Experimentální modely osteoartrózy

Chrupavka je vysoce specializovaná tkáň obsahující pouze jeden typ buněk (chondrocyty) a charakterizovaná absencí krevních a lymfatických cév. Chrupavka je vyživována převážně absorpcí ze synoviální tekutiny. Metabolismus chondrocytů je regulován řadou rozpustných faktorů produkovaných lokálně chondrocyty a okolními tkáněmi. Funkce chondrocytů závisí také na složení extracelulárního prostředí (tenze kyslíku, koncentrace iontů, pH atd.), složení extracelulárního media (ECM), interakci buněk a matrix a fyzikálních signálech. Hlavním cílem experimentálního modelování je vytvořit kultury v extracelulárním prostředí bez změny fenotypu zralých buněk. Druhým cílem je vytvořit kultury pro studium předčasné, opožděné, krátkodobé nebo prodloužené reakce chondrocytů na chemické a/nebo fyzikální signály. Studie in vitro také poskytují příležitost ke studiu chování chondrocytů při osteoartróze. Třetím cílem je vyvinout systémy kokultivace, které umožňují studium interakcí různých tkání v kloubu. Čtvrtým úkolem je příprava chrupavčitých implantátů pro následnou transplantaci. A konečně, pátým úkolem je studium růstových faktorů, cytokinů nebo terapeutických látek, které jsou schopny stimulovat reparaci a/nebo inhibovat resorpci chrupavky.

V posledních desetiletích byly vytvořeny různé modely buněčných kultur kloubní chrupavky, včetně monovrstvých kultur, suspendovaných kultur, chondronových kultur, explantátů, kokultur a imortálních buněčných kultur. Každá kultura má své výhody a nevýhody a každá je vhodná pro studium jednoho specifického aspektu metabolismu chondrocytů. Explantáty chrupavky jsou tedy vynikajícím modelem pro studium obratu prvků matrice, což vyžaduje skutečné receptory na buněčném povrchu a normální interakce buňka-matrix a matrix-buňka. Zároveň se doporučuje studovat depozita matrice nebo mechanismy regulující metabolismus chondrocytů na kultuře izolovaných buněk. Pro studium procesu buněčné diferenciace je nezbytná monovrstvá kultura s nízkou hustotou. Kultury suspendované v přírodní nebo syntetické matrici jsou modelem pro analýzu adaptivní reakce chondrocytů na mechanické namáhání.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Kultury chondrocytů

Při výběru chrupavčité tkáně pro studie in vitro je třeba vzít v úvahu několik důležitých bodů. Složení matrice a metabolická aktivita chondrocytů se u jednotlivých kloubů liší a ta závisí také na hloubce umístění chondrocytů v tkáni. Tato data byla získána v několika experimentech, ve kterých byly studovány izolované subpopulace chondrocytů z chrupavčitých zón různých hloubek. Mezi kultivovanými chondrocyty umístěnými v povrchových a hlubokých vrstvách kloubní chrupavky byla zjištěna řada morfologických a biochemických rozdílů. Povrchové buňky syntetizují řídkou, na proteoglykany chudou fibrilární matrici, zatímco hlubší buňky produkují matrici bohatou na fibrily a proteoglykany. Povrchové buňky navíc produkují relativně více malých neagregovaných proteoglykanů a kyseliny hyaluronové a relativně méně agrekanů a keratansulfátu než hlubší chondrocyty. Dalším důležitým charakteristickým rysem metabolismu chondrocytů izolovaných z chrupavčitých zón různých hloubek je reakce na exogenní stimul. Podle M. Aydelotte et al. byly bovinní chondrocyty z povrchové zóny chrupavky citlivější na IL-1 než buňky z hluboké zóny.

Chování buněk závisí také na umístění v tkáni. Chondrocyty z chrupavky žeber a ucha stejného zvířete reagují odlišně na růstové faktory, jako je fibroblastový růstový faktor (FGF) a TGF-beta. FGF zvýšil zabudování thymidinu, prolinu a leucinu do kultivovaných žeber, ale nikoli do chondrocytů ucha. TGF-beta zvýšil zabudování thymidinu do chondrocytů chrupavky žeber a ucha, ale neměl žádný vliv na zabudování thymidinu a prolinu do chondrocytů ucha. Chrupavkavé buňky z oblastí s vysokým stresem se liší od buněk z oblastí s nízkým stresem na chrupavku. Chondrocyty zralého ovčího kolenního kloubu z centrální oblasti kloubního povrchu tibie, která není pokryta meniskem, a která nese největší zatížení in vivo, tedy syntetizují méně agrekanu, ale více dekorinu než buňky ze zón pokrytých meniskem. Autoři také zdůrazňují důležitost použití chrupavky z identických kloubních zón při studiu syntetické funkce kloubů.

