Úloha enzymů a cytokinů v patogenezi osteoartrózy

V posledních letech se velký počet výzkumů zaměřil na identifikaci proteáz odpovědných za degradaci ECM kloubní chrupavky při osteoartritidě. Podle moderních myšlenek hraje významnou roli v patogenezi osteoartrózy matrixové metaloproteázy (MMP). Pacienti s osteoartritidou mají zvýšené množství tří zástupců MMP - kolagenáz, stromelyzinů a gelatináz. Kolagenáza je zodpovědný za degradaci nativního kolagenu, stromelysin - kolagen typu IV, laminin a proteoglykany, azhelatinaza - za degradaci želatiny, kolagen IV, Vh typy XI elastinu. Navíc přítomnost jiného enzymu - agrekanasy, který má vlastnosti MMP a je zodpovědný za proteolýzu chrupavkových proteoglykanových agregátů.

Kloubní chrupavky lidských kolagenáz identifikovány tři typy úrovních, které jsou zvýšeny u pacientů s osteoartritidou - kolagenázy-1 (MMP-1), kolagenáza-2 (MMP-8), kolagenáza-3 (MMP-13). Koexistence tří různých typů kolagenáz v kloubní chrupavce znamená, že každá z nich hraje svou vlastní specifickou roli. Opravdu, kolagenáza-1 a -2 jsou lokalizovány převážně v povrchové a horní mezilehlé oblasti kloubní chrupavky, zatímco kolagenáza-3 se nachází v dolní části mezilehlých a hluboké zóny. Kromě toho, výsledky imunohistochemické studie ukázaly, že v průběhu progrese úrovně osteoartrózy kolagenázy-3 dosáhne plateau, nebo dokonce klesá, zatímco úroveň kolagenázy-1 se postupně zvyšuje. Existují důkazy o tom, že u osteoartrózy kolagenáza-1 je hlavně zapojený do zánětlivého procesu v kloubní chrupavky, zatímco kolagenáza-3 - přestavby tkání. Cartilagin-3, vyjádřený v chrupavce pacientů s OA, provádí intenzivněji degradaci kolagenu typu II než kolagenasa-1.

Zástupců druhé skupiny metaloproteáz lidské stromelizinovu identifikovaný jako tři - stromelysin-1 (MMP-3), stromelysinu-2 (MMP-10) a stromelysin-3 (MMP-11). Dnes je známo, že pouze stromelysin-1 je zapojen do patologického procesu při osteoartróze. V synoviální membráně u pacientů s osteoartritidou nejsou stanoveny stromelysinu-2, ale bylo zjištěno, ve velmi malých množstvích v synoviálních fibroblastech pacientů s revmatoidní artritidou. Stromelysin-3, také nalezeny v synovii u pacientů s revmatoidní artritidou v blízkosti fibroblastů, a to zejména v oblastech fibrózy.

Ve skupině gelatinázy v chrupavkové tkáně lidského označené pouze dvě - 92 kDa gelatináza (gelatináza B, nebo MMP-9) a 72 kDa gelatináza (želatináza A, nebo MMP-2); u pacientů s osteoartritidou se zjistí zvýšení hladiny 92 kD želatinázy.

Ne tak dávno byla identifikována jiná skupina MMP, která jsou lokalizována na povrchu buněčných membrán a jsou nazývána membránovým typem MMP (MMP-MT). K této skupině patří čtyři enzymy - MMP-MT1-MMP-MT-4. Exprese MMP-MT se nalézá v lidské kloubní chrupavce. I když MMP-MT-1 má vlastnosti kolagenázy, MMP-MT-1 a MMP-MT-2 jsou schopny aktivovat želatinázu - 72 kD a kolagenázu-3. Úloha této skupiny MMP v patogenezi OA vyžaduje vylepšení.

Proteinázy jsou sekretovány ve formě zymogenu, který je aktivován jinými proteinázami nebo organickými sloučeninami rtuti. Katalytická aktivita MMP závisí na přítomnosti zinku v aktivní zóně enzymu.

