Imunofenotypizace hemoblastóz

Významný pokrok v hematologickém výzkumu v posledních letech je spojen s využitím moderních imunologických metod a automatizovaných prostředků pro analýzu a třídění buněk periferní krve a kostní dřeně - průtokových cytometrů. Tradiční morfologické a cytochemické studie buněk substrátu onemocnění (krev, červená kostní dřeň, lymfatické uzliny, slezina atd.) v mnoha případech, zejména u lymfoproliferativních onemocnění, neumožňují identifikovat celou škálu variant mezi morfologicky podobnými formami a stanovit zdroj původu patologického klonu. Tyto problémy lze vyřešit pouze studiem imunologických charakteristik buněk. Každé fázi diferenciace hematopoetických buněk odpovídá vlastní sada antigenů, které se podle mezinárodní klasifikace nazývají diferenciační a dělí se do diferenciačních shluků, označovaných CD.

U neoplastických změn může v jakékoli fázi normálního buněčného vývoje dojít k blokádě diferenciace, která vede k vytvoření klonu patologických buněk, které určují substrát onemocnění a mají stejné imunologické (nebo fenotypové) vlastnosti. Studiem těchto markerů na buňkách je možné určit, jaké formě a variantě onemocnění odpovídají, tj. na základě imunologického fenotypu buněk provést diferenciální diagnostiku, která je nejobtížnější u lymfoproliferativních onemocnění, protože hlavní buňkou patologického substrátu onemocnění jsou morfologicky téměř identické buňky.

Fenotypizace umožňuje použití monoklonálních protilátek k určení typu blastových a zralých krevních buněk myelo-, mono- a lymfocytární řady na základě přítomnosti diferenciačních antigenů (receptorů) v buněčné stěně. Sekce „Hodnocení imunitního stavu organismu“ částečně popisuje charakteristiky a diagnostickou hodnotu studia buněčných markerů; níže je uveden stručný popis antigenních markerů buněk ve vztahu k diagnostice hemoblastóz. Následující antigeny (markery) lze detekovat na membránách krevních buněk a červené kostní dřeně.

• CD2 je monomerní transmembránový glykoprotein. Je přítomen na povrchu všech T-lymfocytů cirkulujících v krvi a na některých NK-lymfocytech. CD2 se podílí na procesu alternativní aktivace T-lymfocytů. Detekce CD2 pomocí monoklonálních protilátek se v klinické praxi používá pro fenotypizaci akutní T-buněčné leukémie, lymfomů, chronických zánětlivých a imunodeficientních stavů.
• CD3 je proteinový komplex asociovaný s antigenně specifickým T-buněčným receptorem, je hlavním funkčním markerem T-lymfocytů. Usnadňuje přenos aktivačního signálu z membrány do buněčné cytoplazmy. Stanovení CD3 je indikováno pro diagnostiku akutní T-buněčné leukémie, lymfomů (CD3 není exprimován v ne-T-buněčných lymfoidních neoplaziích) a imunodeficienčních onemocnění.
• CD4 je transmembránový glykoprotein exprimovaný subpopulací T-helperů (induktorů), které tvoří 45 % lymfocytů periferní krve. V raných stádiích vývoje lymfocytů v brzlíku jsou antigeny CD4, stejně jako CD8, exprimovány všemi kortikálními lymfocyty. Medulární thymocyty, jejichž fenotyp je podobný zralým CD4+ T-buňkám periferní krve (T-helperům), již exprimují buď receptory CD4, nebo CD8. V periferní krvi nese až 5 % buněk markery CD4 i CD8. Menší exprese CD4 je možná na některých buňkách monocytární řady. CD4 je exprimován ve většině případů T-buněčných lymfomů, včetně mycosis fungoides, a také u T-buněčné leukémie asociované s HTLV (HTLV - lidský T-lymfotropní virus).
• CD5 je jednořetězcový glykoprotein přítomný na všech zralých T lymfocytech a většině thymocytů a je slabě exprimován B lymfocyty. CD5 je detekován na neoplastických buňkách B-buněčné chronické lymfocytární leukémie a centrocytárního lymfomu. U jiných typů maligních lymfoidních onemocnění – folikulárního lymfomu, vlasatobuněčné leukémie, velkobuněčného lymfomu – se CD5 neexprimuje.
• CD7 je jednořetězcový protein, nejranější marker diferenciace T-buněk. Je exprimován pro-T-lymfocyty ještě před jejich migrací do brzlíku. CD7 je detekován na většině NK buněk, slabá exprese je zaznamenána na monocytech. B-lymfocyty a granulocyty tento antigen neobsahují. Stanovení CD7 se používá k diagnostice lymfomů, dětské T-buněčné lymfoblastické leukémie.
• CD8 je protein sestávající ze dvou polypeptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Je exprimován subpopulací cytotoxických a supresorových T lymfocytů, které tvoří 20–35 % lymfocytů periferní krve. Tento antigen je také exprimován NK lymfocyty, kortikálními thymocyty, 30 % medulárních thymocytů a subpopulací buněk červené kostní dřeně. CD8 je studován za účelem kvantifikace obsahu T supresorových buněk (viz výše uvedená část „Supresorové T lymfocyty v krvi“).