Metabolismus chondrocytů a jejich reakce na regulační faktory také významně závisí na věku dárce, jeho vývoji kostry a stavu kloubů, ze kterých jsou buňky odebírány. U lidských chondrocytů je pozorován významný pokles proliferativní odpovědi s věkem. Největší pokles je pozorován u dárců ve věku 40-50 let a nad 60 let. Navíc závažnost proliferativní odpovědi na růstové faktory (např. FGF a TGF-beta) se s věkem snižuje. Kromě kvantitativních změn v proliferaci chondrocytů dochází i ke změnám kvalitativním. Buňky od mladých dárců (10-20 let) reagují lépe na destičkový růstový faktor (PDGF) než na TGF-beta, zatímco u buněk od dospělých dárců je pozorován opak. K vysvětlení věkem závislých změn v syntetické funkci chondrocytů a jejich reakce na růstové faktory se používá několik mechanismů. Patří mezi ně snížení počtu a afinity povrchových buněčných receptorů, změny v syntéze a bioaktivitě růstových faktorů a cytokinů a modifikace postreceptorových signálů.

Patologický stav kloubů také mění morfologii a metabolickou aktivitu chondrocytů. J. Kouri a kol. (1996) tak identifikovali tři subpopulace chondrocytů v chrupavce u osteoartrózy. Chondrocyty z povrchové a horní části střední chrupavky tvoří shluky a syntetizují větší množství proteoglykanů a kolagenu. TGF-beta a inzulínu podobný růstový faktor (IGF) jsou schopny stimulovat syntézu proteoglykanů chondrocyty a částečně neutralizovat účinky IL-1 a TNF-a. Explantáty chrupavky postižené osteoartrózou a chondrocyty izolované z chrupavky pacienta s osteoartrózou jsou citlivější na stimulaci TGF-beta než chondrocyty zdravé chrupavky. Tyto rozdíly jsou s největší pravděpodobností spojeny s fenotypovými změnami chondrocytů v horních vrstvách kloubní chrupavky.

Izolace jednotlivých chondrocytů se dosahuje postupným ošetřením extracelulární hmoty (ECM) proteolytickými enzymy. Po uvolnění z ECM jsou izolované buňky ideální pro studium de novo syntézy složek matrixu. Někteří autoři používají pouze klostridiovou kolagenázu, zatímco jiní preinkubují chrupavku s trypsinem, pronazou, DNázou a/nebo hyaluronidázou. Počet izolovaných buněk závisí na použitých enzymech. Při ošetření samotnou kolagenázou lze tedy z 1 g tkáně získat ^{1,4–10⁶ chondrocytů, zatímco při použití pronazy, hyaluronidázy a kolagenázy –4,3–10⁶}. Při ošetření kolagenázou zůstávají agrekan, proteiny, IL-6 a IL-8 v buněčné kultuře ve výrazně větším množství než při postupném ošetření různými enzymy. Pro tyto rozdíly mezi těmito dvěma buněčnými kulturami existuje několik vysvětlení:

