Osteoartróza: jak je uspořádána kloubní chrupavka?

Normální kloubní chrupavka plní dvě hlavní funkce: absorbuje tlak deformací během mechanického zatížení a zajišťuje hladkost kloubních povrchů, což umožňuje minimalizovat tření během pohybů kloubů. To je zajištěno jedinečnou strukturou kloubní chrupavky, která se skládá z chondroitinů ponořených do extracelulární matrix (ECM).

Normální dospělou kloubní chrupavku lze rozdělit do několika vrstev nebo zón: povrchovou neboli tangenciální zónu, přechodovou zónu, hlubokou neboli radiální zónu a kalcifikovanou zónu. Vrstva mezi povrchovou a přechodovou zónou a zejména mezi přechodnou a hlubokou zónou nemá jasné hranice. Spojení mezi nekalcifikovanou a kalcifikovanou kloubní chrupavkou se nazývá „vlnitý okraj“ – linie viditelná při barvení odvápněné tkáně. Kalcifikovaná zóna chrupavky tvoří relativně konstantní podíl (6–8 %) celkové výšky průřezu chrupavky. Celková tloušťka kloubní chrupavky, včetně kalcifikované chrupavčité zóny, se mění v závislosti na zatížení konkrétní oblasti kloubního povrchu a na typu kloubu. Přerušovaný hydrostatický tlak v subchondrální kosti hraje důležitou roli v udržování normální struktury chrupavky zpomalením osifikace.

Chondrocyty tvoří přibližně 2-3 % celkové hmotnosti tkáně; v povrchové (tangenciální) zóně jsou umístěny podél a v hluboké (radiální) zóně - kolmo k povrchu chrupavky; v přechodové zóně tvoří chondrocyty skupiny 2-4 buněk rozptýlených po celé matrici. V závislosti na zóně kloubní chrupavky se hustota chondrocytů liší - nejvyšší hustota buněk je v povrchové zóně, nejnižší - v kalcifikované zóně. Hustota buněčného rozložení se navíc liší kloub od kloubu, je nepřímo úměrná tloušťce chrupavky a zatížení odpovídající oblasti.

Nejpovrchněji umístěné chondrocyty jsou diskovité a tvoří několik vrstev buněk v tangenciální zóně umístěné pod úzkým proužkem matrixu; hlouběji umístěné buňky této zóny mívají nerovnější kontury. V přechodové zóně jsou chondrocyty kulovité, někdy se sdružují do malých skupin rozptýlených v matrixu. Chondrocyty hluboké zóny mají převážně elipsoidní tvar, seskupené do radiálně umístěných řetězců 2-6 buněk. V kalcifikované zóně jsou rozmístěny ještě řidčeji; některé z nich jsou nekrotické, ačkoli většina je životaschopná. Buňky jsou obklopeny nekalcifikovanou matrix, mezibuněčný prostor je kalcifikován.

Lidská kloubní chrupavka se tedy skládá z hydratované extracelulární hmoty (ECM) a buněk v ní ponořených, které tvoří 2–3 % celkového objemu tkáně. Vzhledem k tomu, že chrupavčitá tkáň nemá krevní ani lymfatické cévy, interakce mezi buňkami, dodávání živin k nim a odstraňování metabolických produktů probíhá difuzí přes ECM. Navzdory skutečnosti, že chondrocyty jsou metabolicky velmi aktivní, se u dospělých normálně nedělí. Chondrocyty existují v prostředí bez kyslíku a předpokládá se, že jejich metabolismus je převážně anaerobní.

Každý chondrocyt je považován za samostatnou metabolickou jednotku chrupavky, izolovanou od sousedních buněk, ale zodpovědnou za produkci prvků ECM v bezprostřední blízkosti darované buňky a udržování jejího složení.

ECM je rozdělen do tří částí, z nichž každá má jedinečnou morfologickou strukturu a specifické biochemické složení. ECM bezprostředně sousedící s bazální membránou chondrocytů se nazývá pericelulární neboli lakunární matrix. Je charakterizována vysokým obsahem proteoglykanových agregátů asociovaných s buňkou interakcí kyseliny hyaluronové s receptory podobnými CD44 a relativní absencí organizovaných kolagenních fibril. Přímo s pericelulární matrix sousedí teritoriální neboli kapsulární matrix, která se skládá ze sítě protínajících se fibrilárních kolagenů, které zapouzdřují jednotlivé buňky nebo (někdy) skupiny buněk a tvoří chondrón, a pravděpodobně poskytují buňkám specializovanou mechanickou oporu. Kontaktu chondrocytů s kapsulární matrix je dosaženo prostřednictvím četných cytoplazmatických výběžků bohatých na mikrofilamenta, stejně jako prostřednictvím specifických molekul matrixu, jako jsou ancorin a receptory podobné CD44. Největší a nejvzdálenější částí ECM od bazální membrány chondrocytů je interteritoriální matrix, která obsahuje největší počet kolagenních fibril a proteoglykanů.

