Laboratorní diagnostika tuberkulózy

Tuberkulóza je onemocnění, které je v moderních podmínkách a díky vědeckým úspěchům snadno diagnostikovatelné. Laboratorní diagnostika tuberkulózy zaujímá mezi ostatními diagnostickými metodami ústřední místo, hned po rentgenových vyšetřovacích metodách.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinický krevní test

U pacientů s tuberkulózou nejsou změny v celkovém krevním testu patognomonické. U omezených a nízkoaktivních forem tuberkulózy je charakteristická hypochromie erytrocytů s normálním počtem. U masivních infiltrátů nebo kaseózní pneumonie, s rozsáhlou kaseózní lymfadenitidou, specifickým střevním poškozením, stejně jako s velkým plicním nebo pooperačním krvácením, erytropenie a mikrocytóza, se pozoruje oligochromazie, polychromazie. Makrocytóza, a zejména poikilocytóza, se vyskytuje mnohem méně často, obvykle při těžké anémii. Počet retikulocytů v kompenzovaném stádiu tuberkulózy se pohybuje od 0,1 do 0,6 %, v subkompenzovaném stádiu od 0,6 do 1,0 % a pro dekompenzované stádium je charakteristické 1 % retikulocytů.

V některých případech tuberkulózy lze pozorovat mírnou leukocytózu (až 15 tisíc leukocytů), méně často leukopenii, která se vyskytuje ve 2–7 % případů u pacientů s omezenými a mírnými formami procesu a ve 12,5 % u destruktivní a progresivní plicní tuberkulózy.

Nejčastěji dochází k posunům v leukocytárním vzorci. Zaznamenává se relativní i absolutní neutrofilie, mírný posun leukocytárního vzorce doleva k promyelocytům. Myelocyty se vyskytují velmi vzácně u nekomplikované tuberkulózy. Zvýšení počtu neutrofilů s patologickou granularitou v hemogramu pacienta s tuberkulózou vždy naznačuje trvání procesu: u pacientů s těžkou tuberkulózou téměř všechny neutrofily obsahují patologickou granularitu. Po odeznění tuberkulózního ohniska se jaderný posun relativně rychle vrátí k normálu. Patologická granularita neutrofilů obvykle přetrvává déle než jiné změny v hemogramu.

Obsah eosinofilů v periferní krvi také kolísá v závislosti na fázi procesu a alergickém stavu organismu. Jejich počet klesá až k aneozinofilii při těžkých a vleklých propuknutích onemocnění a naopak se zvyšuje během resorpce infiltrátů a pleurálního výpotku, stejně jako u časných forem primární tuberkulózy.

Většina forem primární tuberkulózy je doprovázena lymfopenií, která je někdy pozorována i několik let i po zjizvení specifických změn. Sekundární tuberkulóza v akutní fázi může být v závislosti na závažnosti procesu doprovázena buď normálním počtem lymfocytů, nebo lymfopenií.

Mezi testy pro posouzení tuberkulózního procesu zaujímá zvláštní místo stanovení rychlosti sedimentace erytrocytů (ESR), která je důležitá pro posouzení průběhu tuberkulózního procesu a identifikaci jeho aktivních forem. Zvýšení ESR indikuje přítomnost patologického procesu (infekčně-zánětlivého, hnisavého, septického, hemoblastózy, lymfogranulomatózy atd.) a slouží jako ukazatel jeho závažnosti, ale normální hodnoty ESR ne vždy naznačují absenci patologie. Zrychlení sedimentace erytrocytů je usnadněno zvýšením obsahu globulinů, fibrinogenu, cholesterolu v krvi a snížením viskozity krve. Zpomalení sedimentace erytrocytů je charakteristické pro stavy doprovázené hemokoncentrací, zvýšením obsahu albuminů a žlučových kyselin.

Hemogram pacientů s tuberkulózou se během léčby mění. Čím úspěšnější je terapeutický zásah, tím rychleji hematologické změny mizí. Zároveň je třeba mít na paměti vliv různých antibakteriálních léků na hematopoézu. Často způsobují eosinofilii, v některých případech leukocytózu a častěji leukopenii až po agranulocytózu a lymfoidně-retikulární reakci. Systematické hematologické sledování a správná analýza získaných dat jsou nezbytné pro posouzení klinického stavu pacienta, dynamiky procesu a účinnosti léčby.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinická analýza moči

V případě tuberkulózy močových cest je hlavní laboratorní diagnostickou metodou analýza moči. Může být pozorována leukocyturie, erytrocyturie, proteinurie, hypoisosthenurie, tuberkulózní mykobakteriurie a nespecifická bakteriurie.

Leukocyturie je nejčastějším příznakem tuberkulózy močových cest před specifickou chemoterapií a chybí pouze ve výjimečných případech, například při úplné obliteraci lumen močovodu. Nechiporenkův test (stanovení počtu leukocytů v 1 ml moči) pomáhá objektivněji posoudit stupeň leukocyturie u nefrotuberkulózy a v některých případech ji detekovat i při normálním celkovém rozboru moči. Je však třeba vzít v úvahu, že leukocyturie se může vyskytnout u akutní i chronické pyelonefritidy, cystitidy, uretritidy, ledvinových kamenů a močovodů.

Erytrocyturie, stejně jako leukocyturie, je považována za jeden z nejčastějších laboratorních příznaků urogenitální tuberkulózy. Frekvence hematurie závisí na prevalenci procesu; zvyšuje se s rozvojem destruktivního tuberkulózního procesu v ledvině. Erytrocyturie bez leukocyturie je typičtější pro časná stadia renální tuberkulózy. Hematurie, převažující nad leukocyturií, je důležitým argumentem ve prospěch renální tuberkulózy při jejím odlišení od nespecifické pyelonefritidy.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biochemický krevní test

U tuberkulózy závisí změny některých biochemických ukazatelů především na fázi procesu, komplikacích a různých doprovodných onemocněních. U pacientů s inaktivní tuberkulózou plic a dalších orgánů se celkový protein a proteinové frakce krevního séra nemění a určují jejich normální obsah.

U akutních forem onemocnění, stejně jako při exacerbaci a progresi chronických forem tuberkulózy, se koeficient albumin-globulin snižuje.

Významný význam pro posouzení funkčního stavu a organického poškození jater u tuberkulózy a jejích komplikací má stanovení přímého a celkového bilirubinu, aspartátaminotransferázy (AST) a alaninaminotransferázy (ALT) v krevním séru. Dynamické stanovení hladiny aminotransferáz. Bilirubin při léčbě pacientů s tuberkulózou, zejména v jejích těžkých formách, je povinnou součástí biochemického vyšetření pacientů s tuberkulózou a provádí se měsíčně.

Hodnocení funkčního stavu ledvin zahrnuje stanovení sérového kreatininu a výpočet rychlosti glomerulární filtrace pomocí Cockcroftova-Gaultova vzorce. Výpočet rychlosti glomerulární filtrace pomocí Rebergova testu dává méně přesné výsledky.

Hlavním cílem dynamických biochemických studií pacientů s tuberkulózou je sledování průběhu procesu, včasné odhalení vedlejších účinků léků a adekvátní korekce vznikajících poruch homeostázy.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Aplikace biochemických výzkumných metod u extrapulmonální tuberkulózy

Za nejinformativnější ukazatel je považován obsah kyseliny tuberkulostearové v biologických tekutinách, jeho stanovení je však spojeno s technickými obtížemi (nutnost použití plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie).

Slibné je měření aktivity adenosindeaminázy - enzymu stanovovaného v tekutinách: synoviální, perikardiální, ascitické nebo mozkomíšním. Hlavními producenty adenosindeaminázy jsou lymfocyty a monocyty. Stanovení aktivity adenosindeaminázy v biologických tekutinách usnadňuje diagnostiku tuberkulózní synovitidy, tuberkulózy lymfatických uzlin, tuberkulózní meningitidy, tuberkulózní serozitidy.

Některé biochemické ukazatele se vzhledem ke své nespecificitě stanovují pouze v biologických tekutinách v blízkosti léze. Hladina ukazatelů se měří v reakci na subkutánní nebo intradermální podání tuberkulinu (obvykle před podáním a 48 a 72 hodin po něm). Poté se vypočítá stupeň zvýšení hladiny markeru (v %) ve vztahu k počáteční hladině.

Optimálně se aktivita orgánově specifického enzymu transamidinázy stanovuje v moči; její výskyt je zaznamenán u poškození ledvin různého původu. Studium transamidinázy je opodstatněné pouze za podmínek subkutánního podání tuberkulinu za účelem zhoršení lokálního zánětlivého procesu. Aktivita transamidinázy se stanovuje v moči zpočátku a 24–72 hodin po podání 50 TE tuberkulinu. Zvýšení fermenturie 2krát nebo vícekrát umožňuje v 82 % případů odlišit aktivní tuberkulózu ledvin od exacerbace chronické pyelonefritidy.

V případě tuberkulózy ženských pohlavních orgánů se koncentrace haptoglobinu a malondialdehydu v krvi stanovují za podmínek provokačního tuberkulinového testu. Tuberkulin se podává subkutánně v dávce 50 TE a po 72 hodinách se provádí opakované biochemické vyšetření. V případě tuberkulózní etiologie je stupeň zvýšení hladiny haptoglobinu nejméně 28 % a hladina malondialdehydu 39 % nebo více. Používá se také stanovení aktivity adenosindeaminázy v peritoneální tekutině získané z Douglasova váčku. Punkce se znovu vyšetří 72 hodin po intradermálním podání tuberkulinu v dávkách 0,1 TE a 0,01 TE v oblasti projekce vnitřních pohlavních orgánů na přední břišní stěnu. Zvýšení aktivity adenosindeaminázy o 10 % nebo více ve srovnání s počáteční hodnotou naznačuje tuberkulózní proces.

V případě poškození oka se zkoumá fokální reakce, která se v oku vyskytuje v reakci na stimulaci antigenem. V tomto případě je nežádoucí rozvoj ostře vyjádřené reakce doprovázené snížením zrakových funkcí. Vzhledem k tomu, že hodnocení minimálních fokálních reakcí je často obtížné, doporučuje se pro objektivizaci závěru zaměřit paralelně na stupeň zvýšení haptoglobinu nebo adenosindeaminázy v krevním séru.

Všechny biochemické studie by měly být prováděny v kombinaci s dalšími metodami.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studium systému srážení krve

Relevance studia stavu systému srážení krve ve ftizeologii je dána přítomností hemoptýzy nebo plicního krvácení u řady pacientů s tuberkulózou plic, stejně jako hemokoagulačními komplikacemi při chirurgické léčbě tuberkulózy. Kromě toho přirozeně doprovázející latentní intravaskulární hemokoagulace ovlivňuje průběh onemocnění a účinnost chemoterapie.

U pacientů s plicní tuberkulózou s převažující exsudativní složkou zánětu je pozorován pokles antikoagulační aktivity krve. U pacientů s nízkou prevalencí specifického poškození plic s převažující produktivní složkou zánětu je intravaskulární hemokoagulace vyjádřena nevýznamně. U pacientů s plicní tuberkulózou s hemoptýzou a plicním krvácením je stav systému srážení krve odlišný: u pacientů s drobnou ztrátou krve na vrcholu hemoptoey nebo bezprostředně po jejím ukončení je pozorován prudký nárůst koagulační schopnosti krve v důsledku výrazné intenzifikace procesů tvorby trombinu při zachování zvýšené „strukturální“ koagulace. U pacientů s masivní ztrátou krve je pozorován pokles koagulačního potenciálu v důsledku snížení koncentrace fibrinogenu, aktivity faktoru XIII a počtu krevních destiček. Ve fázi chirurgické léčby u pacientů s omezenými formami plicní tuberkulózy nedochází k významným poruchám homeostázového systému. U pacientů s rozšířenými procesy se při provádění pneumonektomie nebo pleuropneumonektomie často rozvíjí DIC syndrom, který může mít podobu „druhého onemocnění“.

Pro sledování stavu systému srážení krve u pacientů s plicní tuberkulózou je nutné stanovit aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT), fibrinogen, trombinový čas, protrombinový index, jakož i dobu krvácení a dobu srážení krve.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonální studie

Moderní experimentální a klinická pozorování naznačují přítomnost změn hormonálního stavu u specifického tuberkulózního zánětu plic. Bylo prokázáno, že korekce dysfunkce hypofyzárně-nadledvinového, hypofyzárně-štítného systému a funkce slinivky břišní v kombinaci s antituberkulózní terapií přispívá k aktivaci fibrogeneze a reparačních procesů v ohnisku specifického zánětu.