Biologická aktivita MMP je řízena specifickými TIMP. K dnešnímu dni byly identifikovány tři typy TIMP, které se nacházejí v lidských artikulárních tkáních, TIMP-1-TIMP-3. Čtvrtý typ TIMP je identifikován a klonován, ale dosud nebyl zjištěn v lidských artikulárních tkáních. Tyto molekuly se specificky váží k aktivnímu místu MMP, i když některé z nich jsou schopny se vázat na aktivní místo 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) a 92 kDa progelatinase (TIMP-1 a -3). Data ukazují, že OA chrupavky v nerovnováze mezi MMPs a TIMP, které vede k relativního nedostatku inhibitorů, které mohou být částečně souvisejí se zvýšenou aktivitou MMP ve tkáni. TIMP-1 a -2 se nacházejí v kloubní chrupavce, jsou syntetizovány chondrocyty. Při osteoartritidě v synoviální membráně a synoviální tekutině byl zjištěn pouze první typ TIMP. TIMP-3 je detekován výhradně v modulu ECM. TIMP-4 má téměř identickou sekvenci aminokyselin s TIMP-2 a-ZINA přibližně 38% -STIMP-1 téměř o 50%. Jiné cílové buňky TIMP-4 je odpovědný za modulaci aktivace progelatinase 72 kD povrchu buněk, což naznačuje důležitou úlohu jako regulátor ECM remodelace tkáňově specifické.

Dalším mechanismem pro kontrolu biologické aktivity MMP je jejich fyziologická aktivace. Předpokládá se, že enzymy z rodiny serinových a cysteinových proteáz, jako jsou AP / plasmin a katepsin B, jsou fyziologickými aktivátory MMP. V kloubní chrupavce pacientů s osteoartritidou byla zjištěna zvýšená hladina urokinázy (UAP) a plazminu.

Navzdory skutečnosti, že v kloubech tkání se vyskytuje několik typů katepsinů, je katepsin-B považován za nejpravděpodobnější aktivátor MMP v chrupavce. V tkáních lidského kloubu byly detekovány fyziologické inhibitory serinových a cysteinových proteáz. Aktivita inhibitoru AP-1 (IAP-1), stejně jako cysteinových proteáz, je u pacientů s osteoartritidou snížena. Podobně jako u MMP / TIMP je nerovnováha mezi serinovými a cysteinovými proteázami a jejich inhibitory, která může vysvětlit zvýšenou aktivitu MMP v kloubní chrupavce pacientů s osteoartritidou. Kromě toho se MMP mohou navzájem aktivovat. Například stromelysin-1 aktivuje kolagenázu-1, kolagenázu-3 a želatinázu 92 kD; Kolagenasa-3 aktivuje 92 kD želatinázu; MMP-MT aktivuje kolagenázu-3 a želatinasa-72 kD tuto aktivaci potencuje; MMP-MT také aktivuje 72 kD gelatinázu. Cytokiny mohou být rozděleny do tří skupin - destruktivní (prozánětlivé), regulační (včetně protizánětlivých) a anabolické (růstové faktory).

Druhy cytokinů (podle van den Berg WB a kol.)

Destruktivní	Interleukin-1 TNF-a Leukemický inhibiční faktor Interleukin-17
Regulační	Interlekin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Inhibitory enzymu
Anabolické	Msulin-like růstové faktory TGF-b Kostní morfogenetické proteiny Morfogenetické bílkoviny pocházející z chrupavky

Destruktivní cytokiny, zejména IL-1 indukované zvýšení uvolňování proteáz a inhibují syntézu proteoglykanů a kolageny chondrocyty. Regulační, že cytokiny, zejména IL-4 a -10, inhibují produkci antagonisty receptoru IL-1, za účelem zvýšení produkce IL-1 (IL-1 RA), a snížení aktivity úroveň a NO-syntázy v chondrocytů. Tak, IL-4 antagonizuje IL-1 třemi způsoby: 1) snižuje produkci a zabraňuje jeho účinků, 2) zvyšuje produkci základní „scavenger“ IL-1PA a 3) snižuje produkci primární sekundární „messenger» NO. Navíc IL-4 snižuje enzymatickou degradaci tkáně. V podmínkách in vivo optimálního terapeutického účinku je dosaženo kombinací IL-4 a IL-10. Anabolické faktory, jako kakTFR-p, a IGF-1, není opravdu zasahovat do produkce nebo působení IL-1, ale znázorňující opačnou aktivitu, například stimulují syntézu proteoglykanu a kolagenu, inhibují aktivitu proteázy a TGF (3, také inhibuje uvolňování enzymů a stimuluje jejich inhibitory.