Rozdělení extracelulární chrupavčité hmoty (ECM) na kompartmenty je u dospělé kloubní chrupavky jasněji definované než u nezralé kloubní chrupavky. Relativní velikost každého kompartmentu se liší nejen mezi klouby, ale i v rámci téže chrupavky. Každý chondrocyt produkuje matrici, která ho obklopuje. Podle výzkumu chondrocyty zralé chrupavčité tkáně vykonávají aktivní metabolickou kontrolu nad svými pericelulárními a teritoriálními matricemi a méně aktivní kontrolu nad interteritoriální matricí, která může být metabolicky „inertní“.

Jak již bylo zmíněno, kloubní chrupavka se skládá převážně z rozsáhlé extracelulární hmoty (ECM) syntetizované a regulované chondrocyty. Tkáňové makromolekuly a jejich koncentrace se v průběhu života mění v souladu s měnícími se funkčními potřebami. Zůstává však nejasné, zda buňky syntetizují celou matrici současně, nebo v určitých fázích v souladu s fyziologickými potřebami. Koncentrace makromolekul, metabolická rovnováha mezi nimi, jejich vztahy a interakce určují biochemické vlastnosti a tím i funkci kloubní chrupavky v rámci jednoho kloubu. Hlavní složkou ECM dospělé kloubní chrupavky je voda (65–70 % celkové hmotnosti), která je v ní pevně vázána díky zvláštním fyzikálním vlastnostem makromolekul chrupavčité tkáně, které jsou součástí kolagenů, proteoglykanů a nekolagenních glykoproteinů.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Biochemické složení chrupavky

Kolagenová vlákna se skládají z molekul fibrilárního proteinu kolagenu. U savců tvoří kolagen čtvrtinu všech proteinů v těle. Kolagen tvoří fibrilární elementy (kolagenové fibrily) sestávající ze strukturních podjednotek nazývaných tropokolagen. Molekula tropokolagenu má tři řetězce, které tvoří trojitou šroubovici. Tato struktura molekuly tropokolagenu, stejně jako struktura kolagenního vlákna, kdy jsou tyto molekuly uspořádány rovnoběžně v podélném směru s konstantním posunem asi o 1/4 délky, poskytuje tkáním, ve kterých se nacházejí, vysokou elasticitu a pevnost. V současné době je známo 10 geneticky odlišných typů kolagenu, které se liší chemickou strukturou α-řetězců a/nebo jejich sadou v molekule. Nejlépe prozkoumané jsou první čtyři typy kolagenu, které jsou schopny tvořit až 10 molekulárních izoforem.

Kolagenové fibrily jsou součástí extracelulárního prostoru většiny pojivových tkání, včetně chrupavky. V nerozpustné trojrozměrné síti protínajících se kolagenových fibril jsou zapleteny další, rozpustnější složky, jako jsou proteoglykany, glykoproteiny a tkáňově specifické proteiny; ty jsou někdy kovalentně vázány na kolagenové elementy.

Molekuly kolagenu organizované do fibril tvoří asi 50 % organického suchého zbytku chrupavky (10–20 % nativní chrupavky). Ve zralé chrupavce je asi 90 % kolagenů kolagenů typu II, které se nacházejí pouze v některých tkáních (např. sklivec, embryonální dorzální míchadlo). Kolagen typu II patří do molekul kolagenu třídy I (tvořící fibrily). Kromě něj zralá lidská kloubní chrupavka obsahuje také kolageny typu IX, XI a malé množství typu VI. Relativní množství kolagenových vláken typu IX v kolagenových fibrilách klesá z 15 % ve fetální chrupavce na asi 1 % ve zralé bovinní chrupavce.

