degradace kloubní chrupavky, která probíhá mechanismem zpětné vazby.

Dalším členem rodiny IL-6 je LIF, cytokin produkovaný chondrocyty získanými od pacientů s osteoartrózou v reakci na stimulaci prozánětlivými cytokiny IL-1p a TNF-a. LIF stimuluje resorpci proteoglykanů chrupavky, stejně jako syntézu MMP a produkci NO. Úloha tohoto cytokinu v osteoartróze nebyla dosud plně objasněna.

IL-17 je homodimer o hmotnosti 20-30 kD s účinkem podobným IL-1, ale mnohem méně výrazným. IL-17 stimuluje syntézu a uvolňování řady prozánětlivých cytokinů, včetně IL-1p, TNF-a, IL-6 a MMP v cílových buňkách, jako jsou lidské makrofágy. Kromě toho IL-17 stimuluje produkci NO chondrocyty. Stejně jako LIF byla role IL-17 v patogenezi osteoartrózy dosud nedostatečně studována.

Anorganický volný radikál NO hraje důležitou roli v degradaci kloubní chrupavky u osteoartrózy. Chondrocyty izolované od pacientů s osteoartrózou produkují vyšší množství NO, a to jak spontánně, tak po stimulaci prozánětlivými cytokiny, ve srovnání s normálními buňkami. Vysoký obsah NO byl nalezen v synoviální tekutině a séru pacientů s osteoartrózou – to je důsledek zvýšené exprese a syntézy indukované NO syntázy (hNOC), enzymu zodpovědného za produkci NO. Nedávno byla klonována DNA hNOC specifického pro chondrocyty a byla stanovena aminokyselinová sekvence enzymu. Aminokyselinová sekvence ukazuje 50% identitu a 70% podobnost s hNOC specifickým pro endotel a nervovou tkáň.

NO inhibuje syntézu makromolekul extracelulárního materiálu (ECM) kloubní chrupavky a stimuluje syntézu MMP. Zvýšení produkce NO je navíc doprovázeno snížením syntézy antagonisty IL-IP (IL-1RA) chondrocyty. Zvýšení hladiny IL-1 a snížení IL-1RA tedy vede k hyperstimulaci NO v chondrocytech, což následně vede ke zvýšené degradaci chrupavčité matrix. Existují zprávy o terapeutickém účinku selektivního inhibitoru hNOC in vivo na progresi experimentální osteoartrózy.

Přirozené inhibitory cytokinů jsou schopny přímo zabránit vazbě cytokinů na receptory buněčné membrány, čímž snižují jejich prozánětlivou aktivitu. Přirozené inhibitory cytokinů lze rozdělit do tří tříd na základě jejich mechanismu účinku.

První třída inhibitorů zahrnuje antagonisty receptorů, kteří brání vazbě ligandu na jeho receptor kompeticí o vazebné místo. Dosud byl takový inhibitor nalezen pouze pro IL-1 – jedná se o výše zmíněný kompetitivní inhibitor systému IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA blokuje mnoho účinků, které jsou pozorovány v kloubních tkáních při osteoartróze, včetně syntézy prostaglandinů synoviálními buňkami, produkce kolagenázy chondrocyty a degradace kostní hmoty kloubní chrupavky.

IL-1RA se nachází v různých formách – jedné rozpustné (rIL-1RA) a dvou intercelulárních (μIL-lPAI a μIL-1RAP). Afinita rozpustné formy IL-1RA je 5krát vyšší než u intercelulárních forem. Navzdory intenzivnímu vědeckému výzkumu zůstává funkce intercelulárních forem neznámá. Experimenty in vitro ukázaly, že inhibice aktivity IL-1beta vyžaduje koncentraci IL-1RA 10–100krát vyšší než je normální, zatímco podmínky in vivo vyžadují tisícinásobné zvýšení koncentrace IL-1RA. Tato skutečnost může částečně vysvětlovat relativní nedostatek IL-1RA a nadbytek IL-1 v synovii pacientů s osteoartrózou.

Druhou třídou přirozených inhibitorů cytokinů jsou rozpustné cytokinové receptory. Příklady takových inhibitorů u lidí, které souvisejí s patogenezí osteoartrózy, jsou rIL-1R a pp55. Rozpustné cytokinové receptory jsou zkrácené formy normálních receptorů; když se vážou na cytokiny, brání jejich vazbě na membránově asociované receptory cílových buněk, a to mechanismem kompetitivního antagonismu.

Hlavním prekurzorem rozpustných receptorů je membránově vázaný IL-1RP. Afinita rIL-IP k IL-1 a IL-1RA je odlišná. rIL-1RN má tedy vyšší afinitu k IL-1β než k IL-1RA a rIL-1PI vykazuje vyšší afinitu k IL-1RA než k IL-ip.

Existují také dva typy rozpustných receptorů pro TNF - pp55 a pp75, které, podobně jako rozpustné receptory IL-1, vznikají „uvolňováním“. In vivo se oba receptory nacházejí v tkáních postižených kloubů. Úloha rozpustných receptorů TNF v patogenezi osteoartrózy je předmětem diskusí. Předpokládá se, že v nízkých koncentracích stabilizují trojrozměrnou strukturu TNF a prodlužují poločas rozpadu bioaktivního cytokinu, zatímco vysoké koncentrace pp55 a pp75 mohou snižovat aktivitu TNF kompetitivním antagonismem. Pravděpodobně může pp75 působit jako nosič TNF, což usnadňuje jeho vazbu na membránově asociovaný receptor.

Třetí třídu přirozených inhibitorů cytokinů představuje skupina protizánětlivých cytokinů, mezi které patří TGF-beta, IL-4, IL-10 a IL-13. Protizánětlivé cytokiny snižují produkci prozánětlivých a některých proteáz a stimulují produkci IL-1RA a TIMP.