• Buněčné receptory jsou poškozeny nebo inhibovány enzymy, TGF-beta inhibuje syntézu DNA a proteoglykanů v čerstvě izolovaných chondrocytech (1. den), zatímco syntéza DNA a proteoglykanů v chondrocytech kultivovaných v monovrstvě (7 dní) je stimulována TGF-beta. Před zahájením experimentu je však zapotřebí dostatečná doba pro reexpresi těchto membránových složek.
• Exogenní proteázy mohou narušit interakci buňky s matrixem zprostředkovanou integriny. Rodina integrinů podporuje připojení chondrocytů k molekulám extracelulární matrixy (Shakibaei M. et al., 1997). Toto narušení může ovlivnit expresi genů matrixu.
• Zbytky složek matrixu mohou regulovat syntetickou funkci chondrocytů. Integriny jsou schopny rozpoznávat produkty degradace extracelulární hmoty (ECM), a hrají tak důležitou roli v reparaci tkání po působení proteolytických enzymů. T. Larsson a kol. (1989) uvádějí, že přidání intaktních nebo fragmentovaných proteoglykanů do buněčné kultury stimuluje syntézu proteinů a proteoglykanů. Vysoká hladina kyseliny hyaluronové však způsobuje významný pokles zapojení sulfátů do syntézy proteoglykanů chondrocyty kuřecího embrya, zralými chondrocyty prasete a buňkami chondrosarkomu potkanů. Kyselina hyaluronová je navíc inhibitorem uvolňování proteoglykanů z buněk i za přítomnosti IL-1b, TNF-a, FGF, což naznačuje působení proti první biologické aktivitě růstových faktorů a cytokinů. Přesný mechanismus účinku kyseliny hyaluronové zůstává nejasný; je známo, že chondrocyty obsahují receptor pro kyselinu hyaluronovou asociovaný s aktinovými filamenty cytosolu. Vazba kyseliny hyaluronové na její receptor stimuluje fosforylaci proteinů. Tato data tedy demonstrují modulaci metabolické funkce chondrocytů fragmentovanými nebo nativními molekulami proteinů matrixu prostřednictvím aktivace receptorů buněčné membrány.
• Rychlá stimulace syntézy proteinů matrixu chondrocyty pomocí enzymů může být důsledkem změn tvaru chondrocytů a/nebo reorganizace cytoskeletu.
• Některé cytokiny (např. IL-8) a růstové faktory (např. IGF-1, TGF-β) jsou sekvestrovány v extracelulární matrici (ECM). Nejznámějším příkladem je vazba TGF-β dekorinem, což má za následek sníženou schopnost dekorinu indukovat růst buněk ve vaječníkových buňkách čínského křečka. Zjištění, že obsah dekorinu v chrupavce se zvyšuje s věkem, naznačuje pokles biologické dostupnosti TGF-β se stárnutím. Růstové faktory a cytokiny se mohou uvolňovat z úlomků matrixu během kultivace a následně modulovat funkci chondrocytů.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Monovrstvá kultura chondrocytů

Diferencovaný fenotyp chondrocytů je primárně charakterizován syntézou kolagenu typu II a tkáňově specifických proteoglykanů, jakož i nízkou úrovní mitotické aktivity. Existují důkazy, že při prodloužené kultivaci buněk v monovrstvě, stejně jako po několika opakovaných pasážích buněk, chondrocyty ztrácejí své kulovité obrysy a získávají protáhlý tvar podobný fibroblastům. Při takové fibroblastické metaplazii je také modifikována syntetická funkce buněk, charakterizovaná progresivním poklesem syntézy kolagenů typu II, IX a XI a zvýšením syntézy kolagenů typu I, III a Y. Díky funkčnímu agrekanu jsou syntetizovány malé neagregované proteoglykany. Syntéza katepsinu B a L je v diferencovaných buňkách extrémně nízká, ale zvyšuje se v procesu ztráty diferenciace. Kolagenáza-1 je exprimována v diferencovaných chondrocytech; při prodloužené kultivaci její exprese klesá, zatímco produkce tkáňových inhibitorů metaloproteináz (TIMP) se zvyšuje.

Diferencované chondrocyty reexprimují kolagen diferencovaného fenotypu, když jsou přeneseny z monovrstvy do suspenzní kultury. Proces diferenciace pravděpodobně souvisí s tvarem buněk. Tuto vlastnost pravidelně využívají vědci studující defektní štěpy s autologními chondrocyty. Malý počet buněk získaných z bioptického materiálu může být expandován v monovrstvé kultuře a poté znovu zaveden do trojrozměrné matrice před transplantací. Reexpresi specifického fenotypu dediferencovanými chondrocyty přenesenými do agarózové kultury lze stimulovat TGF-β, komplexem ossein-hydroxyapatitu a kyselinou askorbovou.