Molekuly kolagenu typu I se skládají ze tří identických polypeptidových řetězců a,(II) syntetizovaných a sekretovaných jako prekurzorový prokolagen. Jakmile jsou hotové molekuly kolagenu uvolněny do extracelulárního prostoru, tvoří fibrily. Ve zralé kloubní chrupavce tvoří kolagen typu II fibrilární arkády, ve kterých se „silnější“ molekuly nacházejí v hlubokých vrstvách tkáně a „tenčí“ molekuly jsou horizontálně umístěny v povrchových vrstvách.

V genu prokolagenu typu II byl nalezen exon kódující N-terminální propeptid bohatý na cystein. Tento exon není exprimován ve zralé chrupavce, ale v raných stádiích vývoje (prechondrogeneze). Vzhledem k přítomnosti tohoto exonu je molekula prokolagenu typu II (typ II A) delší než kolagen typu II. Exprese tohoto typu prokolagenu pravděpodobně inhibuje akumulaci prvků v extracelulární hmotě kloubní chrupavky. Může hrát určitou roli ve vývoji patologie chrupavky (např. nedostatečná reparativní reakce, tvorba osteofytů atd.).

Síť kolagenních fibril typu II zajišťuje funkci odporu vůči natahování a je nezbytná pro udržení objemu a tvaru tkáně. Tato funkce je zesílena kovalentními a zesíťovacími vazbami mezi molekulami kolagenu. V extracelulární chrupavce (ECM) enzym lysyloxidáza tvoří aldehyd z hydroxylysinu, který se následně přeměňuje na multivalentní aminokyselinu hydroxylysyl-pyridinolin, která vytváří zesíťovací vazby mezi řetězci. Jednak se koncentrace této aminokyseliny s věkem zvyšuje, ale ve zralé chrupavce zůstává prakticky nezměněna. Na druhou stranu se v kloubní chrupavce s věkem zjišťuje nárůst koncentrace zesíťovacích vazeb různých typů, které vznikají bez účasti enzymů.

Asi 10 % celkového množství kolagenů v chrupavčité tkáni tvoří tzv. minoritní kolageny, které do značné míry určují jedinečnou funkci této tkáně. Kolagen typu IX patří do molekul s krátkou šroubovicí třídy III a do unikátní skupiny kolagenů FACIT (Fibril-Associated Collagen with Interrupted Triple-Helices). Skládá se ze tří geneticky odlišných řetězců. Jeden z nich, řetězec _a2, je glykosylován současně s chondroitin sulfátem, což z této molekuly činí proteoglykan. Mezi šroubovicovými segmenty kolagenu typu IX a kolagenu typu II se nacházejí jak zralé, tak nezralé hydroxypyridinové příčné vazby. Kolagen IX může také fungovat jako intermolekulárně-interfibrilární „konektor“ (nebo můstek) mezi sousedními kolagenními fibrilami. Molekuly kolagenu IX mezi sebou tvoří příčné vazby, což zvyšuje mechanickou stabilitu fibrilární trojrozměrné sítě a chrání ji před účinky enzymů. Poskytují také odolnost proti deformaci a omezují bobtnání proteoglykanů umístěných uvnitř sítě. Kromě aniontového CS řetězce obsahuje molekula kolagenu IX kationtovou doménu, která fibrile propůjčuje velký náboj a tendenci interagovat s dalšími makromolekulami matrice.

Kolagen typu XI tvoří pouze 2–3 % celkové hmotnosti kolagenu. Patří do kolagenů třídy I (tvořících fibrily) a skládá se ze tří různých α-řetězců. Spolu s kolageny typu II a IX tvoří kolagen typu XI heterotypické fibrily kloubní chrupavky. Molekuly kolagenu typu XI byly detekovány v kolagenních fibrilách typu II pomocí imunoelektromikroskopie. Pravděpodobně organizují molekuly kolagenu typu II, řídí laterální růst fibril a určují průměr heterotypických kolagenních fibril. Kromě toho se kolagen XI podílí na tvorbě příčných vazeb, ale i ve zralé chrupavce zůstávají příčné vazby ve formě nezralých dvojmocných ketoaminů.

Malé množství kolagenu typu VI, dalšího člena molekul s krátkou šroubovicí třídy III, se nachází v kloubní chrupavce. Kolagen typu VI tvoří různé mikrofibrily a je pravděpodobně koncentrován v kapsulární matrici chondronu.