• CD10 je endopeptidáza asociovaná s buněčnou membránou. CD10 je exprimován mladými formami B lymfocytů a subpopulací kortikálních lymfocytů. CD10 je exprimován všemi ALL buňkami.
• CD11c je exprimován na buněčné membráně makrofágy, monocyty, granulocyty, NK buňkami a buňkami vlasatobuněčné leukémie.
• CD13 je glykoprotein exprimovaný buňkami myelomonocytární linie (progenitorové buňky, neutrofily, bazofily, eosinofily, monocyty a buňky myeloidní leukémie). Není přítomen v T a B lymfocytech, erytrocytech a krevních destičkách.
• CD14 je povrchový membránový glykoprotein. Je exprimován hlavně monocyty a makrofágy. CD14 je detekován na více než 95 % monocytů v periferní krvi a kostní dřeni. Silná exprese CD14 je pozorována u akutní myeloblastické leukémie. Tento antigen není exprimován u akutní a chronické lymfoblastické leukémie.
• CD15 je oligosacharid. Podílí se na fagocytóze a chemotaxi. Tento antigen je přítomen na povrchu zralých granulocytů a Berezovského-Sternbergových buněk. Exprese antigenu CD15 je detekována u Hodgkinovy choroby. U non-Hodgkinových lymfomů není CD15 ve většině případů detekován.
• CD16 je exprimován na povrchu granulocytů, monocytů, makrofágů a NK buněk. Všechny lymfocyty exprimující tento antigen mají schopnost buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách. CD16 se stanovuje během typizace chronických myelocytárních leukémií za účelem charakterizace NK buněk.
• CD19 je glykoprotein přítomný na všech periferních B lymfocytech a všech prekurzorech B-buněk. V plazmatických buňkách chybí. Je nejčasnějším markerem B-buněk a hraje důležitou roli v regulaci aktivace a proliferace B-buněk. CD19 je exprimován na všech neoplastických buňkách akutní leukémie B-buněčného původu a je také přítomen v některých formách akutní monoblastické leukémie.
• CD20 je neglykosylovaný protein. V ontogenezi B-lymfocytů se antigen CD20 objevuje po CD19 ve fázi pre-B-buněčné diferenciace lymfocytů. Chybí v plazmatické membráně plazmatických buněk. Je exprimován u ALL, chronické lymfocytární leukémie B-buněk, vlasatobuněčné leukémie, Burkittova lymfomu a velmi vzácně u akutní monoblastické leukémie.
• CD21 je glykoprotein přítomný ve významném množství na B-lymfocytech v lymfoidních orgánech a v malém množství na B-buňkách v periferní krvi. CD21 je receptor pro virus Epstein-Barrové.
• CD22 je protein sestávající ze dvou polypeptidových řetězců. Je exprimován na membráně většiny B lymfocytů, včetně prekurzorových buněk (prolymfocytů). Antigen není po aktivaci na B lymfocytech (plazmatických buňkách) exprimován. Nejvýraznější exprese CD22 je detekována na buňkách vlasatobuněčné leukémie, slabá - u myeloidní leukémie a non-T-buněčné ALL.
• CD23 je glykoprotein exprimovaný v mnohem vyšší míře aktivovanými periferními krevními B lymfocyty. CD23 zprostředkovává IgE-dependentní cytotoxicitu a fagocytózu makrofágy a eosinofily.
• CD25 je jednořetězcový glykoprotein identifikovaný jako nízkoafinitní receptor pro IL-2. Tento receptor je exprimován na aktivovaných T lymfocytech a v menší hustotě na aktivovaných B buňkách. V periferní krvi zdravých jedinců je antigen přítomen na více než 5 % lymfoidních buněk.
• CD29 je fibronektinový receptor. Je široce distribuován v tkáních a je exprimován leukocyty. Detekce CD29 na periferních krevních buňkách se používá k typizaci subpopulace T buněk s fenotypem CD4+CD29+, které se nazývají pomocné buňky typu 2 (Th2). Tyto buňky se podílejí na humorální imunitní odpovědi produkcí lymfokinů.
• CD33 je transmembránový glykoprotein. Je přítomen na povrchu buněk myeloidní a monocytární řady. Nachází se na povrchu monocytů a v menší míře granulocytů v periferní krvi. Přibližně 30 % buněk červené kostní dřeně exprimuje CD33, včetně myeloblastů, promyelocytů a myelocytů. Antigen chybí v membránách pluripotentních kmenových buněk. Stanovení CD33 se používá k charakterizaci buněk u leukémií myeloidního původu. Leukemické buňky lymfoidního a erytroidního původu CD33 neexprimují.
• CD34 je fosfoglykoprotein exprimovaný hematopoetickými progenitorovými buňkami, včetně monopotentních kmenových buněk. Nejvýraznější exprese Ag je pozorována u časných progenitorových buněk; s dozráváním buněk exprese markerů klesá. CD34 se nachází také na endotelových buňkách. Stanovení CD34 se používá k charakterizaci buněk u akutních myeloblastických a lymfoblastických leukémií. U chronických lymfocytárních leukémií a lymfomů není exprese antigenu CD34 detekována.