Funkční stav systému hypofýza-štítná žláza se posuzuje podle obsahu trijodtyroninu (T3), tyroxinu (T4) a hypofyzárního tyreostimulačního hormonu (TSH) v krevním séru _. Bylo _zjištěno, že subklinická hypotyreóza je zjištěna u 38–45 % pacientů s plicní tuberkulózou a nejčastěji je diagnostikována u diseminované a fibro-kavernózní formy procesu. U těchto forem jsou hladiny T3 i T4 nejvýrazněji sníženy _a dochází k _nerovnováze těchto hormonů ve formě zvýšení _{poměru T4/} T3.

Funkce kůry nadledvin se posuzuje hladinou kortizolu v séru a endokrinní funkce slinivky břišní koncentrací imunoreaktivního inzulínu. V akutní fázi infekčního onemocnění se zvyšuje potřeba endogenního kortizolu a inzulínu. Hyperinzulinémie také indikuje inzulínovou rezistenci tělesných tkání, která je typická pro jakýkoli aktivní zánětlivý proces, zejména specifický. Stanovení glukokortikoidní funkce nadledvin u aktivní plicní tuberkulózy nám umožňuje detekovat přítomnost hyperkorticismu u většiny pacientů. Normální koncentrace kortizolu v krvi u pacienta s infekčním zánětem v akutním období by měly být považovány za relativní nedostatečnost glukokortikoidní funkce kůry nadledvin, což může sloužit jako základ pro substituční terapii adekvátními dávkami glukokortikoidů.

Téměř třetina pacientů s plicní tuberkulózou má nízkou hladinu inzulinémie blížící se dolní hranici normy, zatímco 13–20 % má významný hyperinzulinismus. Relativní hypo- i hyperinzulinismus jsou vysoce rizikovými faktory pro rozvoj poruch metabolismu sacharidů různého stupně závažnosti. Tyto změny funkční aktivity pankreatických B-buněk vyžadují pravidelné sledování glykémie u pacientů s tuberkulózou a včasnou prevenci diabetu mellitus. To navíc slouží jako další zdůvodnění vhodnosti použití fyziologických dávek inzulinu v komplexní terapii tuberkulózy.

Obecně platí, že pokles hladin hormonů štítné žlázy, jejich nerovnováha, hyperkortizolemie a hyperinzulinismus jsou nejvýraznější u pacientů s těžkým průběhem tuberkulózního procesu, s rozsáhlými plicními lézemi a výraznými příznaky tuberkulózní intoxikace.

Mikrobiologická diagnostika tuberkulózy

Mikrobiologické studie jsou nezbytné pro identifikaci pacientů s tuberkulózou, ověření diagnózy, sledování a korekci chemoterapie, posouzení výsledků léčby, jinými slovy od okamžiku, kdy je pacient s tuberkulózou registrován, až do jeho vyřazení z registru.

Všechny epidemiologické programy a projekty jsou založeny na hodnocení počtu vylučovačů bakterií, což je nemožné bez použití laboratorních metod pro detekci mykobakterií tuberkulózy. Při zkoumání atraktivity tzv. neorganizované populace dosahuje procento vylučovačů bakterií 70 a více, což z laboratorních metod činí poměrně účinný prostředek pro identifikaci pacientů s tuberkulózou v této populační skupině.

Tradiční mikrobiologické metody diagnostiky tuberkulózy jsou bakterioskopické a kultivační studie. Moderní metody zahrnují kultivaci mykobakterií tuberkulózy v automatizovaných systémech a PCR. Všechny tyto metody jsou však nutně kombinovány s klasickými bakteriologickými metodami.

Sběr diagnostického materiálu

Účinnost laboratorních testů do značné míry závisí na kvalitě diagnostického materiálu. Dodržování pravidel pro sběr, skladování a přepravu diagnostického materiálu a přesné provedení algoritmu vyšetření pacienta přímo ovlivňuje výsledek a zajišťuje biologickou bezpečnost.

K testování tuberkulózy se používá řada materiálů. Vzhledem k tomu, že plicní tuberkulóza je nejčastější formou tuberkulózní infekce, za hlavní materiál pro testování se považuje sputum a další typy výtoků z tracheobronchiálního stromu: výtok z horních cest dýchacích získaný po inhalaci aerosolu: vody z bronchiální laváže; bronchoalveolární laváže; materiál získaný během bronchoskopie, transtracheální a intrapulmonální biopsie: bronchiální aspirát, stěry z hrtanu, exsudáty, stěry z ran atd.

Účinnost výzkumu se zvyšuje, pokud se provádí kontrolovaný odběr materiálu od pacienta. Pro tento účel se přiděluje speciálně vybavená místnost nebo se zakoupí speciální kabinky. Odběr materiálu je nebezpečný postup, proto musí být materiál pro výzkum odebírán v souladu s pravidly bezpečnosti infekcí.

Materiál pro testování na Mycobacterium tuberculosis se odebírá do sterilních lahviček s pevně zašroubovanými uzávěry, aby se zabránilo kontaminaci prostředí a byl odebraný materiál chráněn před kontaminací.

Lahvičky pro odběr diagnostického materiálu musí splňovat následující požadavky:

• musí být vyroben z nárazuvzdorného materiálu;
• by se měl při autoklávování snadno roztavit;
• mít dostatečný objem (40–50 ml):
• mít široký otvor pro sběr sputa (průměr nejméně 30 mm);
• být snadno manipulovatelný, průhledný nebo průsvitný, aby bylo možné posoudit množství a kvalitu odebraného vzorku bez otevření víka.

Pro dosažení optimálních výsledků výzkumu musí být splněny následující podmínky:

• odběr materiálu by měl být proveden před zahájením chemoterapie;
• materiál pro studii musí být shromážděn před jídlem nebo užíváním léků ráno;
• Pro studii je vhodné odebrat alespoň 3 vzorky ranního sputa. Sputum se odebírá po dobu 3 po sobě jdoucích dnů;
• Odebraný materiál musí být co nejrychleji doručen do laboratoře:
• v případech, kdy není možné materiál doručit do laboratoře ihned, skladuje se v chladničce při teplotě vzduchu 4 °C po dobu nejvýše 48 hodin;
• Při přepravě materiálu je nutné věnovat zvláštní pozornost neporušenosti lahví.

Správně odebrané sputum má hlenovitý nebo hlenohnisavý charakter. Optimální objem vyšetřované porce sputa je 3-5 ml.

Sběr sputa se provádí pod dohledem zdravotnického pracovníka. Osoby odpovědné za sběr sputa musí zajistit dodržování určitých pravidel:

• Je nutné pacientovi vysvětlit účel vyšetření a nutnost vykašlávat nikoli sliny nebo nosohltanový hlen, ale obsah hlubokých částí dýchacích cest. Toho lze dosáhnout produktivním kašlem, který se objeví po několika (2-3) hlubokých nádeších. Je také nutné pacienta upozornit, že si musí nejprve vypláchnout ústa převařenou vodou, aby se odstranila hlavní část mikroflóry vegetující v ústní dutině a zbytky jídla, které komplikují vyšetření sputa;
• Zdravotnický pracovník zapojený do sběru sputa musí kromě pláště a čepice nosit masku, gumové rukavice a gumovou zástěru;
• Pokud pacient stojí za ním, doporučuje se mu držet lahvičku co nejblíže ke rtům a ihned do ní oddělovat sputum, jakmile ho vykašlá, přičemž je nutné zajistit, aby proud vzduchu směřoval od zdravotníka:
• Jakmile je odběr sputa dokončen, měl by zdravotník lahvičku pečlivě uzavřít víčkem a posoudit množství a kvalitu odebraného sputa. Lahvička se poté označí a umístí do speciální krabice pro přepravu do laboratoře.

Pokud pacient neprodukuje sputum, měl by mu být noc před odběrem a brzy ráno v den odběru materiálu podán expektorans: extrakt z kořenů proskurníku lékařského (mukaltin), bromhexin, ambroxol atd. - nebo by měla být použita dráždivá inhalace s využitím zařízení instalovaného v místnosti pro odběr sputa. Takto odebraný materiál nepodléhá konzervaci a měl by být vyšetřen v den odběru. Aby se zabránilo jeho "odmítnutí" v laboratoři, měla by být v doporučení uvedena zvláštní poznámka.

Pokud se v daném zařízení neprovádějí mikrobiologické studie, musí být odebraný diagnostický materiál dodán do laboratoře centrálně, za předpokladu, že je materiál mezi dodávkami uchováván v chladničce nebo s konzervačními látkami. Materiál se do laboratoře dodává v přepravních bednách, které lze snadno dezinfikovat. Každý vzorek musí být opatřen příslušným štítkem a celá šarže musí mít vyplněný průvodní formulář.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Způsoby a frekvence vyšetření pacientů

Během úvodního, tzv. diagnostického, vyšetření pacienta na tuberkulózu je nutné vyšetřit alespoň 3 porce sputa odebrané pod dohledem zdravotnického personálu v průběhu 2 nebo 3 dnů, což zvyšuje účinnost mikroskopie.

Primární screening tuberkulózy by měly provádět všechny lékařské a diagnostické instituce systému zdravotní péče. V poslední době byla za účelem zvýšení efektivity primárního vyšetření na základě klinických diagnostických laboratoří zorganizována tzv. mikroskopická centra, vybavená moderními mikroskopy a zařízeními pro zajištění epidemické bezpečnosti.

Protituberkulózní zařízení používají schéma průzkumu, které zahrnuje alespoň 3násobné vyšetření sputa nebo jiného diagnostického materiálu během 3 dnů. Během léčby se mikrobiologické vyšetření provádějí pravidelně, nejméně jednou měsíčně, v intenzivní fázi chemoterapie. Při přechodu do následné fáze se vyšetření provádějí méně často - v intervalech 2-3 měsíců, přičemž frekvence vyšetření se snižuje na dvě.

Vlastnosti sběru diagnostického materiálu pro extrapulmonální tuberkulózu

Charakteristickým znakem patologického materiálu u extrapulmonálních forem tuberkulózy je nízká koncentrace mykobakterií tuberkulózy v něm, což vyžaduje citlivější metody mikrobiologického výzkumu, především metody setí na živné médium.

V případě urogenitální tuberkulózy je moč nejdostupnějším materiálem k vyšetření. Sběr moči by měla provádět speciálně vyškolená zdravotní sestra.

Zevní genitálie se omyjí vodou a mýdlem nebo slabým roztokem manganistanu draselného. Zevní otvor močové trubice se pečlivě ošetří. Střední část ranní moči se shromažďuje do sterilní lahvičky: u mužů - přirozeně, u žen - pomocí katétru. Moč z ledvinové pánvičky se shromažďuje do sterilních zkumavek během katetrizace jedné nebo dvou ledvin, v druhém případě - nutně odděleně z každé ledviny. Malé množství této moči se centrifuguje a sediment se vyšetří.

U mužů se spermie, vzorky z varlat a sekrety prostaty centrifugují za účelem získání sedimentu. Při jakékoli lokalizaci specifického procesu v genitální oblasti u mužů může masáž prostaty podpořit uvolňování sekretů obsahujících mykobakterie tuberkulózy.

Menstruační krev se u žen odebírá odsáváním nebo pomocí Kafkovy čepičky. Výsledný materiál se zbaví erytrocytů promytím destilovanou vodou a následným odstředěním. Sediment se vyšetří.

Výtok z děložního hrdla se shromažďuje v nějaké nádobě nebo Kafkově čepičce, to znamená, že je žádoucí nashromáždit 1-2 ml patologického materiálu.

Materiál získaný během chirurgických zákroků na ledvinách, genitáliích, biopsie, endometriální šroty se homogenizuje. Za tímto účelem se umístí do sterilní třecí misky a důkladně se rozdrtí sterilními nůžkami. Do výsledné suspenze se přidá sterilní říční písek v množství rovnajícím se její hmotnosti, poté se přidá 0,5-1,0 ml izotonického roztoku chloridu sodného a vše se rozemele, dokud se za přídavku izotonického roztoku chloridu sodného (4-5 ml) nevytvoří kašovitá hmota. Poté se hmota nechá 1-1,5 minuty usadit a supernatant se vyšetří.

Tuberkulóza kostí a kloubů. Vzorek (hnis z abscesů) získaný sterilní injekční stříkačkou se umístí do sterilní nádoby a ihned doručí do laboratoře. Sterilní pipetou, předem navlhčenou sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného, se odebere 2–5 ml hnisu, přenese se do lahvičky s kuličkami a přidají se další 2–3 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Lahvička se uzavře zátkou a třepe se v šejkru po dobu 8–10 minut. Homogenizovaná suspenze se vyšetří.

U píštělových forem osteoartikulární tuberkulózy se hnis odebírá z píštěle. Hojný výtok se sbírá přímo do zkumavky. V případech slabého hnisavého výtoku se píštělní trakt promyje sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného a výplach odebraný do zkumavky nebo kousek tamponu namočeného hnisem se odešle k vyšetření.