Proteoglykany jsou proteiny, ke kterým je kovalentně vázán alespoň jeden glykosaminoglykanový řetězec. Proteoglykany patří mezi nejsložitější biologické makromolekuly. Proteoglykany jsou nejhojnější v extracelulární hmotě chrupavky. Hydrofilní proteoglykany, „zapletené“ do sítě kolagenních fibril, plní svou hlavní funkci – propůjčují chrupavce schopnost reverzibilní deformace. Předpokládá se, že proteoglykany plní i řadu dalších funkcí, jejichž podstata není zcela jasná.

Agrekan je hlavní proteoglykan kloubní chrupavky a tvoří přibližně 90 % celkové hmotnosti proteoglykanů v tkáni. Jeho 230 kD základní protein je glykosylován několika kovalentně vázanými glykosaminoglykanovými řetězci a N-terminálními a C-terminálními oligosacharidy.

Glykosaminoglykanové řetězce kloubní chrupavky, které tvoří asi 90 % celkové hmotnosti makromolekul, jsou keratansulfát (sekvence sulfátovaného disacharidu N-acetylglukosaminolaktózy s více sulfátovanými místy a dalšími monosacharidovými zbytky, jako je kyselina sialová) a chondroitinsulfát (sekvence disacharidu N-acetylgalaktosaminu glukuronové kyseliny se sulfátovým esterem připojeným ke každému čtvrtému nebo šestému atomu uhlíku N-acetylgalaktosaminu).

Jádrový protein agrekanu obsahuje tři globulární (G1, G2, G3) a dvě interglobulární (E1 a E2) domény. N-terminální oblast obsahuje domény G1 a G2 oddělené segmentem E1, který je dlouhý 21 nm. Doména C3, umístěná v C-terminální oblasti, je od G2 oddělena _delším (asi 260 nm) segmentem E2, který nese více než 100 řetězců chondroitin sulfátů, asi 15–25 řetězců keratin sulfátů a O-vázané oligosacharidy. N-vázané oligosacharidy se nacházejí hlavně v doménách G1 a C2 a segmentu E1, stejně jako v blízkosti _oblasti G3. Glykosaminoglykany jsou seskupeny do dvou oblastí: ta nejdelší (tzv. oblast bohatá na chondroitin sulfát) obsahuje řetězce chondroitin sulfátu a asi 50 % řetězců keratan sulfátu. Oblast bohatá na keratan sulfát se nachází v _segmentu E2 poblíž domény G1 a předchází oblasti bohaté na chondroitin sulfát. Molekuly agrekanů také obsahují fosfátové estery, které se nacházejí primárně na xylózových zbytcích, které připojují řetězce chondroitin sulfátu k jádrovému proteinu; nacházejí se také na serinových zbytcích jádrového proteinu.

C-terminální segment C3 _domény je vysoce homologní s lektinem, což umožňuje fixaci molekul proteoglykanů v ECM vazbou na určité sacharidové struktury.

Nedávné studie identifikovaly exon kódující subdoménu podobnou EGF v G3 _. Pomocí polyklonálních protilátek proti EGF byl epitop podobný EGF lokalizován v peptidu o velikosti 68 kD v lidském agrekanu kloubní chrupavky. Jeho funkce však stále není objasněna. Tato subdoména se nachází také v adhezních molekulách, které řídí migraci lymfocytů. Pouze asi třetina molekul agrekanu izolovaných ze zralé lidské kloubní chrupavky obsahuje intaktní doménu C3 _; je to pravděpodobně proto, že molekuly agrekanu mohou být enzymaticky zmenšeny v ECM. Osud a funkce štěpených fragmentů nejsou známy.

_{Hlavním funkčním segmentem molekuly agrekanu je segment} E2 nesoucí glykosaminoglykan. Tato oblast, bohatá na keratansulfáty, obsahuje aminokyseliny prolin, serin a threonin. Většina serinových a threoninových zbytků je O-glykosylována zbytky N-acetylgalaktosaminu; ty iniciují syntézu určitých oligosacharidů, které jsou začleněny do řetězců keratansulfátu, čímž je prodlužují. Zbytek segmentu E2 _obsahuje více než 100 serin-glycinových sekvencí, ve kterých serin zajišťuje připojení k xylosylovým zbytkům na začátku řetězců chondroitinsulfátu. Typicky chondroitin-6-sulfát i chondroitin-4-sulfát existují současně v rámci stejné molekuly proteoglykanu, jejich poměr se mění v závislosti na lokalizaci chrupavčité tkáně a věku osoby.