Prozánětlivé cytokiny jsou odpovědné za zvýšenou syntézu a expresi MMP v tkáních kloubů. Syntetizují se v synoviální membráně a pak se difundují do kloubní chrupavky synoviální tekutinou. Prozánětlivé cytokiny aktivují chondrocyty, které jsou dále schopné produkovat prozánětlivé cytokiny. U kloubů postižených osteoartrózou hraje roli efektoru zánětu především buňky synoviální membrány. Jedná se o synovitidu typu makrofágu, která vylučuje proteázy a mediátory zánětu. Patří mezi ně, v patogenezi osteoartritidy se nejvíce podílejí IL-f, TNF-a, IL-6, leukemický inhibiční faktor (LIF) a IL-17.

Biologicky aktivní látky, které stimulují kloubní degradaci chrupavky při osteoartritidě

• Interleukin-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Faktory stimulující kolony: makrofágy (monocytické) a granulocytární makrofágy
• Látka P
• PGE ₂
• Aktivátory plasminogenu (typy tkáně a urokinázy) a plazmin
• Metaloproteázy (kolagenázy, ellastázy, stromelyzyny)
• Katepsiny A a B
• detektivka
• Bakteriální lipopolysacharidy
• Fosfolipáza Ag

V literatuře se navrhuje, že IL-ip a možná TNF-a - hlavní mediátory destrukcí kloubních tkání v osteoartrózy. Nicméně ještě není známo, zda fungují nezávisle na sobě nebo zda mezi nimi existuje funkční hierarchie. Na modelech osteoartrózy na zvířatech bylo prokázáno, že IL-1 blokáda účinně brání destrukci kloubní chrupavky, zatímco blokáda TNF-a vede k oslabení zánětu v kloubních tkáních. V synoviální membráně, synoviální tekutině a chrupavce pacientů byla zjištěna zvýšená koncentrace obou cytokinů. Chondrocyty jsou schopné zvýšit syntézu nejen proteáz (MMP a hlavně AP), ale i menší kolagenů, jako je typu I a III, jakož i snížit syntézu kolagenu typu II a IX a proteoglykany. Tyto cytokiny také stimulovat aktivních forem kyslíku a zánětlivé mediátory, jako PGE ₂. Výsledkem takových makromolekulárních změn kloubní chrupavky v osteoartritidy je neúčinné opravné procesy, což vede k další degradaci chrupavky.

Výše uvedené prozánětlivé cytokiny modulují procesy inhibice / aktivace MMP při osteoartritidě. Například, nerovnováha mezi úrovní TIMP-1 a MMP v chrupavce v osteoartritidy může být zprostředkována IL-ip, protože studie in vitro prokázaly, že zvýšení koncentrace IL-1 beta snižuje koncentraci TIMP-1 a MMP zvýšená syntéza chondrocyty. Syntéza AP je také modulována IL-1 beta. Stimulace in vitro chondrocytech kloubní chrupavky s IL-1 vyzyvet dávce závislé zvýšení syntézy a prudkému poklesu AP syntézy PAI-1. Schopnost IL-1 pro snížení syntézy PAI-1, syntézy a stimulovat AP je silný mechanismus pro generování plasminu aktivace a MMP. Kromě toho, plasmin je nejen enzym aktivující jiné enzymy, ale také se podílí na degradaci chrupavky přímou proteolýzou.

IL-ip je syntetizován jako inaktivní prekurzorové hmotnosti 31 kD (pre-IL-ip), Azat, po odštěpení signálního peptidu, je konvertován na aktivní cytokinu z hmotnosti 17,5 kD. V tkáních kloubů, včetně synoviální membrány a synoviální tekutině kloubní chrupavky, IL-ip detekován v aktivní formě, a ve studiích in vivo prokázaly schopnost synoviální membrány v osteoartritidě sekreci tohoto cytokinu. Některé serinové proteázy jsou schopné přeměnit pre-IL-ip na svou bioaktivní formu. U savců, takové vlastnosti se nacházejí pouze v jedné proteázy, který patří do rodiny cystein aspartatspetsificheskih enzymů zvané IL-1p-konvertujícího enzymu (IKF nebo kaspáza-1). Tento enzym je schopen specificky konverzi pre-IL-ip biologicky aktivní „zralé“ IL-ip s hmotností 17,5 kD. IKF - proenzymem s molekulovou hmotností 45 kDa (p45), která je lokalizovaná v buněčné membráně. Po proenzima P45 proteolytickým štěpením za vzniku dvou podjednotek, známé jako P10 a P20, který je charakteristický pro enzymatickou aktivitu.