Chirurgický materiál získaný během chirurgických zákroků na kostech a kloubech může sestávat z hnisavě-nekrotických mas, granulací, jizevnaté tkáně, kostní tkáně, tkáně synoviální membrány a dalších substrátů. Jeho zpracování se provádí stejně jako v případě renální tuberkulózy.

Mikrobiologické vyšetření synoviální tekutiny v 3% roztoku citrátu sodného (v poměru 1:1) k prevenci srážení se provádí ihned po punkci.

Tuberkulóza lymfatických uzlin. Hnis extrahovaný při punkci lymfatických uzlin se vyšetřuje stejným způsobem jako hnis z abscesů. Tkáň lymfatických uzlin získaná během chirurgických zákroků a biopsií se vyšetřuje stejně jako u jiných forem tuberkulózy.

Studie stolice na Mycobacterium tuberculosis se provádí extrémně zřídka kvůli téměř úplné absenci pozitivních výsledků.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopie mykobakterií

Mikroskopie sputa je relativně rychlá, jednoduchá a levná metoda, která by měla být použita ve všech případech podezření na tuberkulózu. Kromě toho se toto vyšetření provádí k posouzení účinnosti chemoterapie a k potvrzení zotavení nebo selhání léčby v případě absence výsledků kultivace.

Používají se dvě metody mikroskopického vyšetření:

• metoda přímé mikroskopie, kdy se nátěr připraví přímo z diagnostického materiálu;
• metoda mikroskopie sedimentu připraveného z materiálu ošetřeného dekontaminanty pro kulturní výzkum.

První metoda se používá v laboratořích, kde se provádějí pouze mikroskopické studie (klinické diagnostické laboratoře všeobecné lékařské sítě).

Nejlepších výsledků mikroskopického vyšetření se dosáhne zakoncentrováním diagnostického materiálu (například centrifugací).

Aby bylo možné mikroskopicky detekovat Mycobacterium tuberculosis s 50% pravděpodobností, musí 1 ml sputa obsahovat více než 5 000 mikrobiálních buněk. Sputum pacientů s plicními formami tuberkulózy obvykle obsahuje značný počet acidorezistentních bakterií, což umožňuje jejich spolehlivou detekci bakterioskopií. Diagnostickou citlivost této metody lze zvýšit vyšetřením několika vzorků sputa od jednoho pacienta. Negativní výsledek bakterioskopického vyšetření nevylučuje diagnózu tuberkulózy, protože sputum některých pacientů obsahuje méně Mycobacterium, než lze detekovat mikroskopií. Příčinou negativního výsledku bakterioskopického vyšetření může být také špatná příprava nátěrů ze sputa.

Nejběžnější metodou pro detekci acidorezistentních mykobakterií v nátěru je barvení Ziehl-Neelsen. Metoda je založena na pronikání karbolfuchsinu do mikrobiální buňky přes membránu, která obsahuje voskovo-lipidovou vrstvu, za současného účinku zahřívání a silného leptacího účinku fenolu. Následné odbarvení nátěru 25% roztokem kyseliny sírové nebo 3% chlorovodíkovým alkoholem vede k odbarvení všech struktur, které nejsou acidorezistentní. Odbarvené prvky nátěru se barví 0,3% roztokem methylenové modři. Mykobakterie nevnímají konvenční anilinová barviva, v důsledku čehož se acidorezistentní mykobakterie barví malinovočerveně a ostatní mikroby a buněčné prvky se barví modře.

Pro vyšetření nátěrů barvených podle Ziehl-Neelsena se používá světelný binokulární mikroskop s imerzním objektivem (90- nebo 100násobné zvětšení) a okulár se 7- nebo 10násobným zvětšením. Vyšetřuje se 100 zorných polí, což je dostatečné k detekci jednotlivých mykobakterií v nátěru. Pokud je výsledek takového vyšetření negativní, doporučuje se pro potvrzení vyšetřit dalších 200 zorných polí. Výsledky se zaznamenají s uvedením počtu detekovaných acidorezistentních mykobakterií (AFB).

Kromě této metody se pro luminiscenční mikroskopii používá fluorochromové barvení, které umožňuje dosáhnout nejlepších výsledků. Použití této metody zvyšuje účinnost mikroskopie o 10–15 %. Pokud jsou mykobakterie ošetřeny luminiscenčními barvivy (auramin, rodamin atd.), vážou se tyto látky také na voskovité struktury mikrobiální buňky. Když jsou barvené buňky ozářeny excitačním zdrojem světla (určité spektrum ultrafialového záření), začnou na černém nebo tmavě zeleném pozadí zářit oranžově nebo jasně červeně. Díky vysokému jasu a kontrastu viditelného obrazu lze celkové zvětšení mikroskopu snížit 4–10krát, což rozšiřuje zorné pole a zkracuje dobu sledování preparátu. Současně lze díky výrazně větší hloubce ostrosti zvýšit komfort studie.

Při použití fluorescenční mikroskopie trvá prohlížení stejné oblasti nátěru výrazně kratší dobu než světelná mikroskopie nátěrů barvených podle Ziehl-Neelsena. Pokud mikroskopista během pracovního dne prohlédne přibližně 20–25 takových nátěrů, pak s pomocí fluorescenční mikroskopie může za stejnou dobu vyšetřit více než 60–80 vzorků. Zkušení mikroskopisté vědí, že barvení buněk směsí auraminu a rhodaminu je určitým způsobem specifické pro acidorezistentní mykobakterie, které v tomto případě mají vzhled zlatých tyčinek. Saprofyty se barví nazelenale.

Další důležitou výhodou metody fluorescenční mikroskopie je schopnost detekovat pozměněné mykobakterie, které ztratily své kyselinoodolné vlastnosti vlivem řady nepříznivých faktorů, zejména intenzivní chemoterapie, a proto nejsou detekovány Ziehl-Neelsenovým barvením.

Mezi nevýhody metody fluorescenční mikroskopie patří relativně vysoké náklady na mikroskop a jeho provoz. V centralizovaných nebo jiných velkých laboratořích, kde pracovní zátěž přesahuje normu tří laboratorních techniků pracujících se třemi konvenčními mikroskopy, je však levnější použít místo toho jeden fluorescenční mikroskop.

Bakterioskopické metody mají poměrně vysokou specificitu (89-100 %). Přibližně 97 % pozitivních výsledků získaných jakoukoli mikroskopickou metodou je jasně potvrzeno výsledky výsevu.

Je třeba poznamenat, že mikroskopické vyšetření nátěru patologického materiálu neumožňuje určit druh detekovaných kyselinorezistentních mykobakterií. Mikroskopická metoda umožňuje vyvodit závěr pouze o přítomnosti nebo nepřítomnosti kyselinorezistentních mikroorganismů v přípravku, což je vysvětleno existencí velkého počtu netuberkulózních kyselinorezistentních mikroorganismů v přírodě, které jsou morfologicky podobné mykobakteriím tuberkulózního komplexu.

Vyhodnocení výsledků mikroskopie se provádí v semikvantitativních jednotkách.

Aby bylo možné porovnat výsledky různých mikroskopických metod, zavádějí se empirické koeficienty. Například pro porovnání výsledků nátěru barveného fluorescenčními barvivy s daty světelné mikroskopické studie (1000násobné zvětšení) je nutné vydělit počet acidorezistentních mykobakterií detekovaných pomocí fluorescenčního mikroskopu odpovídajícím koeficientem: při 250násobném zvětšení mikroskopu - 10krát, při 450násobném zvětšení - 4krát, při 630násobném zvětšení - 2krát.

Vlastnosti mikroskopie u extrapulmonální tuberkulózy

Provádí se přímá mikroskopie, stejně jako mikroskopie nátěrů připravených po obohacení s následným barvením podle Ziehl-Neelsena nebo fluorescenčními barvivy. Přímá mikroskopie nátěrů je neúčinná kvůli nízké koncentraci mykobakterií v materiálu, a proto je racionálnější použít metody obohacení. Nejúčinnější je centrifugace. Pokud je biologický materiál viskózní, používá se centrifugace se současnou homogenizací a zkapalněním materiálu, která se provádí pomocí vysokorychlostních centrifug s odstředivou silou 3000 g a roztoků chlornanu. Jiné metody obohacení, jako je mikroflotace, se v současnosti nepoužívají kvůli tvorbě biologicky nebezpečných aerosolů.

[ 37 ]

Kultivační metoda pro diagnostiku tuberkulózy

Metoda setí neboli kultivace je citlivější než mikroskopie stěru a má oproti ní řadu výhod. Umožňuje detekovat několik desítek životaschopných mykobakterií ve vyšetřovaném materiálu a má vysokou diagnostickou hodnotu. To je zvláště důležité při vyšetřování materiálu od nově diagnostikovaných nebo léčených pacientů, kteří vylučují malé množství mykobakterií.

Ve srovnání s mikroskopií umožňuje kultivační výzkum zvýšit počet detekovaných pacientů s tuberkulózou o více než 15–25 % a také ověřit tuberkulózu v ranějších stádiích, kdy je onemocnění ještě snadno léčitelné. Za velmi důležitou výhodu kultivačního výzkumu se považuje možnost získání kultury patogenu, kterou lze identifikovat a studovat ve vztahu k citlivosti na léky, virulenci a dalším biologickým vlastnostem.

Mezi nevýhody kultivačních metod patří jejich délka (čekací doba na materiály dosahuje 10 týdnů), vyšší náklady a složitost zpracování diagnostického materiálu.

Zásady předseťové úpravy diagnostického materiálu

Konvenční mikrobiologické metody nelze použít k provádění testů na tuberkulózu. Je to dáno tím, že mykobakterie tuberkulózy rostou velmi pomalu a většina klinických vzorků obsahuje rychle rostoucí pyogenní a hnilobné mikroorganismy a houby. Jejich rychlý růst na bohatých živných médiích narušuje vývoj mykobakterií a neumožňuje izolaci patogenu tuberkulózy, proto musí být diagnostický materiál před výsevem předběžně ošetřen. Mykobakterie uvolněné z dýchacích cest pacienta jsou navíc obvykle obklopeny velkým množstvím hlenu, což ztěžuje jejich koncentraci. V tomto ohledu musí být sputum a další podobné materiály před výsevem zkapalněny a dekontaminovány.

Všechny detergenty a dekontaminační prostředky mají více či méně výrazný toxický účinek na mykobakterie. V důsledku ošetření může uhynout až 90 % mykobakterií. Aby se zachovala dostatečná část mykobakteriální populace, je nutné používat šetrné metody ošetření, které umožňují na jedné straně potlačit rychle rostoucí pyogenní a hnilobné mikroorganismy a na druhé straně maximálně zachovat životaschopnost mykobakterií přítomných v materiálu.

V závislosti na materiálu, jeho homogenitě a stupni kontaminace se pro předběžné ošetření používají různé dekontaminační prostředky: pro sputum - 4% roztok hydroxidu sodného, 10% roztoky trisodného fosforečnanu, benzalkoniumchlorid, trisodný fosforečnan, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein-hydroxid sodný) s konečnou koncentrací NaOH 1 %, pro moč a další tekuté materiály - 3% roztok kyseliny sírové, pro kontaminované vzorky, materiály obsahující tuk - roztok kyseliny šťavelové do 5 %. Kromě toho se v některých případech používají enzymy a povrchově aktivní látky (detergenty). Použití Tweenu a některých dalších detergentů je doprovázeno menším úhynem mykobakteriálních buněk (přežije 40-50 %). Lze je však použít pouze pro tekuté materiály. NALC-NaOH, vyráběný v sadách, je na světě nejrozšířenější. Tato metoda umožňuje izolovat více než 85 % populace mykobakteriálních buněk. Dekontaminace pevných materiálů obsahujících tkáně je obtížnější, protože je obtížné odhadnout stupeň disperze materiálu během homogenizace. Například zpracování biopsií lymfatických uzlin je často doprovázeno zvýšenou frekvencí kontaminace cizí flórou. V tomto případě lze použít 1% etonium.

Nehomogenní materiál se homogenizuje pomocí skleněných kuliček za přítomnosti dekontaminantů. Tekuté materiály se předcentrifugují a zpracovává se pouze sediment.

Technika setí a inkubace

Po předběžném zpracování se materiál centrifuguje, čímž se vysráží mykobakterie a zvýší se jejich obsah v sedimentu („obohacení sedimentu“). Výsledný sediment se neutralizuje a inokuluje na povrch hustých živných médií nebo zkumavek s tekutými (polotekutými) médii. Ze zbývajícího sedimentu se připravují nátěry pro mikroskopické vyšetření. Technika setí musí zabránit křížové kontaminaci diagnostického materiálu.