Struktura molekul agrekanu v matrici lidské kloubní chrupavky prochází během zrání a stárnutí řadou změn. Mezi změny související se stárnutím patří snížení hydrodynamické velikosti v důsledku změny průměrné délky řetězců chondroitin sulfátu a zvýšení počtu a délky řetězců keratan sulfátu. Řada změn v molekule agrekanu je také způsobena působením proteolytických enzymů (např. agrekanázy a stromelesinu) na jádrový protein. To má za následek postupné snižování průměrné délky jádrového proteinu molekuly agrekanu.

Molekuly agrekanu jsou syntetizovány chondrocyty a vylučovány do extracelulární membrány (ECM), kde tvoří agregáty stabilizované molekulami linkerového proteinu. Tato agregace zahrnuje vysoce specifické nekovalentní a kooperativní interakce mezi řetězcem kyseliny glukuronové a téměř 200 molekulami agrekanu a linkerového proteinu. Kyselina glukuronová je extracelulární, nesulfátovaný, lineární glykosaminoglykan s vysokou molekulovou hmotností složený z více sekvenčně vázaných molekul N-acetylglukosaminu a kyseliny glukuronové. Párové smyčky domény G1 agrekanu reverzibilně interagují s pěti sekvenčně umístěnými disacharidy kyseliny hyaluronové. Linkerový protein, který obsahuje podobné (vysoce homologní) párové smyčky, interaguje s doménou C1 a molekulou kyseliny hyaluronové a stabilizuje strukturu agregátu. Komplex doména C1 - kyselina hyaluronová - vazebný protein tvoří vysoce stabilní interakci, která chrání doménu G1 a vazebný protein před působením proteolytických enzymů. Byly identifikovány dvě molekuly vazebného proteinu s molekulovou hmotností 40-50 kDa; liší se od sebe stupněm glykosylace. V místě vazby mezi kyselinou hyaluronovou a agrekanem je přítomna pouze jedna molekula vazebného proteinu. Třetí, menší, molekula vazebného proteinu vzniká z větších molekul proteolytickým štěpením.

Na jednu molekulu kyseliny hyaluronové se může vázat přibližně 200 molekul agrekanů za vzniku agregátu o délce 8 μm. V buněčné matrici, která se skládá z pericelulárních a teritoriálních kompartmentů, si agregáty udržují spojení s buňkami vazbou (prostřednictvím vlákna kyseliny hyaluronové) na receptory podobné CD44 na buněčné membráně.

Tvorba agregátů v extracelulární chrupavčité tkáni (ECM) je složitý proces. Nově syntetizované molekuly agrekanů neprojevují okamžitě schopnost vázat se na kyselinu hyaluronovou. To může sloužit jako regulační mechanismus, který umožňuje nově syntetizovaným molekulám dosáhnout interteritoriální zóny matrice před imobilizací do velkých agregátů. Počet nově syntetizovaných molekul agrekanů a vazebných proteinů schopných tvořit agregáty interakcí s kyselinou hyaluronovou s věkem významně klesá. Kromě toho se s věkem významně snižuje velikost agregátů izolovaných z lidské kloubní chrupavky. To je částečně způsobeno snížením průměrné délky molekul kyseliny hyaluronové a molekul agrekanů.

V kloubní chrupavce byly zjištěny dva typy agregátů. Průměrná velikost prvního typu agregátů je 60 S, zatímco druhého typu (rychle se vysrážející „superagregáty“) je 120 S. Ten se vyznačuje velkým množstvím molekul vazebného proteinu. Přítomnost těchto superagregátů může hrát hlavní roli ve fungování tkáně; během obnovy tkáně po imobilizaci končetiny se jejich vyšší koncentrace nacházejí ve středních vrstvách kloubní chrupavky, zatímco v kloubu postiženém osteoartrózou je jejich velikost v raných stádiích onemocnění významně zmenšena.

Kromě agrekanu obsahuje kloubní chrupavka řadu menších proteoglykanů. Biglykan a dekorin, molekuly nesoucí dermatansulfáty, mají molekulové hmotnosti přibližně 100 a 70 kDa; hmotnost jejich jádrového proteinu je přibližně 30 kDa.