TNF-a je také syntetizován jako prekurzor vázající membránu s hmotností 26 kD; proteolytickým štěpením se uvolňuje z buňky jako aktivní rozpustná forma s hmotností 17 kD. Proteolytické štěpení se provádí TNF-a-konvertujícím enzymem (TNF-KF), který patří do skupiny adamalysinů. AR Amin a spoluautoři (1997) zjistili zvýšenou expresi TNF-CF mRNA v kloubní chrupavce pacientů s osteoartritidou.

Biologická aktivace chondrocytů a sinovitsitov IL-1 a TNF-a zprostředkován vazbou na specifické receptory na povrchu buněk - IL-R a TNF-R. Pro každý cytokin identifikovány dva typy receptorů - IL-IP I a typu II a TNF-R I (p55) a II (p75) typy. Pro přenos signálů v buňkách kloubních tkání reaguje IL-1PI a p55. IL-1P typu I má mírně vyšší afinitu k IL-1 beta než k IL-la; IL-1P typ II - naopak má větší afinitu k IL-1a než k IL-ip. Zůstává nejasné, zda může IL-IP II typu II zprostředkovat signál IL-1 nebo že slouží pouze k kompetitivní inhibici vazby IL-1 na typ IL-1PI. V hondroiitah a synoviálních fibroblastů pacientů s osteoartritidou nalézt velké množství IL-1PI a p55, což vysvětluje vysokou citlivost těchto buněk na stimulaci cytokiny relevantní. Tento proces vede jak ke zvýšení sekrece proteolytických enzymů, tak ke zničení kloubní chrupavky.

Není vyloučena účast IL-6 v patologickém procesu u osteoartrózy. Tento předpoklad vychází z následujících poznámek:

• IL-6 zvyšuje počet zánětlivých buněk v synoviální membráně,
• IL-6 stimuluje proliferaci chondrocytů,
• IL-6 zvyšuje účinky IL-1 na zvýšení syntézy MMP a inhibici syntézy proteoglykanů.

Nicméně, IL-6 je schopný vyvolat produkci TIMP, ale nemá vliv na produkci MMP je proto za to, že tento cytokin se podílí na procesu zadržení proteolytické degradaci kloubní chrupavky, která se provádí pomocí mechanismu zpětné vazby.

Další reprezentativní rodiny IL-6 je LIF - cytokin, který je produkován chondrocytů získaných od pacientů s osteoartritidou, v odezvě na stimulaci prozánětlivými cytokiny, IL-ip a TNF-a. LIF stimuluje resorpci proteoglykanů chrupavky, stejně jako syntézu produkce MMP a NO. Úloha tohoto cytokinu při osteoartróze není plně pochopena.

IL-17 je 20-30 kD homodimer, který má podobný účinek na IL-1, ale mnohem méně výrazný. IL-17 stimuluje syntézu a uvolňování řady prozánětlivých cytokinů, včetně IL-ip, TNF-a, IL-6 a MMP v cílových buňkách, jako jsou lidské makrofágy. Navíc IL-17 stimuluje produkci NO s chondrocyty. Podobně jako LIF byla role IL-17 v patogenezi OA jen málo studována.

Anorganický volný radikál NO hraje důležitou roli při degradaci kloubní chrupavky s OA. Chondrocyty byly získány od pacientů s osteoartritidou, produkují větší množství NO, jako sponatanno a po stimulaci prozánětlivými cytokiny, ve srovnání s normálními buňkami. Vysoké koncentrace NO detekován v synoviální tekutině a séru pacientů s osteoartritidou - je výsledkem zvýšené exprese a syntézy indukované NO-syntázy (hNOC) - enzym zodpovědný za produkci NO. Nedávno byla klonována DNA specifické pro chondrocyty hNOC, byla určena aminokyselinová sekvence enzymu. Aminokyselinová sekvence označuje 50% identitu a 70% podobnost s hNOC specifickou pro endotel a nervové tkáně.