V reakci na růstové faktory a cytokiny se chondrocyty během procesu diferenciace modifikují. Buněčná odpověď na cytokiny a růstové faktory se liší u nediferencovaných a diferencovaných chondrocytů. IL-1 stimuluje proliferaci fibroblastů, zatímco růst nediferencovaných chondrocytů je inhibován IL-1. Syntéza DNA je stimulována IGF-1 v protáhlých, ale ne zploštělých chondrocytech. V diferencovaných chondrocytech jsou stimulační účinky IL-1beta a TNF-a na produkci prokolagenázy výraznější než v nediferencovaných chondrocytech.

Kultivace chondrocytů

Kultivace chondrocytů v suspenzi v kapalném médiu nebo v přírodní či syntetické trojrozměrné matrici stabilizuje fenotyp chondrocytů. Buňky si zachovávají svůj kulovitý tvar a syntetizují tkáňově specifické proteiny. Suspendovaná kultura chondrocytů se obvykle doporučuje pro studium tvorby nové pericelulární matrix. Kultury chondrocytů v syntetických nebo přírodních absorpčních polymerech se používají k implantaci buněk do defektů chrupavky za účelem stimulace regenerace kloubní chrupavčité tkáně. Syntetické nebo přírodní médium pro implantované buňky musí splňovat řadu požadavků:

• implantáty musí mít porézní strukturu pro adhezi a růst buněk,
• ani samotný polymer, ani jeho degradační produkty by při implantaci in vivo neměly způsobovat zánět ani toxické reakce,
• nosič štěpu musí mít schopnost vázat se na sousední chrupavku nebo subchondrální kost,
• přírodní nebo syntetická matrice musí mít schopnost absorpce, její odbourávání musí být vyváženo regenerací tkání,
• Aby se usnadnila oprava chrupavky, musí chemická struktura a architektura pórů matrice usnadňovat udržování buněčného fenotypu a syntézu tkáňově specifických proteinů chondrocyty, které se v ní nacházejí,
• Během implantace in vivo je nutné studovat mechanické vlastnosti syntetické nebo přírodní matrice.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Suspenze chondrocytů v kapalné fázi

Přichycení buněk k plastovým nádobám, ve kterých se chondrocyty kultivují, lze zabránit potažením jejich stěn roztokem methylcelulózy, agarózy, hydrogelu (poly-2-hydroxyethylmethakrylát) nebo směsí kolagenu a agarózy. Za těchto podmínek chondrocyty tvoří shluky a syntetizují převážně agrekany a tkáňově specifické kolageny (typy II, IX, XI). Obvykle se vyskytují dva typy buněk. Buňky umístěné ve středu si zachovávají kulovitý tvar a jsou obklopeny dobře vyvinutou extracelulární matricí (ECM), což potvrzují histochemické a ultrastrukturální studie. Na periferii mají chondrocyty diskovité obrysy a jsou obklopeny řídkou extracelulární matricí; o funkčních charakteristikách těchto buněk je známo jen málo.

Chondrocyty je možné kultivovat na mikronosičích udržovaných v suspenzi; jako mikronosiče se používají dextranové kuličky (cytodex), kolagenem potažené dextranové kuličky (cytodex III) a neporézní mikrosféry kolagenu typu I (cellagen). Za těchto kultivačních podmínek se chondrocyty přichytí k povrchu mikronosiče, zachovají si svůj kulovitý tvar a vytvoří materiál podobný matrici. Použití cellagenu navíc podporuje proliferaci chondrocytů a reexpresi normálního fenotypu. Kultivace chondrocytů na mikrosférách cellagenu proto může být použita k obnovení buněčného fenotypu před transplantací.

Další metodou kultivace suspenze chondrocytů v kapalném médiu je jejich kultivace ve formě hustých kuliček sestávajících z buněk (0,5-1 * 10⁻⁶ ^b ), získaných centrifugací. Takové chondrocyty jsou schopny produkovat matrici obsahující velké množství proteoglykanů, kolagen typu II, ale nikoli kolagen typu I, což je potvrzeno histologickými, imunohistochemickými a kvantitativními metodami.

Suspenze chondrocytů v přirozeném ECM

Chondrocyty lze kultivovat v suspenzi v trojrozměrné matrici (měkký agar, agaróza, kolagenový gel nebo houba, kyselina hyaluronová, fibrinové lepidlo, alginátové kuličky).