V lidské kloubní chrupavce obsahuje molekula biglykanu dva řetězce dermatansulfátu, zatímco běžnější dekorin obsahuje pouze jeden. Tyto molekuly tvoří pouze malou část proteoglykanů v kloubní chrupavce, i když jich může být stejně mnoho jako velkých agregovaných proteoglykanů. Malé proteoglykany interagují s dalšími makromolekulami v extracelulární chrupavce (ECM), včetně kolagenních fibril, fibronektinu, růstových faktorů atd. Dekorin je primárně lokalizován na povrchu kolagenních fibril a inhibuje fibrillogenezi kolagenu. Jádrový protein je pevně vázán na buněčnou doménu fibronektinu, čímž pravděpodobně brání jeho vazbě na receptory na buněčném povrchu (integriny). Protože se dekorin i biglykan vážou na fibronektin a inhibují buněčnou adhezi a migraci, stejně jako tvorbu trombů, jsou schopny inhibovat procesy opravy tkání.

Fibromodulin kloubní chrupavky je proteoglykan s molekulovou hmotností 50-65 kD asociovaný s kolagenními fibrilami. Jeho jádrový protein, homologní s jádrovými proteiny dekorinu a biglykanu, obsahuje velké množství zbytků tyrosinsulfátu. Tato glykosylovaná forma fibromodulinu (dříve nazývaná 59 kD matrixový protein) se může podílet na regulaci tvorby a udržování struktury kolagenních fibril. Fibromodulin a dekorin se nacházejí na povrchu kolagenních fibril. Jak již bylo uvedeno, zvětšení průměru fibril by mělo předcházet selektivní odstranění těchto proteoglykanů (stejně jako molekul kolagenu typu IX).

Kloubní chrupavka obsahuje v extracelulární hmotě (ECM) řadu proteinů, které nejsou ani proteoglykany, ani kolageny. Interagují s jinými makromolekulami a vytvářejí síť, která zahrnuje většinu molekul ECM.

Ancorin, protein o molekulové hmotnosti 34 kD, je lokalizován na povrchu chondrocytů a v buněčné membráně, kde zprostředkovává interakce mezi buňkou a matricí. Díky své vysoké afinitě ke kolagenu typu II může působit jako mechanoreceptor a přenášet signál o změněném tlaku na fibrilu do chondrocytu.

Fibronektin je součástí většiny chrupavčitých tkání a mírně se liší od plazmatického fibronektinu. Předpokládá se, že fibronektin podporuje integraci do matrixu interakcí s buněčnými membránami a dalšími složkami matrixu, jako je kolagen typu II a trombospondin. Fragmenty fibronektinu mají negativní vliv na metabolismus chondrocytů: inhibují syntézu agrekanů a stimulují katabolické procesy. Vysoké koncentrace fragmentů fibronektinu byly nalezeny v kloubní tekutině pacientů s osteoartrózou, takže se mohou v pozdních stádiích podílet na patogenezi onemocnění. Fragmenty jiných molekul matrixu, které se vážou na receptory chondrocytů, mají pravděpodobně podobné účinky.

Oligomerní matrixový protein chrupavky (OMPC), člen nadrodiny trombospondinů, je pentamer s pěti identickými podjednotkami o molekulové hmotnosti přibližně 83 kDa. Nachází se ve velkém množství v kloubní chrupavce, zejména ve vrstvě proliferujících buněk v rostoucí tkáni. Je proto možné, že se OMPC podílí na regulaci buněčného růstu. V extracelulární hmotě (ECM) zralé kloubní chrupavky se nacházejí v mnohem nižších koncentracích. Mezi matrixové proteiny patří také:

• bazický matrixový protein (36 kDa), který má vysokou afinitu k chondrocytům, může zprostředkovávat buněčné interakce v ECM, například během remodelace tkáně;
• GP-39 (39 kDa) je exprimován v povrchové vrstvě kloubní chrupavky a v synoviální membráně (jeho funkce nejsou známy);
• Protein o molekulové hmotnosti 21 kD je syntetizován hypertrofovanými chondrocyty, interaguje s kolagenem typu X a může fungovat v zóně „vlnovky“.