Pro spolehlivou klinickou interpretaci výsledků mikrobiologického výzkumu je nutné dodržovat následující pravidlo: mikroskopické a kultivační studie musí být prováděny paralelně ze stejného vzorku diagnostického materiálu.

Naočkované zkumavky se umístí na 2 dny do termostatu při 37 ^° C v horizontální poloze. Tím se zajistí rovnoměrnější absorpce materiálu do živného média. Po 2 dnech se zkumavky přesunou do vertikální polohy a hermeticky uzavřou gumovými nebo silikonovými zátkami, aby se zabránilo vysychání naočkovaného média.

Plodiny se uchovávají v termostatu při teplotě 37 ^° C po dobu 10–12 týdnů s pravidelnou týdenní kontrolou. Při každé kontrolní prohlídce se zaznamenávají následující parametry:

• období vizuálně pozorovatelného růstu ode dne setí;
• rychlost růstu (počet CFU);
• kontaminace kultury cizí mikrobiální flórou nebo houbami (takové zkumavky se odstraní);
• žádný viditelný růst. Trubičky jsou ponechány v termostatu až do další kontroly.

Živná média

Pro kultivaci mykobakterií se používají různá živná média: pevná, polotekutá, kapalná. Žádné ze známých živných médií však nemá vlastnosti, které by zajistily růst všech mykobakteriálních buněk. V tomto ohledu se pro zvýšení účinnosti doporučuje používat 2–3 živná média různého složení současně.

Jako standardní médium pro primární izolaci tuberkulózního patogenu a stanovení jeho citlivosti na léky doporučuje WHO Lowenstein-Jensenovo médium. Jedná se o husté vaječné médium, na kterém se mykobakterie rozmnožují 20.–25. den po zasetí bakterioskopicky pozitivního materiálu. Setí bakterioskopicky negativního materiálu vyžaduje delší inkubační dobu (až 10–12 týdnů).

V naší zemi se rozšířilo vaječné médium Finn-II navržené E. R. Finnem. Liší se tím, že místo L-asparaginu používá glutaman sodný, který spouští jiné dráhy syntézy aminokyselin v mykobakteriích. Růst se na tomto médiu objevuje o něco dříve a frekvence izolace mykobakterií je o 6-8 % vyšší než na médiu Lowenstein-Jensen.

Pro zvýšení účinnosti bakteriologické diagnostiky extrapulmonální tuberkulózy je vhodné do komplexu živných médií zařadit modifikované médium Finn-II. Pro urychlení růstu se do živného média Finn-II dodatečně zavádí 0,05% thioglykolát sodný, což snižuje koncentraci kyslíku. Pro ochranu enzymatických systémů mykobakterií před toxickými produkty lipidové peroxidace se do živného média Finn-II zavádí antioxidant α-tokoferolacetát v koncentraci 0,001 μg/ml. Diagnostický materiál se vysévá standardní metodou.

V ruských protituberkulózních laboratořích se používají i další modifikace hustých živných médií: živné médium „Novaya“ navržené G. G. Mordovským, živná média A-6 a A-9 vyvinutá V. Anikinem atd.

Vzhledem k tomu, že během chemoterapie dochází k poškození různých metabolických systémů mikrobiální buňky, část mykobakteriální populace ztrácí schopnost normálního vývoje na konvenčních živných médiích a vyžaduje osmoticky vyvážená (polotekutá nebo tekutá) živná média.

Vyhodnocení a zaznamenání výsledků diagnostické materiální kultury

Některé kmeny a druhy mykobakterií rostou pomalu, růst se může objevit i do 90. dne. Počet takových kultur je malý, ale to nutí výsev uchovávat v termostatu po dobu 2,5–3 měsíců.

Virulentní kultury Mycobacterium tuberculosis obvykle rostou na pevných vaječných médiích jako kolonie ve formě R různé velikosti a vzhledu. Kolonie jsou suché, vrásčité, slonovinově zbarvené a mírně pigmentované. Na jiných médiích mohou být kolonie Mycobacterium tuberculosis vlhčí. Po chemoterapii nebo během léčby mohou být izolovány hladké kolonie s vlhkým růstem (S-formy).

Při izolaci kultur se používá soubor speciálních studií k rozlišení tuberkulózních mykobakterií od netuberkulózních mykobakterií a acidorezistentních saprofytů.

Pozitivní odpověď se získá po povinném mikroskopickém vyšetření nátěru z rostoucích kolonií barvených podle Ziehl-Neelsena. V případě růstu mykobakterií se v nátěrech nacházejí jasně červené tyčinky, ležící jednotlivě nebo ve skupinách a tvořící shluky ve tvaru plsti nebo copánků. V mladých kulturách, zejména izolovaných od pacientů dlouhodobě léčených chemoterapií, se mykobakterie vyznačují výrazným polymorfismem, až po přítomnost krátkých, téměř kokoidních nebo protáhlých variant připomínajících houbové mycelium, spolu s tyčinkovitými formami.

Intenzita růstu mykobakterií se určuje podle následujícího schématu: (+) - 1-20 CFU ve zkumavce (nízké vylučování bakterií); (++) - 20-100 CFU ve zkumavce (střední vylučování bakterií); (+++) - >100 CFU ve zkumavce (hojné vylučování bakterií). V laboratorní diagnostice tuberkulózy nestačí dát odpověď na to, zda byly mykobakterie konkrétní metodou detekovány, či nikoli. Je také nutné mít podrobnou představu o objemu a povaze mykobakteriální populace, jejím složení a vlastnostech. Právě tyto údaje umožňují správně interpretovat stav procesu, naplánovat taktiku a včas upravit léčbu.

V posledních letech byla pro urychlení růstu mykobakterií navržena živná média na bázi agaru s různými růstovými aditivy a použití speciální směsi plynů. Pro dosažení růstu mykobakterií na těchto médiích se během kultivace vytváří atmosféra se zvýšeným obsahem oxidu uhličitého (4–7 %). K tomuto účelu se používají speciální CO2 inkubátory _. Největšího rozvoje však dosáhly automatizované systémy kultivace mykobakterií: MGIT-BACTEC-960 a MB/Bact.

Jedním z takových systémů je systém MGIT (mycobacteria growth indicating tubercule), což je high-tech vývoj a je určen pro urychlenou bakteriologickou diagnostiku tuberkulózy a stanovení citlivosti mykobakterií na léky první volby a některé léky druhé volby. MGIT je určen pro použití jako součást zařízení VASTEC-960. Mikroorganismy se kultivují ve speciálních zkumavkách s tekutým živným médiem na bázi modifikovaného média Middlebrook-7H9. Pro stimulaci růstu mykobakterií a potlačení růstu cizí mikroflóry se používá doplněk MGIT Growth Supplement a směs antibakteriálních léčiv PANTA.

Růst mikroorganismů je registrován opticky. Je založen na fluorescenci, ke které dochází, když mykobakterie během svého růstu spotřebovávají kyslík. Na dně speciální zkumavky je obsaženo kyslíkově závislé fluorochromové barvivo, které je pokryto vrstvou silikonu. Množení mykobakterií vede ke snížení množství kyslíku ve zkumavce a ke snížení jeho koncentrace, což způsobuje zvýšení fluorescence, která se stává viditelnou po ozáření zkumavky ultrafialovým světlem a je automaticky registrována fotosenzory zabudovanými v zařízení VASTES-960. Intenzita luminiscence je registrována v růstových jednotkách (GU). Data o růstu se automaticky zadávají do počítače, kde je lze uložit. Počítačová analýza růstových křivek může poskytnout informace o přítomnosti různých skupin mykobakterií, včetně netuberkulózních, a také pomáhá vyhodnotit růstové vlastnosti mykobakterií.

V důsledku zavedení takových systémů se výrazně zkrátila doba růstu mykobakterií, v průměru 11 dní na VASTEC-960 a 19 dní na MB/Bact oproti 33 dnům na standardním hustém živném médiu. Je třeba poznamenat, že tyto systémy vyžadují vysoce kvalifikovaný personál. Výsev materiálu na tekutá média je nutně doprovázen výsevem na Lowenstein-Jensen médium, které hraje roli zálohy v případech, kdy tuberkulózní mykobakterie nerostou na jiných médiích.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Stanovení citlivosti mykobakterií na léky

Stanovení spektra a stupně citlivosti mykobakterií na antituberkulózní léky má velký klinický význam, stejně jako pro epidemiologické hodnocení šíření tuberkulózy rezistentní na léky. Monitorování lékové rezistence nám navíc umožňuje posoudit účinnost antituberkulózního programu jako celku a je nedílným ukazatelem práce všech složek antituberkulózních opatření.

Frekvence a načasování testů citlivosti na léky:

• před zahájením léčby, jednou pro určení léčebné strategie a taktiky:
• Při izolaci kultur z různých materiálů od pacienta (sputum, BAL, moč, exsudáty, mozkomíšní mok atd.) se vyšetřují všechny izolované kmeny:
• na konci intenzivní fáze léčby při absenci klinické a radiologické dynamiky:
• pokud je nutné změnit léčebný režim v případě:
  • absence negativity sputa;
  • rekultivace po negativním testu na sputum;
  • prudký nárůst množství AFB v nátěru po počátečním poklesu. Je dobře známo, že z materiálu od pacienta s tuberkulózou jsou izolovány kmeny Mycobacterium tuberculosis s různou citlivostí na léky. Citlivost kmenů na antituberkulózní léky se může lišit ve spektru léků, stupni, frekvenci a rychlosti vývoje rezistence.

Stupeň rezistence Mycobacterium tuberculosis na léky se stanoví podle stanovených kritérií, která jsou zaměřena na klinický význam rezistence a závisí na antituberkulózní aktivitě léku, jeho farmakokinetice, koncentraci v lézi, maximální terapeutické dávce atd.

Stanovení citlivosti mykobakterií na léky se v současnosti provádí pomocí mikrobiologických metod:

• absolutní koncentrace (metoda ředění na pevných nebo kapalných živných médiích),
• proporce,
• součinitel odporu.

Rezistence se obvykle projevuje ve formě vizuálně pozorovatelného růstu kolonií mykobakterií tuberculosis, existují však metody, které indukují růst v raných fázích dělení mykobakteriálních buněk ve formě barevných reakcí. Tyto metody zkracují dobu testování z 3–4 na 2 týdny.

Metoda absolutní koncentrace doporučená chemoterapeutickým výborem WHO se v Rusku rozšířila jako jednotná metoda. Z metodologického hlediska je nejjednodušší, ale vyžaduje vysokou standardizaci a přesnost laboratorních postupů. Test citlivosti na léky se skládá ze sady zkumavek s živným médiem modifikovaným antituberkulózními léky. Sada se skládá ze 2–3 zkumavek s různými koncentracemi každého z použitých léků, jedné kontrolní zkumavky s médiem bez léku a jedné zkumavky obsahující 1000 μg/ml salicylátu sodného nebo 500 μg/ml kyseliny paranitrobenzoové pro detekci růstu netuberkulózních mykobakterií.

Pro přípravu sady médií s preparáty se používá modifikované Lowenstein-Jensenovo médium (bez škrobu), které se nalije do baněk. Do každé baňky se přidá určitý objem odpovídajícího ředění antituberkulózního léku. Obsah baněk se důkladně promíchá, nalije do zkumavek a koaguluje se v nakloněné poloze po dobu 40 minut při teplotě 85 °C. Doporučuje se koagulovat médium v elektrickém koagulátoru s automatickou regulací teploty. Médium s antituberkulózními léky

1. řadu lze skladovat v chladničce při teplotě 2–4 °C po dobu 1 měsíce, léky 2. řady – ne déle než 2 týdny. Skladování médií s léky při pokojové teplotě je nepřijatelné. Při přípravě roztoků antituberkulózních léků se bere v úvahu jejich aktivita, přičemž se koncentrace vypočítává s úpravou na molekulovou hmotnost nespecifické části léku, čistotu atd. Pro stanovení citlivosti na léky se používají pouze chemicky čisté látky.

Principem metody je stanovení koncentrace antituberkulózního léku, která potlačuje růst významné části populace mykobakterií. Při správném provedení má tato metoda dobrou spolehlivost.

Před provedením testu je nutné se ujistit, že izolovaná kultura Mycobacterium tuberculosis neobsahuje cizí mikroflóru. Z kultury mykobakterií v 0,9% roztoku chloridu sodného se připraví homogenní suspenze obsahující 500 milionů mikrobiálních tělísek v 1 ml (optický standard zákalu 5 jednotek). Výsledná suspenze se zředí 0,9% roztokem chloridu sodného (1:10) a do každé zkumavky sady živných médií se přidá 0,2 ml suspenze. Naočkované zkumavky se umístí do termostatu při 37 °C a udržují se 2–3 dny vodorovně tak, aby šikmý povrch živného média byl rovnoměrně naočkován suspenzí Mycobacterium tuberculosis. Poté se zkumavky přesunou do svislé polohy a inkubují se 3–4 týdny. Výsledky se zaznamenají po 3–4 týdnech.