Chondrocyty kultivované v agaróze si zachovávají svůj normální fenotyp a syntetizují kolagen typu II a tkáňově specifické agregáty agrekanů. Při kultivaci v agaróze se proteoglykany syntetizované buňkou uvolňují do média po dobu 50 dnů. Pro srovnání, v monovrstvé kultuře je buněčná fáze přeplněna glykosaminoglykany již v prvních 5-6 dnech kultivace; při kultivaci v médiu dochází po zvýšené syntéze a uvolňování glykosaminoglykanů v prvních 8-10 dnech k jejich časově závislému poklesu. Chování chondrocytů při kultivaci v agaróze se však liší od chování in vivo. V agaróze obsahuje velké množství syntetizovaných agregátů agrekanů menší molekuly a méně molekul než in vivo. TGF-β stimuluje syntézu proteoglykanů v explantátu, ale snižuje syntézu agrekanů v agaróze.

Alginát je lineární polysacharid získaný z hnědých mořských řas. V přítomnosti dvojmocných kationtů, jako jsou ionty Ca2 ⁺, se tento polymer mění na gel. Každý chondrocyt zachycený v alginátu je obklopen matricí negativně nabitých polysacharidů, jejichž póry jsou srovnatelné s póry v hyalinní chrupavce. Matrice tvořená chondrocyty v alginátových kuličkách se skládá ze dvou kompartmentů - tenké vrstvy buněčné matrix odpovídající pericelulární a teritoriální matrix kloubní chrupavky a vzdálenější matrice ekvivalentní interteritoriální matrix v nativní tkáni. 30. den kultivace je relativní a absolutní objem zabíraný buňkami a každým ze dvou kompartmentů v alginátové kuličce téměř zcela identický s objemem v nativní chrupavce. Po dobu téměř 30 dnů si chondrocyty zachovávají svůj kulovitý tvar a produkují agrekan, jehož hydrodynamické vlastnosti jsou podobné vlastnostem molekul agrekanu v matrix kloubní chrupavky, a také molekul kolagenu typu II, IX a XI. Zároveň, stejně jako u jiných suspenzních kultur, jsou na povrchu alginátových kuliček přítomny zploštělé buňky, které produkují malé množství molekul kolagenu typu I, které se přímo uvolňují do média a nejsou inkorporovány do ECM. U alginátových kuliček je pozorována mírná proliferace chondrocytů. Po 8 měsících kultivace v alginátovém gelu zralé chondrocyty neztrácejí metabolickou aktivitu a pokračují v syntéze tkáňově specifického kolagenu typu II a agrekanu.

H. Tanaka a kol. (1984) zkoumali difuzní vlastnosti různých přírodních molekul v alginátu a zjistili, že molekuly větší než 70 kDa alginátem nedifundují. Buněčná kultura v alginátu je tedy vhodná pro studium regulace biosyntézy matrix a organizace extracelulární matrix (ECM). Dostupnost buněk kultivovaných v alginátu umožňuje studovat působení peptidových regulačních faktorů a farmakologických látek na transkripční, posttranskripční a translační úrovni.

Chondrocyty se také kultivují v matrici kolagenových vláken typu I a II. S. Nehrer a kol. (1997) porovnávali fungování psích chondrocytů v porézních matricích kolagen-proteoglykanového polymeru obsahujících kolageny různých typů. Zjistili významné rozdíly v morfologii biosyntetické funkce chondrocytů kultivovaných v kolagenových matricích obsahujících kolagen typu I a II. Buňky v matrici kolagenu typu II si zachovaly svůj kulovitý tvar, zatímco v kolagenu typu I měly morfologii podobnou fibroblastům. Navíc v matrici kolagenu typu II chondrocyty produkovaly větší množství glykosaminoglykanů. J. van Susante a kol. (1995) porovnávali vlastnosti chondrocytů kultivovaných v alginátovém a kolagenovém (typ I) gelu. Autoři zjistili významný nárůst počtu buněk v kolagenovém gelu, ale od 6. dne kultivace buňky ztrácely svůj charakteristický fenotyp a měnily se v buňky podobné fibroblastům. V alginátovém gelu byl pozorován pokles počtu buněk, ale chondrocyty si zachovaly svůj normální fenotyp. V kolagenovém gelu byl počet proteoglykanů na buňku významně vyšší než v alginátu, ale v gelu byl pozorován pokles syntézy matricových prvků, počínaje 6. dnem kultivace, zatímco v alginátu syntéza nadále rostla.