Kromě toho je zřejmé, že chondrocyty v určitých fázích vývoje chrupavky a za patologických podmínek exprimují neglykosylované formy malých neagregovaných proteoglykanů, ale jejich specifická funkce je v současné době předmětem studia.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Funkční vlastnosti kloubní chrupavky

Molekuly agrekanů poskytují kloubní chrupavce schopnost reverzibilní deformace. Vykazují specifické interakce v extracelulárním prostoru a nepochybně hrají důležitou roli v organizaci, struktuře a funkci extracelulárního matrixu (ECM). V chrupavčité tkáni dosahují molekuly agrekanů koncentrace 100 mg/ml. V chrupavčité tkáni jsou molekuly agrekanů stlačeny na 20 % objemu, který zaujímají v roztoku. Trojrozměrná síť tvořená kolagenními fibrilami dává tkáni charakteristický tvar a zabraňuje zvětšení objemu proteoglykanů. V kolagenové síti nesou imobilní proteoglykany velký negativní elektrický náboj (obsahují velké množství aniontových skupin), což jim umožňuje interagovat s mobilními kationtovými skupinami intersticiální tekutiny. Proteoglykany interagují s vodou a vytvářejí tzv. bobtnavý tlak, proti kterému kolagenová síť působí.

Přítomnost vody v extracelulární matrici (ECM) je velmi důležitá. Voda určuje objem tkáně; vázána na proteoglykany poskytuje odolnost vůči kompresi. Voda navíc zajišťuje transport molekul a difuzi v ECM. Vysoká hustota negativního náboje na velkých proteoglykanech fixovaných v tkáni vytváří „efekt vyloučeného objemu“. Velikost pórů intrakoncentrovaného roztoku proteoglykanů je tak malá, že difuze velkých globulárních proteinů do tkáně je ostře omezena. ECM odpuzuje malé negativně nabité proteiny (např. chloridové ionty) a velké proteiny (jako je albumin a imunoglobuliny). Velikost buněk v husté síti kolagenních fibril a proteoglykanů je srovnatelná pouze s velikostí některých anorganických molekul (např. sodíku a draslíku, ale nikoli vápníku).

V extracelulárním můstku (ECM) je určité množství vody přítomno v kolagenních fibrilách. Extrafibrilární prostor určuje fyzikálně-chemické a biomechanické vlastnosti chrupavky. Obsah vody v intrafibrilárním prostoru závisí na koncentraci proteoglykanů v extrafibrilárním prostoru a zvyšuje se s poklesem jejich koncentrace.

Fixní negativní náboj na proteoglykanech určuje iontové složení extracelulárního média, které obsahuje volné kationty ve vysoké koncentraci a volné anionty v nízké koncentraci. S rostoucí koncentrací molekul agrekanů od povrchové do hluboké zóny chrupavky se mění iontové prostředí tkáně. Koncentrace anorganických iontů v extracelulárním matrixu (ECM) vytváří vysoký osmotický tlak.

Materiální vlastnosti chrupavky závisí na interakci kolagenních fibril, proteoglykanů a tekuté fáze tkáně. Strukturní a kompoziční změny spojené s rozdílem mezi procesy syntézy a katabolismu, degradací makromolekul a fyzickým traumatem významně ovlivňují materiální vlastnosti chrupavky a mění její funkci. Vzhledem k tomu, že koncentrace, distribuce a makromolekulární organizace kolagenů a proteoglykanů se mění v závislosti na hloubce chrupavčité zóny, liší se i biomechanické vlastnosti každé zóny. Například povrchová zóna s vysokou koncentrací kolagenu, tangenciálně umístěnými fibrilami a relativně nízkou koncentrací proteoglykanů má nejvýraznější vlastnosti odolávat roztahování a rovnoměrně rozkládat zatížení po celém povrchu tkáně. V přechodových a hlubokých zónách vysoká koncentrace proteoglykanů propůjčuje tkáni vlastnost odolávat tlakovému zatížení. Na úrovni „vlnné linie“ se materiální vlastnosti chrupavky prudce mění od poddajné nekalcifikované zóny k tužší mineralizované chrupavce. V oblasti „vlnné linie“ je pevnost tkáně zajištěna kolagenovou sítí. Podkladové úseky chrupavky nejsou kříženy kolagenními fibrilami; v oblasti osteochondrálního spojení je pevnost tkáně zajištěna zvláštními konturami hranice mezi nekalcifikovanou a kalcifikovanou chrupavčitou zónou ve formě nepravidelných prstovitých výrůstků, které obě vrstvy „uzavírají“ a zabraňují jejich oddělení. Kalcifikovaná chrupavka má menší hustotu než subchondrální kost, a proto funguje jako mezivrstva, která změkčuje tlakové zatížení chrupavky a přenáší ho na subchondrální kost.