Vzhledem k tomu, že doba potřebná k izolaci patogenu z klinického materiálu na živných médiích je nejméně 1–1,5 měsíce, lze výsledky stanovení citlivosti na léky touto metodou získat nejdříve 2–2,5 měsíce po naočkování materiálu. To je jedna z hlavních nevýhod metody.

Výsledky testování citlivosti mykobakterií na léky se interpretují na základě určitých kritérií. Na pevných médiích se kultura považuje za citlivou na koncentraci léku obsaženého v médiu, pokud počet kolonií mykobakterií vypěstovaných v dané zkumavce s lékem nepřesáhne 20 s hojným růstem v kontrolní zkumavce bez léků. Pouze pokud je více než 20 kolonií, je kultura považována za rezistentní na danou koncentraci. V praxi, pokud se ve zkumavkách získají výsledky růstu blízké 20 CFU, je nutné informovat klinické oddělení, že citlivost nebo rezistence je v tomto případě hraniční, protože to může někdy vysvětlit nejasnou dynamiku klinických ukazatelů.

U různých přípravků se stanoví určitá koncentrace, při které se pozoruje reprodukce kritického podílu mykobakteriální populace. Tyto koncentrace se nazývají „kritické“. Jako kritérium stability se používá velikost růstu mykobakteriální populace na živném médiu s přípravkem v kritické koncentraci.

V domácí ftizeologické praxi se při určování lékové rezistence neomezují pouze na stanovení kritických koncentrací. To je dáno tím, že rozšířená definice úrovně lékové rezistence patogenu umožňuje lékaři správněji formulovat taktiku chemoterapie s využitím znalostí potenciačního účinku lékových kombinací, předvídat zkříženou rezistenci nebo používat účinnější léky z používané skupiny antituberkulózních léků.

Metoda absolutní koncentrace je nejjednodušší, ale také nejcitlivější na chyby při jejím provádění. Spolehlivější, zejména při stanovení citlivosti na léky druhé volby, a rozšířenější mimo Rusko je proporcionální metoda. Zohledňuje nedostatky metody absolutní koncentrace, ale její implementace je náročnější na práci.

Metoda je velmi podobná metodě absolutní koncentrace. Příprava zkumavek s léčivy je stejná jako u metody absolutní koncentrace. Iniciální dávka suspenze mykobakterií tuberkulózy je však 10krát snížena, což eliminuje frekvenci spontánní rezistence některých kmenů mykobakterií tuberkulózy na léčiva, jako je ethambutol, prothionamid, kapreomycin. Jako kontroly se používají 2 nebo 3 zkumavky s iniciální dávkou stejnou jako ve zkumavkách, postupně ředěné 10krát a 100krát. Kritériem rezistence je podíl vizuálně pozorovaného růstu mykobakterií tuberkulózy. U léčiv 1. linie je kritériem rezistence nadměrný růst o 1 % počáteční populace, u léčiv 2. linie - růst o 1 nebo více než 10 % počáteční populace, v závislosti na zvolené kritické koncentraci.

V roce 1997 pracovní skupina WHO a Mezinárodní unie proti tuberkulóze pro detekci rezistence na antituberkulózní léky provedla úpravy těchto kritérií a navrhla považovat mykobakterie rostoucí na hustém vaječném médiu Lowenstein-Jensen v následujících koncentracích za rezistentní:

• dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Ethambutol - 2 mcg/ml.

V roce 2001 byly navrženy kritické koncentrace pro následující léky druhé volby (pro kritický podíl 1 %):

• kapreomycin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycin - 30 μg/ml;
• viomycin - 30 μg/ml;
• cykloserin - 40 mcg/ml;
• kyselina aminosalicylová - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacin - 2 mcg/ml.

Výsledky růstu se hodnotí po 4 týdnech jako předběžné a po 6 týdnech kultivace jako konečné.

Pro stanovení citlivosti na pyrazinamid, který se široce používá v moderní chemoterapii tuberkulózy, je doporučená kritická koncentrace 200 μg/ml. Stále však neexistuje obecně uznávaná metoda pro stanovení rezistence na tento lék na pevných živných médiích, protože jeho antibakteriální aktivita se projevuje pouze v kyselém prostředí (pH

Pro posouzení kvality výsledků stanovení citlivosti mykobakterií na léky se doporučuje kontrolovat každou novou šarži média Lowenstein-Jensen paralelním stanovením citlivosti standardního muzejního kmene H37Rv. Kromě toho existují určitá mikrobiologická kritéria, která musí být splněna, aby metody poskytly dobře reprodukovatelný a správně interpretovaný výsledek. Patří mezi ně životaschopnost kultury tuberkulózních mykobakterií, pravidla pro získání homogenní suspenze a suspenze, pravidla pro výběr kultur tuberkulózních mykobakterií a reprezentativnost vybrané bakteriální hmoty. Spolehlivost stanovení rezistence na léky klesá při extrémně špatném vylučování bakterií.

V poslední době se metoda stanovení citlivosti na léky pomocí automatizovaných systémů ukázala jako slibná. Nejpokročilejší v této oblasti jsou vývoje založené na VASTEC MGIT-960. V tomto případě se citlivost mykobakterií tuberkulózy na léky stanovuje na základě modifikované proporcionální metody. Během stanovení se porovnává rychlost růstu mykobakterií tuberkulózy v kontrolní zkumavce a ve zkumavkách s léky. Pro stanovení citlivosti na streptomycin, isoniazid, rifampicin a ethambutol se používají obohacující přísady a antibiotika obsažená v soupravě SIRE. Pro stanovení citlivosti na pyrazinamid se používá souprava PZA. Během testu se zkumavky s léky inokulují suspenzí mykobakterií tuberkulózy a kontrolní zkumavky se 100násobným ředěním suspenze pro všechny léky, s výjimkou pyrazinamidu, kde je ředění suspenze 10krát. Kritériem stability je indikátor růstu mykobakterií 100 GU, když růst v kontrolní zkumavce dosáhne 400 GU (viz „Kulturativní metody pro izolaci mykobakterií“). Výsledky se zaznamenávají a interpretují automaticky a jsou nastaveny zadaným nebo zvoleným programem.

Konečné koncentrace ve zkumavce s tekutým živným médiem se používají jako kritické koncentrace. V současné době byly kritické koncentrace vyvinuty jak pro léky první volby, tak pro některé léky druhé volby. Je třeba poznamenat, že stanovení citlivosti tuberkulózních mykobakterií na cykloserin a kyselinu aminosalicylovou se provádí pouze na vaječných živných médiích.

Podrobný protokol pro práci s popsaným systémem umožňuje testování citlivosti na léky jak na izolované kultuře (s hustým živným médiem), tak i s využitím primárního růstu mykobakterií ve zkumavce MGIT. Druhá možnost výrazně zkracuje čas potřebný k provedení kultivačních studií a umožňuje získat kompletní výsledky kultury tuberkulózních mykobakterií (včetně informací o citlivosti na léky) do 3 týdnů od odběru materiálu, zatímco tradiční metoda to dokáže poskytnout až do 3. měsíce. Včasné výsledky, kdy je pacient v intenzivní fázi léčby, mohou kompenzovat relativně vysoké náklady na studie.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferenciace mykobakterií

Vzhledem k tomu, že použité živné půdy nejsou striktně selektivní, je následná diferenciace izolovaných mykobakterií považována za povinnou. Potřeba diferenciace mykobakterií je dána řadou zvláštností patologických procesů způsobených zástupci rodu: odlišný průběh a výsledek tuberkulózy a mykobakteriózy, přítomnost přirozené rezistence na některé antituberkulózní léky.

Je známo, že primární identifikace mykobakterií komplexu M. tuberculosis od netuberkulózních mykobakterií se provádí podle následujících charakteristik: rychlost růstu na hustých živných médiích, tvorba pigmentu, morfologie kolonií, přítomnost kyselinové rezistence a teplotní optimum pro růst.

Bohužel neexistuje jediná laboratorní metoda, která by dokázala spolehlivě odlišit mykobakterie komplexu M. tuberculosis od jiných acidorezistentních mykobakterií; kombinace výše popsaných znaků s výsledky řady biochemických testů uvedených níže však umožňuje identifikaci mykobakterií komplexu M. tuberculosis s pravděpodobností až 95 %.

K odlišení mykobakterií komplexu M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii a další) od pomalu rostoucích netuberkulózních mykobakterií se používají základní biochemické testy k detekci přítomnosti následujících znaků:

• schopnost produkovat kyselinu nikotinovou (niacinový test):
• aktivita nitrátreduktázy;
• termostabilní kataláza;
• růst na médiu se salicylátem sodným (1 mg/ml).

Jako doplňkový test lze použít i růstové testy na médiu obsahujícím 500 μg/ml kyseliny para-nitrobenzoové nebo 5% chlorid sodný.

Mnoho bakteriologických laboratoří identifikuje tyto mikroorganismy pouze na komplexní úrovni, což je dáno omezenými možnostmi laboratoří a metodologickými možnostmi specialistů.

Ve většině případů v praxi postačují k rozlišení M. tuberculosis a M. bovis následující testy: niacin, nitrátreduktáza, pyrazinamidáza a registrace růstu na médiu obsahujícím 2 μg/ml hydrazidu kyseliny thiofen-2-karboxylové. Bere se v úvahu, že mykobakterie komplexu M. tuberculosis se vyznačují následující sadou znaků:

• pomalý růst (více než 3 týdny);
• teplota růstu v rozmezí 35-37 ^° C;
• absence pigmentace (slonovinová barva);
• výrazné kyselinovzdorné zbarvení;
• pozitivní test na niacin;
• pozitivní test na nitrátreduktázu;
• absence termostabilní katalázy (68 ^° C).
• absence růstu na Lowenstein-Jensenově médiu obsahujícím:
  • 1000 µg/ml kyseliny salicylové sodné,
  • 500 mcg/ml kyseliny para-nitrobenzoové,
  • 5% chlorid sodný:
• růst v přítomnosti 1–5 μg/ml kyseliny thiofen-2-karboxylové.

Relevance diferenciace izolovaných mykobakterií se bude významně zvyšovat s rostoucí četností registrace případů HIV/AIDS spojených s tuberkulózou nebo mykobakteriózou. V současné době neexistuje absolutní jistota, zda jsou praktické regionální laboratoře připraveny správně provádět tento objem práce.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Imunologická diagnostika tuberkulózy

Existuje řada univerzálních jevů, přípravků a imunologických testů, které byly původně objeveny konkrétně u tuberkulózy nebo v modelu imunitní odpovědi na mykobakterie. Patří mezi ně BCG a tuberkulin, jev jako je kožní DST (tuberkulinové testy - Pirquetova a Mantouxova reakce), reakce na subkutánní podání tuberkulinu senzibilizovaným zvířatům (Kochův jev). Některé z prvních protilátek u infekčních onemocnění byly také objeveny u tuberkulózy. Čím hlubší je pochopení mechanismů antituberkulózní imunity a jejich genetické kontroly, tím širší může být využití imunologických metod a přípravků ovlivňujících imunitu pro řešení praktických problémů ftizeologie.

Za nejdůležitější a nejsložitější praktický problém je v současnosti považována detekce tuberkulózy v procesu hromadného screeningu populace. Navzdory četným zprávám o „úspěších“ (na omezeném materiálu) však neexistuje žádná imunologická metoda (reprodukovatelná v „libovolných rukou“) ani lék vhodný pro tyto účely.

V klinické praxi se široce používají imunologické metody, zejména sérologické studie (stanovení antigenů, protilátek) a tuberkulinové provokační testy.

Sérologické metody, které stanovují antigeny a protilátky v různých prostředích těla, jsou na prvním místě mezi imunologickými studiemi používanými v diferenciální diagnostice.

Specifičnost stanovení protilátek proti mykobakteriím tuberculosis závisí na antigenech použitých v imunitní analýze. Bylo navrženo značné množství antigenů, prvním z nich je tuberkulin PPD:

• PPD a další komplexní přípravky z kultivační tekutiny;
• ultrazvukový dezintegrační prostředek;
• Tritonový extrakt a další komplexní přípravky z buněčných stěn;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• kordový faktor (trehalóza-6,6-dimykolát);
• fenolické a jiné glykolipidy;
• lipopolysacharidy;
• antigen vázající fibronektin;
• proteiny (nejčastěji rekombinantní); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA atd.