NO inhibuje syntézu makromolekul ECM kloubní chrupavky a stimuluje syntézu MMP. Kromě toho je zvýšení produkce NO doprovázeno snížením syntézy antagonisty IL-IP (IL-1RA) chondrocyty. Zvýšení hladiny IL-1 a snížení hladiny IL-1 RA vede k hyperstimulaci NO chondrocytů, což vede k vyšší degradaci matrice chrupavky. Byly hlášeny terapeutické účinky in vivo selektivního inhibitoru hNOC na progresi experimentální osteoartrózy.

Přírodní cytokinové inhibitory mohou přímo inhibovat vazbu cytokinů na receptory buněčných membrán a snižovat jejich prozánětlivou aktivitu. Přírodní inhibitory cytokinů lze rozdělit do tří tříd podle způsobu jejich působení.

První třída inhibitorů zahrnuje antagonisty receptoru, které brání vazbě ligandu na jeho receptor prostřednictvím soutěže o vazebné místo. K dnešnímu dni je tento inhibitor je k dispozici pouze pro IL-1 - je nad kompetitivní inhibitor systému IL-1 / IL-1 ILIP PA. IL-1 RA blokuje mnoho účinků, které jsou pozorovány v tkáních kloubů u osteoartritidy, včetně syntézy prostaglandinů u synoviálních buněk, produkce kolagenázy chondrocyty a degradací chrupavky ve skříňce.

IL-1PA je detekován v různých formách - jeden rozpustný (rIL-1PA) a dva intercelulární (μIL-1PAI a μIL-1APAP). Afinita rozpustné formy IL-1RA je 5krát vyšší než u intercelulárních forem. Navzdory intenzivnímu vědeckému výzkumu zůstává jeho funkce neznáma. Eksperimety in vitro prokázaly, že inhibice IL-1 beta aktivity požadované koncentraci IL-1PA 10-100 krát překračuje limit, v podmínkách in vivo vyžaduje tisícinásobně zvýšení koncentrace IL-1PA. Tento fakt může částečně vysvětlit relativní nedostatečnost IL-1 RA a nadbytek IL-1 v synovii pacientů s osteoartritidou.

Druhá skupina přírodních inhibitorů cytokinů je reprezentována rozpustnými receptory cytokinů. Příkladem takových inhibitorů u lidí souvisejících s patogenezí osteoartrózy je pIL-1P a pp55. Rozpustné cytokinové receptory jsou zkrácené formy běžných receptoru vazbou k cytokinu, které brání jejich vazba na membránové asociované receptory cílových buněk, působí mechanismem kompetitivního antagonismu.

Hlavním prekursorem rozpustných receptorů je membránově vázaný IL-1PP. Afinita rIL-IP vzhledem k IL-1 a IL-1 PA je odlišná. Například, rIL-1RN má vyšší afinitu k IL-1 p, než IL-1 RA, a rIL-1PI - vykazuje vyšší afinitu pro IL-1PA, než IL-ip.

Pro TNF existují také dva typy rozpustných receptorů - pp55 a pp75, jako jsou rozpustné receptory IL-1, které jsou tvořeny "opletem" (dumpingem). In vivo se oba receptory nacházejí v tkáních postižených kloubů. Je diskutována úloha rozpustných TNF receptorů v patogenezi osteoartrózy. Předpokládá se, že v nízkých koncentracích, které stabilizují trojrozměrné struktury TNF a zvyšují poločas bioaktivní cytokinu, zatímco vysoké koncentrace PP55 a PP75 může snížit aktivitu TNF kompetitivního antagonismu. Zdá se, že pp75 může působit jako nosič TNF, což usnadňuje jeho vazbu na membránově asociovaný receptor.

Třetí třída přírodních inhibitorů cytokinů je reprezentována skupinou protizánětlivých cytokinů, mezi které patří TGF-beta, IL-4, IL-10 a IL-13. Protizánětlivé cytokiny snižují tvorbu prozánětlivých, stejně jako některých proteáz, stimulují produkci IL-1RA a TIMP.