Během zatížení dochází ke komplexnímu rozložení tří sil - extenční, střižné a kompresní. Kloubní matrice se deformuje v důsledku vypuzování vody (stejně jako produktů buněčného metabolismu) ze zatěžovací zóny, koncentrace iontů v intersticiální tekutině se zvyšuje. Pohyb vody přímo závisí na délce a síle aplikovaného zatížení a je zpožděn negativním nábojem proteoglykanů. Během deformace tkáně jsou proteoglykany k sobě pevněji přitlačovány, čímž se účinně zvyšuje hustota negativního náboje, a mezimolekulární síly, které negativní náboj odpuzují, zase zvyšují odolnost tkáně vůči další deformaci. Deformace nakonec dosáhne rovnováhy, ve které jsou vnější zatěžovací síly vyváženy vnitřními odporovými silami - bobtnacím tlakem (interakce proteoglykanů s ionty) a mechanickým namáháním (interakce proteoglykanů a kolagenů). Po odstranění zatížení získá chrupavčitá tkáň svůj původní tvar absorpcí vody spolu s živinami. Počátečního (předzátěžového) tvaru tkáně je dosaženo, když je bobtnací tlak proteoglykanů vyvážen odporem kolagenové sítě vůči jejich šíření.

Biomechanické vlastnosti kloubní chrupavky jsou založeny na strukturální integritě tkáně - kolagen-proteoglykanové kompozici jako pevnou fázi a vodu a rozpuštěné ionty jako kapalnou fázi. V nezatíženém stavu je hydrostatický tlak v kloubní chrupavce přibližně 1-2 atm. Tento hydrostatický tlak se může in vivo zvýšit na 100-200 atm za milisekundu během stání a na 40-50 atm během chůze. Studie in vitro ukázaly, že hydrostatický tlak 50-150 atm (fyziologický) vede k mírnému zvýšení anabolismu chrupavky v krátkém časovém úseku a v průběhu 2 hodin vede ke ztrátě chrupavčité tekutiny, ale nezpůsobuje žádné další změny. Otázka, jak rychle chondrocyty reagují in vivo na tento typ zátěže, zůstává nevyřešena.

Indukovaný pokles hydratace s následným zvýšením koncentrace proteoglykanů vede k přitahování kladně nabitých iontů, jako jsou H ⁺ a Na ⁺. To vede ke změně celkového iontového složení a pH extracelulárního matrixu (ECM) a chondrocytů. Dlouhodobá fyzická zátěž vyvolává pokles pH a zároveň pokles syntézy proteoglykanů chondrocyty. Je možné, že vliv extracelulárního iontového prostředí na syntetické procesy částečně souvisí i s jeho vlivem na složení ECM. Nově syntetizované molekuly agrekanů dozrávají do agregovaných forem později ve slabě kyselém prostředí než za normálních podmínek. Je pravděpodobné, že pokles pH v okolí chondrocytů (např. během fyzické zátěže) umožňuje většímu počtu nově syntetizovaných molekul agrekanů dosáhnout interteritoriální matrice.

Po odstranění zátěže se voda vrací ze synoviální dutiny a nese živiny pro buňky. V chrupavce postižené osteoartrózou je koncentrace proteoglykanů snížena, proto se během zátěže voda pohybuje nejen vertikálně do synoviální dutiny, ale i v jiných směrech, čímž se snižuje výživa chondrocytů.

Imobilizace nebo mírné zatížení vede k výraznému snížení syntézy chrupavky a obsahu proteoglykanů, zatímco zvýšené dynamické zatížení vede k mírnému zvýšení syntézy a obsahu proteoglykanů. Namáhavé cvičení (20 km/den po dobu 15 týdnů) u psů vyvolalo změny v obsahu proteoglykanů, zejména prudký pokles jejich koncentrace v povrchové zóně. Došlo k určitému reverzibilnímu změknutí chrupavky a subchondrální remodelaci kosti. Silné statické zatížení však způsobilo poškození chrupavky a následnou degeneraci. Kromě toho ztráta agrekanu z extracelulární matrix (ECM) iniciuje abnormální změny charakteristické pro osteoartrózu. Ztráta agrekanu vede k přitahování vody a otoku malého množství zbývajícího proteoglykanu. Toto rozpouštění agrekanu přispívá ke snížení lokální hustoty fixního náboje a nakonec vede ke změně osmolarity.