V důsledku dlouholetého výzkumu ruských i zahraničních vědců byly identifikovány hlavní vzorce tvorby protilátek a účinnost sérologické diagnostiky tuberkulózy: čím složitější antigen, tím vyšší je citlivost a nižší specificita testů. Specifičnost se v různých zemích liší v závislosti na infekci populace M. tuberculosis a netuberkulózními mykobakteriemi, na očkování BCG atd. U dětí je informativita sérodiagnostiky nižší než u dospělých. U primární tuberkulózy (častěji u dětí) je informativnější stanovení IgM; u sekundární tuberkulózy - IgG. U HIV-infikovaných osob je informativita sérodiagnostiky při stanovení protilátek snížena. Účinnost stanovení protilátek závisí na řadě „klinických momentů“: aktivitě procesu (přítomnost nebo nepřítomnost „izolace“ mykobakterií, přítomnosti kazových dutin, stupni infiltrace), prevalenci procesu, délce jeho průběhu.

Citlivost metody enzymového imunotestu (EIA) je přibližně 70 %. Nedostatečná účinnost studie je dána její nízkou specificitou. Dříve byly zvažovány možnosti využití sérologického screeningu u rizikových skupin, zejména u osob s posttuberkulózními změnami na plicích.

Pro zvýšení specificity ELISA se hledají specifičtější antigeny, včetně těch získaných genetickým inženýrstvím: ESAT-6 atd. (viz výše). Použití striktně specifických antigenů (38 kDa, ESAT) zvyšuje specificitu, ale významně snižuje citlivost analýzy. Spolu s ELISA (experimentální laboratorní testovací systémy, jako je Pathozyme ELISA kit) se nabízejí i imunochromatografické kity s laterální filtrací (Mycodot) a další podobné testy (membránová tečková analýza) s vizuálním posouzením výsledku testu. Při provádění těchto testů trvá analýza 10–30 minut; nevyžadují speciální vybavení, vyžadují vizuální posouzení výsledků, což je spojeno s určitou subjektivitou. Tyto metody mají přibližně stejné charakteristiky citlivosti a specificity (70 %, respektive 90–93 %) jako tradiční ELISA.

Použití metod imunologické analýzy má určitou hodnotu jako doplňková metoda zohledňovaná v komplexu metod používaných v diferenciální diagnostice tuberkulózy, zejména v diagnostice jejích extrapulmonálních forem. Metoda ELISA je nejúčinnější v diagnostice tuberkulózní meningitidy při vyšetření mozkomíšního moku. V tomto případě je senzitivita analýzy 80-85 % a specificita 97-98 %. Existují informace o účinnosti stanovení protilátek proti Mycobacterium tuberculosis v slzné tekutině při diagnostice tuberkulózní uveitidy.

Indukce syntézy gama interferonu in vitro

Gama interferon (IFN-γ) je faktor specifické imunitní ochrany, realizovaný aktivací enzymatických systémů makrofágů. Indukce syntézy IFN-γ senzibilizovanými T-lymfocyty je způsobena jejich interakcí s mykobakteriálními antigeny.

Jako antigeny se používají jak tuberkulinová PPD, tak specifické antigeny získané genetickým inženýrstvím, zejména antigen ESAT-6 (časně sekretovaný antigen s molekulovou hmotností 6 kDa) a CFP-10 (protein kultivačního filtrátu, 10 kDa). Geneticky upravené nebo rekombinantní antigeny v buňkách BCG vakcíny a dalších mykobakterií chybí. Při použití tuberkulinu jsou výsledky indukčního testu IFN-γ srovnatelné s výsledky tuberkulinového kožního testu (přímá korelace). Při použití geneticky upravených antigenů jsou výsledky testu specifičtější a nezávisí na předchozím očkování BCG. Při vyšetření očkovaných jedinců, kteří nepřišli do kontaktu s tuberkulózní infekcí, je specificita testu 99 %. Citlivost testu u pacientů s tuberkulózou se pohybuje od 81 do 89 %.

Byly vyvinuty testy a diagnostika založené na krátkodobé kultivaci celých krvinek nebo mononukleárních buněk izolovaných z krve s antigeny tuberkulózních mykobakterií in vitro, po níž následuje stanovení koncentrace IFN-γ nebo počítání počtu T-lymfocytů syntetizujících IFN-γ. Koncentrace interferonu syntetizovaného ve zkumavce se stanoví metodou ELISA s použitím monoklonálních protilátek, které se vážou na IFN-γ. Poté se pomocí kalibrace standardního IFN-γ stanoví jeho koncentrace ve zkumavce nebo jamkách destičky.

V Elispot testu se počet T buněk syntetizujících IFN-γ spočítá na povrchu misky potažené protilátkami proti IFN-γ.

Vývojáři in vitro diagnostického testu s indukcí IFN-γ, který je schválen americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA), tvrdí, že test nedokáže rozlišit latentní tuberkulózní infekci od aktivní tuberkulózy. V oblastech s vysokou mírou infekce proto test nemá přímou diagnostickou hodnotu. V naší zemi jej však lze použít k odlišení tuberkulózní infekce u dětí od alergie po očkování a také k posouzení úrovně specifické imunity během léčby.

V současné době se studuje domácí testovací systém pro stanovení indukce syntézy IFN-γ specifickými tuberkulózními antigeny in vitro.

Imunitní stav a průběh tuberkulózy, imunokorekce

Během léčby tuberkulózy dochází u lidí ke změnám v antigenemii a stavu imunitního systému.

Údaje o změnách v exsudátech a tkáních jsou do značné míry protichůdné. Jediné, co lze s plným oprávněním poznamenat, je, že tuberkulózní granulomy zpravidla obsahují významný počet aktivovaných T-lymfocytů.

Dává smysl zaměřit se na další dva body, které jsou nezbytné pro pochopení role imunologických mechanismů v léčbě tuberkulózy u lidí:

• Pacienti s AIDS mají obzvláště vysoký výskyt rozvoje mnohočetné lékové rezistence;
• V případě mnohočetné lékové rezistence (a při absenci HIV infekce) jsou obzvláště významné poruchy imunity (především T-buněčné imunity).

U tuberkulózy se široce používají různé metody imunokorekce: v první řadě se jedná o léky, které působí hlavně na imunitu T-buněk a systém mononukleárních fagocytů (hormony brzlíku, izofon, likopid, polyoxidonium atd.), jakož i celé (atenuované) mykobakterie a jejich složky.

Molekulárně biologická diagnostika tuberkulózy

Metody molekulární biologie v diagnostice infekčních onemocnění zahrnují především metody založené na manipulaci s genomovými materiály bakteriálních a virových patogenů za účelem identifikace specifického genetického materiálu - úseků DNA s nukleotidovou sekvencí specifickou pro daný druh nebo kmen patogenu, pro analýzu specifických sekvencí DNA v genech, které určují citlivost patogenu na určité léky, a také pro analýzu funkční aktivity určitých genů patogenu. Molekulárně biologické metody se rozšířily ve vědeckém výzkumu a praktickém uplatnění v diagnostice a monitorování různých bakteriálních a virových infekcí po objevu polymerázové řetězové reakce v roce 1985 Carrie Mullis (laureátka Nobelovy ceny. 1989).

Principy a možnosti metody polymerázové řetězové reakce

PCR umožňuje amplifikaci (znásobení) nukleotidové sekvence (fragmentu DNA patogenu) ve zkumavce během několika hodin milionkrát. Provedení reakce v přítomnosti jednotlivých řetězců DNA určuje mimořádně vysokou citlivost analýzy.

Nukleotidová sekvence určitých úseků řetězce DNA určuje genetickou jedinečnost mikroorganismu, což vysvětluje vysokou specificitu PCR.

Význam této metody pro detekci a studium charakteristik Mycobacterium tuberculosis je dán biologickými vlastnostmi mikroorganismu, který má velmi pomalý růst: doba zdvojnásobení DNA Mycobacterium tuberculosis během jejich kultivace je 12-24 hodin.

Principem metody PCR je amplifikace - mnohonásobné, milionykrát násobené úseky specifické sekvence DNA v mikroobjemu zkumavky s cyklickým opakováním následujících tří reakčních fází, z nichž každá probíhá v jiném teplotním režimu:

• Fáze I - denaturace dvouvláknové DNA při zahřívání s divergencí jejích řetězců;
• Fáze II - komplementární vazba (hybridizace) primerů (priming oligonukleotidů) s koncovými úseky řetězců striktně specifického fragmentu DNA vybraného pro amplifikaci;
• Fáze III – dokončení řetězce fragmentu DNA pomocí termostabilní DNA polymerázy.

Pro amplifikaci musí zkumavka obsahovat molekuly matrixové DNA. Čtyři typy deoxynukleosidtrifosfátů (nukleotidů) obsahující odpovídající dusíkaté báze: adenin (A), thymin (T), guanin (G), cytosin (C); uměle syntetizované priming oligonukleotidy (primery) sestávající z 18-20 párů bází; termostabilní enzym DNA polymeráza s teplotním optimem 68-72 ^° C a hořečnaté ionty.

Specifičnost PCR závisí na volbě fragmentu DNA. V souladu s ním se syntetizují lemující primery oligonukleotidů. Specifičnost hybridizace a dokončení řetězce DNA je určena principem komplementarity následujících párů dusíkatých bází: adenin-thymin, guanin-cytosin.

Pro stanovení genomu mykobakterií tuberkulózního komplexu je ve většině testovacích systémů nejúčinnějším cílem amplifikace fragment DNA IS6110, který má u většiny kmenů mykobakterií tuberkulózy v genomu významný počet (10-20) repetic, což zajišťuje kromě specificity i vysokou citlivost analýzy. Zároveň byly popsány kmeny mykobakterií tuberkulózy s malým počtem repetic nebo s absencí fragmentu IS6110.

Extrakce molekul DNA z biologického vzorku

Pro provedení PCR je nutné z biologického materiálu izolovat molekuly DNA patogenu v minimálním objemu, s minimálním množstvím nespecifické DNA a různými inhibitory enzymu - DNA polymerázy.

Příprava vzorků musí probíhat za podmínek, které zabraňují křížové kontaminaci studovaných vzorků izolovanými molekulami DNA. To vyžaduje předběžné ošetření místnosti ultrafialovým světlem, podlah a pracovních ploch stolů a přístrojů roztoky obsahujícími chlór. Je také nutné používat čisté rukavice, jednorázové zkumavky a špičky pro automatické pipety.

Pro izolaci DNA Mycobacterium tuberculosis z klinických vzorků (mozkomíšní mok, bronchiální laváž), které neobsahují velké množství leukocytů, buněčných zbytků nebo solí, stačí vzorek centrifugovat při 3–4 tisících otáčkách za minutu, přidat k sedimentu 20–30 µl 2% roztoku Tritonu X-100 a zahřívat při 90 ^° C po dobu 30 minut.

Příprava vzorku sputa vyžaduje účinné zkapalnění, obvykle za použití 4% hydroxidu sodného a N-acetyl-L-cysteinu (NALC) v množství 50–80 mg na vzorek, v závislosti na viskozitě vzorku. Roztok NALC by měl být připraven ex tempore nebo lze prášek NALC přidat suchý přímo do vzorku. Po zkapalnění by měly být vzorky centrifugovány po dobu 15 minut při 3 500–4 000 ot/min (3 000 g) v 50ml zkumavkách se šroubovacím uzávěrem, tj. za stejných podmínek doporučených pro přípravu sputa před kultivací.

K extrakci DNA ze sedimentu se nejčastěji používá metoda založená na použití 5-6 molárního roztoku guanidinisothiokyanátu jako lyzačního činidla a mikroporézních částic oxidu křemičitého („křemelina“), které sorbují molekuly DNA. Nespecifické látky, včetně případných inhibitorů, se poté promyjí v 2,5 molárním roztoku guanidinisothiokyanátu a roztoku ethanolu, načež se molekuly DNA desorbují ve vodě a tyto vzorky se používají k provedení PCR. Pro zjednodušení technologie extrakce DNA se „křemelina“ často nahrazuje magnetickými mikročásticemi potaženými oxidem křemičitým. V tomto případě se k precipitaci částic místo centrifugace používá speciální magnetický stojan na mikrozkumavky.

V Rusku byla vyvinuta originální metoda imunomagnetické separace mykobakterií s následnou extrakcí DNA patogena. Pro imunomagnetickou separaci tuberkulózních mykobakterií se používají feročástice o velikosti 3-5 μm, potažené oxidem křemičitým, ke kterým jsou chemickou vazbou připojeny polyklonální (králičí) protilátky proti tuberkulózním mykobakteriím. Vzorky sputa se po alkalické lýze neutralizují kyselým roztokem Tris-HCl a inkubují se s imunomagnetickým sorbentem. Poté se imunoferočástice odeberou pomocí magnetické tyčinky s vyměnitelnou špičkou, přenesou se do mikrozkumavky a precipitují. Přidá se 20-30 μl 2% roztoku Triton X-100 a zahřívá se 30 minut při 90 ^° C. Supernatant se použije jako DNA matrice pro PCR analýzu.