Pevná trojrozměrná fibrinová matrice je přírodní látka, která v ní nese suspendované chondrocyty v diferencovaném fenotypu. Trojrozměrná fibrinová matrice může být také použita jako nosič při transplantaci chondrocytů. Výhodami fibrinu jsou absence cytotoxicity, schopnost vyplnit prostor a adhezivní kapacita. Histologické a biochemické studie, autoradiografie a elektronová mikroskopie ukázaly, že chondrocyty ve fibrinovém gelu si zachovávají svou morfologii, proliferují a produkují matrici i po 2 týdnech kultivace. G. Homminga a kol. (1993) však uvádějí, že rozpad fibrinu začíná po 3 dnech kultivace a dediferenciace chondrocytů postupuje.

Suspenze chondrocytů v umělém (syntetickém) ECM

Chrupavčité implantáty pro rekonstrukční nebo ortopedickou chirurgii lze získat pěstováním izolovaných chondrocytů in vitro v syntetické biokompatibilní matrici.

Chondrocyty kultivované v kyselině polyglykolové proliferují a zachovávají si normální morfologii a fenotyp po dobu 8 týdnů. Komplex chondrocytů a kyseliny polyglykolové se skládá z buněk, glykosaminoglykanů, kolagenů a má vnější kolagenní pouzdro. Takové implantáty však obsahují dva typy molekul kolagenu – I a II. Implantáty z chondrocytů dediferencovaných řadou pasáží mají větší množství glykosaminoglykanů a kolagenů než implantáty z primárně nediferencovaných chondrocytů.

L. Freed a kol. (1993b) porovnávali chování lidských a bovinních kultur chondrocytů ve vláknité kyselině polyglykolové (FPGA) a porézní kyselině polymléčné (PPLA). Po 6-8 týdnech kultivace bovinních chondrocytů v FPGA nebo PPLA autoři pozorovali proliferaci buněk a regeneraci chrupavčité matrix. V FPGA měly chondrocyty kulovitý tvar a byly umístěny v lakunách obklopených chrupavčitou matrix. Po 8 týdnech kultivace in vitro obsahovala regenerovaná tkáň až 50 % sušiny (4 % buněčné hmoty, 15 % glykosaminoglykanů a 31 % kolagenu). V PPLA měly buňky vřetenovitý tvar a malé množství glykosaminoglykanů a kolagenu. V FPGA byl růst buněk 2krát intenzivnější než v PPLA. In vivo chondrocyty pěstované v VPGK a PPLC produkovaly tkáň histologicky podobnou chrupavce během 1-6 měsíců. Implantáty obsahovaly glykosaminoglykany, kolageny typu I a II.

Hovězí fetální chondrocyty byly kultivovány v porézním hydrofobním a hydrofilním polyethylenu s vysokou hustotou. Po 7 dnech inkubace v obou substrátech si buňky zachovaly kulovitý tvar a obsahovaly převážně kolagen typu II. Po 21 dnech kultivace bylo zjištěno, že hydrofilní matrice obsahuje více kolagenu typu II než hydrofobní matrice.

Chrupavčitou tkáň lze také získat kultivací v monovrstvě na filtrech Millicell-CM. Předběžné potažení filtrů kolagenem je nezbytné pro připojení chondroitinů. Histologické vyšetření kultury prokazuje akumulaci chondrocytů v extracelulární chrupavčité tkáni (ECM) obsahující proteoglykany a kolagen typu II. Kolagen typu I nebyl v takové kultuře detekován. Chondrocyty v získané chrupavčité tkáni mají kulovitý tvar, ale na povrchu tkáně jsou poněkud zploštělé. Tloušťka nově vytvořené tkáně se s časem zvětšovala a závisela na počáteční hustotě buněčné monovrstvy. Za optimálních kultivačních podmínek dosáhla tloušťka chrupavčité tkáně 110 μm, organizace jejích buněk a kolagenu do povrchových a hlubokých vrstev je podobná jako u kloubní chrupavky. ECM obsahuje přibližně 3krát více kolagenu a proteoglykanů. Po 2 týdnech kultivace byla pozorována akumulace matrice, což umožnilo extrakci tkáně z filtru a její použití k transplantaci.