• CD41a je exprimován krevními destičkami a megakaryocyty. Monoklonální protilátky k detekci CD41a se používají k diagnostice megakaryoblastické leukémie. U Glanzmannovy trombastenie exprese tohoto antigenu chybí nebo je významně potlačena.
• CD42b je membránový glykoprotein sestávající ze dvou polypeptidových řetězců. Tento marker je detekován na povrchu krevních destiček a megakaryocytů. V klinické praxi se detekce CD42b používá k diagnostice trombocytopatie - Bernard-Soulierova syndromu.
• CD45RA patří do třídy transmembránových glykoproteinů. Je to běžný leukocytární antigen. Je exprimován na buněčné membráně B lymfocytů, v menší míře T lymfocytů a na zralých medulárních thymocytech. Tento marker není exprimován granulocyty.
• CD45RO je nízkomolekulární izoforma CD45RA, běžného leukocytárního antigenu. Je detekován na T buňkách (paměťových T lymfocytech), subpopulaci B lymfocytů, monocytech a makrofágech. Monoklonální protilátky proti CD45RO interagují s většinou thymocytů, subpopulací klidových CD4+ a CD8+ T lymfocytů a zralými aktivovanými T buňkami. Tento antigen nesou také buňky myelomonocytárního původu, granulocyty a monocyty. Je detekován u centroblastických a imunoblastických lymfomů.
• CD46 je O-glykosylovaný dimer. Je široce distribuován v tkáních a je exprimován T a B lymfocyty, monocyty, granulocyty, NK buňkami, krevními destičkami, endotelovými buňkami a fibroblasty, ale chybí na povrchu červených krvinek. CD46 poskytuje ochranu tkání před komplementem.
• CD61 je krevní antigen. Je exprimován na krevních destičkách periferní krve a červené kostní dřeně, stejně jako na megakaryocytech a megakaryoblastech. Jeho stanovení se používá jako marker u akutní megakaryoblastické leukémie. Exprese antigenu chybí nebo je potlačena u pacientů s Glanzmannovou trombastenií.
• CD95, nazývaný také Fas nebo APO-1, je transmembránový glykoprotein, člen rodiny receptorů tumor nekrotizujícího faktoru. Je exprimován ve významném množství na T lymfocytech (CD4+ a CD8+) v periferní krvi a v menší míře na B lymfocytech a NK buňkách. Tento antigen je také exprimován na granulocytech, monocytech, tkáňových buňkách a neoplastických buňkách. Vazba CD95 na ligand Fas (CD95L) indukuje apoptózu v buňkách.
• CD95L, neboli Fas ligand, je membránový protein patřící do rodiny receptorů tumor nekrotizujícího faktoru. Tento antigen je exprimován cytotoxickými T lymfocyty, NK buňkami a velmi často i nádorovými buňkami; je hlavním induktorem apoptózy v buňkách.
• HLA-DR je monomorfní determinant molekul třídy II lidského hlavního histokompatibilního komplexu (HLA). Marker je exprimován na Langerhansových buňkách, dendritických buňkách lymfoidních orgánů, některých typech makrofágů, B lymfocytech, aktivovaných T buňkách a epiteliálních buňkách brzlíku. Studium tohoto markeru se používá ke kvantitativnímu stanovení aktivovaných T lymfocytů s fenotypem CD3+ HLA-DR+.

Pomocí odlišného výběru monoklonálních protilátek proti markerům je možné vytvořit fenotypový portrét buněk charakteristických pro danou formu leukémie.

Kromě použití imunofenotypizačních metod pro diagnostiku a diferenciální diagnostiku hemoblastóz se ukázalo jako obzvláště důležité jejich využití v léčebném procesu k posouzení stavu remise a zbytkové populace leukemických buněk. Znalost fenotypového „portrétu“ blastových buněk v období diagnózy umožňuje tyto markery detekovat buňky leukemického klonu v období remise a zvýšením jejich počtu předpovědět rozvoj relapsu dlouho před (1-4 měsíce) objevením se jeho klinických a morfologických příznaků.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]