Obtížným problémem je extrakce DNA tuberkulózních mykobakterií z bioptických vzorků. Pro lýzu biopsie se používá enzym proteináza K v konečné koncentraci 200-500 mg/l při teplotě 56 ^° C přes noc. Poté se extrahuje jednou ze známých metod. Nadbytek nespecifické DNA v PCR analýze bioptických vzorků často způsobuje inhibici reakce, což vyžaduje opakovanou extrakci DNA.

Metody detekce výsledků

Po dokončení reakce jsou amplifikované fragmenty patogenní DNA identifikovány pomocí různých metod.

Metoda gelové elektroforézy je dobře známá. V tomto případě je získaný fragment DNA identifikován pozitivní kontrolou obsahující požadovaný specifický fragment DNA, nebo předem známou velikostí (počet nukleotidových párů) fragmentu, která je stanovena pomocí standardního molekulárního markeru.

V přítomnosti specifického barviva - ethidiumbromidu, které je součástí dvouvláknové DNA, se syntetizovaný fragment DNA projeví jako pás, který září pod vlivem ultrafialového světla.

Velikost fragmentu DNA, stanovená elektroforézou na základě vzdálenosti uražené od začátku, musí odpovídat známému markeru molekulové hmotnosti nebo pozitivní kontrole.

Další metody pro stanovení výsledků PCR jsou založeny na hybridizaci jednovláknových PCR produktů s komplementárním oligonukleotidem - DNA sondou značenou biotinem, s následnou detekcí pomocí enzymatické reakce, například vazbou konjugátu streptavidin-alkalická fosfatáza na biotin.

Na základě tohoto typu detekce byly vytvořeny PCR analyzátory, u kterých se detekce výsledků PCR provádí automaticky v důsledku odečtu optické hustoty ve vzorcích po proběhnutí enzymatické reakce.

Nevýhodou těchto metod je možnost kontaminace v laboratoři poměrně krátkými fragmenty molekul DNA. Když se tyto molekuly dostanou do nově testovaných vzorků, stanou se matricí pro PCR a vedou k falešně pozitivním výsledkům.

V tomto ohledu jsou pro prevenci falešně pozitivních výsledků zavedena přísná pravidla pro oddělení a izolaci místností: pro extrakci DNA z biologických vzorků; místností pro detekci výsledků (elektroforéza) od čisté zóny. Tyto místnosti představují zónu pravděpodobné kontaminace. Další izolovanou zónou je čistá místnost pro zavádění studovaných vzorků DNA do zkumavek s reakční směsí pro PCR. A konečně se předpokládá, že hlavní zařízení - DNA amplifikátor - by mělo být přeneseno do samostatné, pokud možno kancelářské místnosti.

Aby se zabránilo kontaminaci produkty předchozích reakcí – amplikony, některé PCR testovací systémy obsahují místo deoxynukleosidu thymidinu deoxynukleosid uridin, který se během syntézy řetězce in vitro zabuduje do odpovídající pozice, tj. dusíkatá báze thymin přítomná v nativní DNA je nahrazena uracilem. Uracil DNA glykosyláza přidaná do reakční směsi analyzovaného materiálu ničí pouze kontaminující fragmenty deoxyuridinem, nikoli však nativní analyzovanou DNA obsahující deoxythymidin. Následné zahřátí na 94 ^o C tento enzym inaktivuje a neinterferuje s amplifikací v PCR.

Existuje testovací systém založený na izotermální amplifikaci rRNA, u kterého se nejprve provede reverzní transkripce a syntéza molekul DNA, které následně slouží jako matrice pro následnou syntézu molekul RNA. Amplikony RNA se detekují pomocí DNA sondy barvené akridinem během hybridizace v roztoku v reakční zkumavce. Tato metoda má kromě vysoké citlivosti výhodu v provedení analýzy v jedné zkumavce, což zabraňuje kontaminaci. Podle autorů dosahuje citlivost této metody ve vzorcích z dýchacích cest 90 % se specificitou 99–100 %.

V real-time PCR se implementují nové detekční metody. Tyto metody se liší především tím, že PCR a detekce jejích výsledků se provádějí současně v jedné uzavřené zkumavce. To nejen technologicky zjednodušuje metodu analýzy, ale také zabraňuje kontaminaci laboratorních prostor a vzorků produkty předchozí PCR.

V real-time PCR jsou výsledky detekovány fluorescencí vznikající hybridizací fluorogenní DNA sondy se specifickým fragmentem DNA amplifikovaným během PCR. Struktura fluorogenních DNA sond je konstruována tak, že fluorescenční marker se uvolňuje v důsledku enzymatické reakce nebo se distancuje od molekuly zhášeče fluorescence až po specifické hybridizaci s požadovanou molekulou DNA amplifikovanou během PCR. S rostoucím počtem molekul hybridizovaných se sondou je zvýšení fluorescence na detekovatelnou úroveň úměrné počtu molekul amplifikovaného produktu. Vzhledem k tomu, že se počet molekul fragmentu DNA během každého cyklu PCR zdvojnásobí, je číslo cyklu, od kterého je fluorescence detekována a zvyšuje se, nepřímo úměrné počtu molekul DNA v původním vzorku. Pokud se do reakce zavede několik různých známých koncentrací molekul odpovídajícího fragmentu DNA tuberculosis mycobacterium jako kalibrátor, lze počet genomů DNA ve studovaném materiálu vypočítat pomocí počítačového programu.

Každý standardní vzorek je duplikován. Kvantitativním kritériem je minimální počet PCR cyklů potřebných pro nástup a růst detekovatelné fluorescence. Osa x je počet cyklů; osa ordinát je hodnota fluorescence. Koncentrace DNA jsou nepřímo úměrné počtu cyklů potřebných k objevení fluorescence. Okna v pravém sloupci (21-32) ukazují čísla cyklů pro odpovídající koncentrace. Rozdíly mezi 10násobnými koncentracemi fragmentů DNA 10² ^-10⁶ml jsou 3,2-3,4 cyklů. U dvou pacientů byly koncentrace fragmentů IS6110 přibližně 10³ ^/ ml a 10⁴ ^/ ml. S přihlédnutím k počtu opakování (6-20) analyzovaných fragmentů v genomu Mycobacterium tuberculosis je počet Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorcích přibližně 100, respektive 1000 buněk.

Aplikace PCR v diagnostice tuberkulózy

Metoda PCR se v největší míře využívá k rychlé diagnostice tuberkulózy - detekci Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorcích: sputum, bronchiální výplachy, pleurální exsudát, moč, mozkomíšní mok, punkce osteolýzy, aspiráty ženského genitálního traktu a různé biopsie. Ve studii provedené v Holandsku na přibližně 500 vzorcích sputa a bronchiálních výplachů od 340 pacientek s potvrzenou diagnózou plicní tuberkulózy byla studována komparativní citlivost metod PCR, kultivační a stěrové mikroskopie. Citlivost analýzy byla 92,6 %, 88,9 % a 52,4 %. Specifičnost všech metod byla přibližně 99 %.

Byla provedena srovnání účinnosti detekce Mycobacterium tuberculosis pomocí mikroskopie stěru, výsevu na médium Lowenstein-Jensen, testovacího systému VASTES a PCR analýzy. PCR prokázala senzitivitu 74,4 %, mikroskopie 33,8 %, výsev na pevné médium 48,9 % a VASTES 55,8 %. Průměrná doba detekce při výsevu na médium Lowenstein-Jensen je 24 dní, VASTES 13 dní, PCR 1 den.

Diskutuje se také potenciál využití PCR jako citlivé a rychlé metody pro sledování účinnosti léčby tuberkulózy.

Detekce DNA Mycobacterium tuberculosis metodou PCR s účinnou chemoterapií je stanovena po delší dobu - v průměru 1,7 měsíce ve srovnání s bakteriálním vylučováním stanoveným fluorescenční mikroskopií a 2,5 měsíce ve srovnání s bakteriologickým vyšetřením.

Diagnostika extrapulmonálních forem tuberkulózy

Význam PCR jako citlivé metody je obzvláště velký u extrapulmonálních forem, protože právě u těchto forem jsou klinické a radiologické metody a tradiční bakteriologické metody pro stanovení Mycobacterium tuberculosis v diagnostických materiálech neúčinné.

Při vyšetření vzorků moči byly výsledky PCR analýzy pozitivní u 16 ze 17 pacientů s aktivní tuberkulózou močového systému a negativní u 4 pacientů s inaktivní tuberkulózou ledvin a 39 pacientů s netuberkulózními onemocněními močového systému.

Byla prokázána účinnost PCR analýzy při studiu aspirátů kostní dřeně u pacientů s horečkou neznámého původu s podezřením na tuberkulózní povahu onemocnění. Pro diagnostiku tuberkulózní lymfadenitidy u dětí bylo studováno 102 punkčních aspirátů a bioptických vzorků od 67 dětí s podezřením na tuberkulózní lymfadenitidu. Pozitivní výsledky byly získány: pomocí PCR v reálném čase - 71,6 %, fluorescenční mikroskopie - 46,3 %, kultivační studie - 41,8 %. Ve studii 50 biopsií lymfatických uzlin u pacientů s onemocněním kočičího škrábnutí byly všechny výsledky negativní. Byla tedy prokázána 100% specificita PCR analýzy. Ve stejné práci byla prokázána možnost detekce M. avium při punkční biopsii lymfatických uzlin.

Diagnostika tuberkulózy ženských pohlavních orgánů u neplodnosti je jedním z nejobtížnějších diagnostických problémů. Pozitivní výsledky byly získány PCR studiemi biopsií endometria, aspirátů endometria a tekutiny z Douglasova váčku u 14 (56 %) z 25 pacientek vyšetřených laparoskopicky s podezřením na tuberkulózu. Mikroskopické stěry a kultivační vyšetření přinesly 1, respektive 2 pozitivní výsledky. Tyto případy byly také PCR pozitivní. Většina PCR pozitivních výsledků byla v případech s charakteristickými rysy tuberkulózy dle histologického vyšetření; menší počet byl v případech s podezřením na tuberkulózu dle laparoskopie. Pouze jeden pozitivní výsledek PCR byl získán při absenci laparoskopických údajů o tuberkulóze.

Při diagnostice extrapulmonálních forem tuberkulózy mají kliničtí lékaři často otázku ohledně možnosti identifikace patogena při vyšetření vzorků krve metodou PCR. Literární údaje naznačují, že detekce DNA Mycobacterium tuberculosis z krevních vzorků je možná u pokročilých forem HIV infekce. DNA Mycobacterium tuberculosis byla detekována pouze u generalizované tuberkulózy různých orgánů u pacientů s transplantovanou ledvinou a imunosupresí.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Druhová identifikace mykobakterií

Metoda PCR může být poměrně účinná pro rychlou identifikaci mykobakterií tuberkulózního komplexu a některých typů netuberkulózních mykobakterií po dosažení jejich primárního růstu. V tomto případě může použití PCR ušetřit 7–10 dní potřebných pro následnou kultivační identifikaci pozitivního výsledku. PCR studie je technicky velmi jednoduchá, protože nevyžaduje složitou přípravu vzorku klinického materiálu pro dosažení vysoké citlivosti. Při zkoumání 80 pozitivních kultur v takovém testovacím systému (MB BacT. od Organonu) byly všechny pozitivní výsledky PCR analýzy striktně specifické a byly provedeny do 1 dne. Pro identifikaci dalších typů mykobakterií, pokud jsou získány v kultuře, se DNA patogena hybridizuje se specifickými DNA sondami značenými akridinem a kmeny se detekují podle výskytu chemiluminiscence pomocí chemiluminometru nebo na nitrocelulózových proužcích s vizuálním hodnocením po hybridizaci. Tato sada identifikuje omezený počet druhů: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii a M. gordonae.

A. Telenti a kol. také vyvinuli relativně jednoduchou a levnou metodu pro druhovou identifikaci klinicky významných mykobakterií založenou na PCR a následném ošetření dvěma restrikčními enzymy (enzymy, které mají schopnost štěpit molekulu DNA ve specifických bodech). V tomto případě se amplifikuje fragment DNA kódující protein tepelného šoku (65 kDa), načež se fragment DNA získaný v PCR o velikosti 439 párů nukleotidů ošetří samostatně dvěma enzymy - Bste II a Nae III. Poté se pomocí elektroforézy na agarózovém gelu analyzují oba získané produkty, přičemž se stanoví jejich velikost (počet párů nukleotidů) pomocí sady standardních fragmentů DNA (molekulárních markerů DNA) o délce od 100 do 1000 párů nukleotidů. V každém z definovaných druhů (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) se pro každý restrikční enzym nacházejí 2 nebo 3 fragmenty DNA různých velikostí. Kombinace výsledných fragmentů DNA různých velikostí umožňuje tyto druhy od sebe navzájem odlišit.

Vyvíjí se technologie pro biologické DNA mikročipy, která pomůže identifikovat více než 100 druhů mykobakterií v jediné studii.

Identifikaci druhů lze provést také pomocí PCR amplifikace variabilní oblasti 16S rRNA s následným sekvenováním amplikonů ve srovnání s odpovídající primární strukturou, což umožňuje identifikaci více než 40 druhů mykobakterií.

PCR lze také použít k identifikaci druhů v komplexu tuberculosis mycobacterium, včetně diferenciace mezi M. bovis a M. bovis BCG. To se provádí analýzou přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých genů v genomových oblastech RD1, RD9 a RD10. RD1 chybí u M. bovis BCG, ale je přítomen u virulentních druhů, včetně M. bovis.

Stanovení lékové citlivosti Mycobacterium tuberculosis pomocí PCR

Úkoly molekulárně genetických metod pro stanovení citlivosti nebo rezistence Mycobacterium tuberculosis na léky se redukují na identifikaci mutací v určitých nukleotidových sekvencích známých genů. Hlavní metody jsou založeny buď na přímém čtení (sekvenování) těchto sekvencí po amplifikaci, nebo na hybridizaci biotinem značených fragmentů DNA amplifikovaných během PCR s DNA sondami. Obě možnosti zahrnují identifikaci substitucí v nukleotidových sekvencích, které při použití DNA sond vedou k absenci nebo neúplné hybridizaci na nitrocelulózové membráně za použití enzymového konjugátu (streptavidin-alkalická fosfatáza) - metoda LIPA-Rif-TB.

Metoda měření fluorescence v lokálně fixovaných DNA sondách na mikrooblastech komplementárních ke známým mutacím v PCR amplifikovaných genových oblastech zodpovědných za citlivost nebo rezistenci na léky se nazývá metoda mikrobiočipů. Základní algoritmus pro provedení této studie je následující. Po izolaci DNA z klinického vzorku nebo mykobakteriální kultury je nutné provést PCR k amplifikaci odpovídajících fragmentů genu groB zodpovědného za citlivost na rifampicin nebo genů katG a inhA kódujících mykobakteriální proteiny zodpovědné za citlivost na isoniazid. Výsledky PCR se vyhodnocují pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, která potvrzuje příjem odpovídajících fragmentů DNA požadované délky. Poté se provede druhé kolo PCR k zavedení fluorescenční značky do DNA. Výsledky PCR se opět potvrdí gelovou elektroforézou. Poté se provede hybridizace (inkubace přes noc) s následným promytím získaného materiálu na biočipu, což je velké množství krátkých řetězců DNA (sond) fixovaných na malé skleněné destičce, komplementárních k nukleotidovým sekvencím lékově citlivého typu tuberkulózních mykobakterií v místech možných mutací, stejně jako k mutantním sekvencím zodpovědným za lékovou rezistenci. Umístění DNA sond na destičce je striktně definováno a je stanovena úroveň fluorescence pozorovaná během hybridizace pro stanovení výsledku pomocí speciálního čtecího zařízení. V tomto ohledu se výsledky analýzy stanoví pomocí speciálního počítačového programu.

V posledních letech byly vyvinuty alternativní metody pro stanovení citlivosti Mycobacterium tuberculosis na léky založené na technologii PCR v reálném čase, což umožňuje provádět tyto studie v režimu uzavřené zkumavky.

Obrázek 13-13 ukazuje výsledek analýzy klinických kultur Mycobacterium tuberculosis při stanovení rezistence na rifampicin pomocí real-time PCR: 218 - kontrolní vzorek (citlivý na rifampicin); 93 - pozitivní kontrola pro mutaci Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivní kontrola pro mutaci Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentální vzorky. Výsledek výpočtu kinetických křivek amplifikace pro 4 kanály: kanál 1: 393 - pozitivní kontrola pro mutaci Ser-Trp TCG-TGG; kanál 2: 4482 - pozitivní kontrola pro mutaci Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentální vzorky; kanál 4: kinetické křivky amplifikace všech vzorků zapojených do experimentu. Pozitivní kontrola amplifikační reakce. Závěry: Analýza odhalila následující mutace, které určují rezistenci na rifampicin: ve vzorcích 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Stejný princip byl použit pro stanovení rezistence na isoniazid geny katG a inhA, které určují nejčastější mutace.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identifikace kmene Mycobacterium tuberculosis

Nejvíce studovanou metodou identifikace kmenů Mycobacterium tuberculosis je technologie zvaná polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP), která je založena na fragmentaci (restrikci) DNA Mycobacterium tuberculosis enzymem Pvu II a následné hybridizaci získaných fragmentů s určitými specifickými sekvencemi na DNA jejího repetitivního prvku IS6110. Vnitrodruhová variabilita je realizována díky různému počtu repetic IS6110 a jejich umístění na DNA, stejně jako rozmanitosti vzdáleností mezi určitými body útoku restrikčního enzymu (restrikčními místy) a prvkem IS6110. Tato technologie je velmi složitá a pracná. Po ošetření DNA izolované z kultury mykobakterií tuberculosis restrikčním enzymem se provede gelová elektroforéza, poté se fragmenty DNA různých délek přenesou na nitrocelulózovou membránu, hybridizují se s fragmenty prvku IS6110 a výsledky se detekují pomocí enzymatické reakce. Výsledný specifický pásový vzor charakterizuje DNA specifického kmene mykobakterií tuberculosis. Počítačová analýza odhalí identitu nebo příbuznost kmenů. Přestože je metoda RFLP nejvíce diskriminační, tj. odhaluje největší počet rozdílů v analyzovaných kmenech, je neúčinná s malým počtem (méně než 5) opakování IS6110, pozorovaným u některých kmenů. Obrázky 13-14 ukazují výsledky RFLP typizace kmenů.

Alternativou může být metoda spoligotypizace - analýza polymorfismu mezilehlých sekvencí DNA - mezilehlých mezi přímými repeticemi oblasti DR. Při provádění spoligotypizace kmenů se provádí PCR s primery omezujícími oblast DR, po čemž se tvoří fragmenty různých délek, které hybridizují s variabilními mezilehlými oblastmi DNA. Analýza mezilehlých sekvencí oblasti DR se podle výzkumníků jeví jako jednodušší, produktivnější a vhodnější pro primární screening kmenů a předběžnou epidemiologickou analýzu, stejně jako pro přímé studium klinického materiálu.

Efektivnější a technologicky dostupnější metodou je samozřejmě VNTR (zkratka anglických slov), neboli metoda stanovení variabilního počtu přesných tandemových repetic v DNA Mycobacterium tuberculosis. Tato metoda je založena pouze na použití PCR a nevyžaduje žádné další manipulace. Vzhledem k tomu, že počet tandemových repetic v různých kmenech a v různých lokusech je odlišný, jsou na výsledném elektroforegramu PCR produktů stanoveny a analyzovány fragmenty různých velikostí. Podle výzkumníků je s pomocí VNTR dosaženo většího stupně rozlišení kmenů než metodou RFLP.

V posledních letech je věnována velká pozornost šíření kmenů Mycobacterium tuberculosis z čeledi W-Beijing (někdy nazývaných pekingský kmen), které jsou do značné míry rezistentní vůči lékům.

Základní požadavky na kvalitu molekulárně biologického výzkumu

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Hlavní regulační dokumenty pro provádění PCR

Vyhlášky Ministerstva zdravotnictví Ruské federace: č. 45 ze dne 7. 2. 2000; č. 109 ze dne 21. 3. 2003; č. 64 ze dne 21. 2. 2000. Pokyny: 1.3.1888-04 „Organizace práce při PCR výzkumu materiálu infikovaného patogenními biologickými agens skupin patogenity III-IV“; 1.3.1794-03 „Organizace práce při PCR výzkumu materiálu infikovaného mikroorganismy skupin patogenity I-II“. 2003; 3.5.5.1034-01 „Dezinfekce testovaného materiálu infikovaného bakteriemi skupin patogenity I-IV při práci metodou PCR“, 2001. Dodatek 11 k Pokynům o jednotných metodách mikrobiologického výzkumu při detekci, diagnostice a léčbě tuberkulózy.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personál

Molekulárně biologické studie mohou provádět lékaři klinické laboratorní diagnostiky, bakteriologové, virologové, biologové klinické diagnostické laboratoře a také specialisté se středním lékařským vzděláním, kteří absolvovali specializaci a další vzdělávání stanoveným způsobem.

Uspořádání laboratorních prostor

Je vyžadováno následující laboratorní vybavení:

• Prostor pro zpracování vzorků - laboratoř uzpůsobená pro práci s infekčními agens skupin patogenity III-IV, v souladu s Metodickými pokyny 13.1888-04.
• Prostor pro přípravu PCR reakčních směsí je laboratorní místnost, která poskytuje ochranu před vnitřní kontaminací laboratoře – „čistá“ oblast.
• • Pokud se k analýze PCR produktů používá elektroforéza nebo hybridizace, musí být laboratorní místnost, ve které jsou amplifikované fragmenty DNA extrahovány z amplifikační zkumavky a mohou se tedy dostat do okolního prostředí, v souladu s požadavky pro PCR laboratoře (Metodické pokyny 1.3.1794-03, Metodické pokyny 1.3.1888-04), zcela izolována od místností uvedených v předchozích odstavcích. Pohyb jakéhokoli personálu, vybavení, materiálů a předmětů z prostoru elektroforézy do prostoru pro zpracování vzorků a „čistého“ prostoru, jakož i přenos vzduchu ventilačním systémem nebo v důsledku průvanu, musí být vyloučen. Tato oblast není vyžadována pro fluorimetrickou detekci PCR produktů.
• Místnost pro dokumentaci a zpracování výsledků je vybavena počítači a potřebným kancelářským vybavením. Tato místnost může obsahovat zařízení, které zajišťuje detekci PCR produktů bez otevření zkumavky. - fluorescenční PCR detektory a termocyklery pro real-time PCR.

Hygienické a epidemiologické požadavky na primární zpracování sputa jsou podobné standardním mikrobiologickým požadavkům pro práci s Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Kompletní sada laboratorního vybavení pro PCR diagnostiku

Laboratorní sada obsahuje vybavení pro následující místnosti.

• místnost pro přípravu vzorků, obsahuje následující vybavení: laminární digestoř třídy ochrany II "SP-1.2": polovodičový termostat s vyhřívaným víkem pro zkumavky Eppendorf; mikrocentrifuga při 13 000 ot./min; centrifuga ("Vortex"); chladnička s teplotním rozsahem od -20 ^° C do +10 ^° C; pipety s proměnným objemem řady "Proline"; čerpadlo s odlučovací baňkou OM-1; stojan na pipety; stojan na pracovní stanici 200x0,5 ml; stojan na pracovní stanici 50x1,5 ml; stojany pro uložení zkumavek 80x1,5 ml;
• místnost pro přípravu reakční směsi: ochranná komora PCR box („Laminar-C. 110 cm); centrifuga „Vortex“; pipety s proměnným objemem řady „Proline“; stojan na pipety; stojan na pracovní stanici 200x0,2 ml; stojany pro uložení zkumavek 80x1,5 ml; chladnička s teplotním rozsahem od -20 ^° C do +10 ^° C;
• Elektroforetická místnost: horizontální elektroforetická komora; zdroj energie; transiluminátor;
• Zesilovač DNA nebo analyzátor nukleových kyselin (real-time PCR) s počítačem a softwarem; lze umístit do jakékoli dostupné místnosti. Pokud se používá technologie real-time PCR, není elektroforézní místnost potřeba.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Externí kontrola kvality

Aby laboratoře dosáhly objektivně spolehlivých výsledků, musí se účastnit systému externího hodnocení kvality laboratorního výzkumu.

Účastníci systému kontroly kvality obdrží: 12 ampulí s lyofilizovanými suspenzemi bakteriálních buněk, z nichž dvě obsahují E. coli, 3 ampule s mykobakteriemi tuberkulózy (avirulentní kmen) v koncentraci 10² ^/ ml; 3 ampule s buňkami podobného kmene v koncentraci 10² ^/ ml; 2 ampule s netuberkulózními mykobakteriemi M. avium-intracellulare a M. kansasii v koncentraci 10³ ^/ ml.

Testy zaslané k externímu hodnocení kvality jsou předběžně testovány ve dvou nezávislých laboratořích s rozsáhlými zkušenostmi v této oblasti.

[ 85 ], [ 86 ]