Sims a kol. (1996) studovali kultivaci chondrocytů v polyethylenoxidovém gelu, což je zapouzdřená polymerní matrix, která umožňuje přenos velkého množství buněk injekční cestou. Šest týdnů po injekci do podkožní tkáně atymických myší se vytvořila nová chrupavka, která se morfologicky vyznačovala bílou opalescencí podobnou hyalinní chrupavce. Histologická a biochemická data naznačovala přítomnost aktivně proliferujících chondrocytů produkujících extracelulární matrici (ECM).

Explantace

Explantace chrupavčité tkáně se používá ke studiu procesů ana- a katabolismu v ní, udržování homeostázy, resorpce a reparace. Chondrocyty v explantátech chrupavky si in vivo zachovávají normální fenotyp a složení ECM podobné těm v kloubní chrupavce. Po 5 dnech kultivace v přítomnosti séra je dosaženo konstantní úrovně syntézy a přirozených degradačních procesů. Resorpci tkáně lze urychlit v hlavní kultuře i v kultuře s přidáním séra pomocí řady látek, jako jsou IL-IB, TNF-a, bakteriální lipopolysacharidy, deriváty kyseliny retinové nebo aktivní kyslíkové radikály. Pro studium reparace chrupavky se její poškození indukuje rozpustnými zánětlivými mediátory (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) nebo fyzikálním roztržením matrix.

Metoda organotypové kultivace je modelem pro in vitro studie vlivů izolovaných vnějších faktorů na chondrocyty a okolní matrix. In vivo jsou chondrocyty v extracelulárním médiu (ECM) řídce umístěny a vzájemně se nedotýkají. Kultura explantátu kloubní chrupavky si zachovává tuto strukturní organizaci, stejně jako specifické interakce mezi chondrocyty a okolním extracelulárním prostředím. Tento model se také používá ke studiu vlivu mechanického stresu, farmakologických látek, růstových faktorů, cytokinů a hormonů na metabolismus chrupavky.

Další výhodou explantace chrupavčité tkáně je absence poškození chondrocytů působením proteolytických enzymů nebo mechanických faktorů, což je při izolaci buněk nevyhnutelné. Receptory a další membránové proteiny a glykoproteiny jsou chráněny před škodlivými faktory.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Chondronská kultura

Chondron je strukturní, funkční a metabolická jednotka kloubní chrupavky, která se skládá z chondrocytu, jeho pericelulární matrix a kompaktní filamentózní kapsule a je zodpovědná za homeostázu matrixu. Chondrony se mechanicky extrahují z chrupavky a sbírají se pomocí několika po sobě jdoucích nízkorychlostních homogenizací. Chondrony izolované ze zón s různou hloubkou chrupavky lze rozdělit do čtyř kategorií: jeden chondrón, párové chondrony, vícečetné (tři nebo více) lineárně uspořádané chondrony (chondronové sloupce) a shluky chondronu.

Jednotlivé chondrony se obvykle nacházejí ve středních vrstvách intaktní chrupavky, párové chondrony se nacházejí na hranici střední a hluboké vrstvy, lineárně uspořádané vícečetné chondrony jsou typické pro hluboké vrstvy intaktní chrupavky. Nakonec se shluky chondronu skládají z náhodně uspořádaných skupin jednotlivých a párových chondronů, které si po homogenizaci zachovávají agregovaný stav. Shluky chondronu jsou velké fragmenty chrupavky, obvykle obsahující několik chondronů a radiálně uspořádané kolagenní fibrily, tj. typickou organizační charakteristiku hlubokých vrstev matrix. Chondrony jsou imobilizovány v průhledné agaróze, což umožňuje studium jejich struktury, molekulárního složení a metabolické aktivity. Systém chondronu a agarózy je považován za mikromodel chrupavky, který se od tradičního systému chondrocytů a agarózy liší tím, že je zachováno přirozené mikroprostředí a není třeba jej syntetizovat a sestavovat. Kultura chondronu je modelem pro studium interakcí buněk a matrix v kloubní chrupavce za normálních a patologických podmínek.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Kultura nesmrtelných chondrocytů

Rekombinantní DNA nebo viry obsahující onkogeny, které jsou schopny učinit buňku „nesmrtelnou“, se používají k vytvoření permanentních buněčných linií. Nesmrtelné chondrocyty mají schopnost nekonečně se množit a zároveň si zachovat stabilní fenotyp. F. Mallein-Gerin a kol. (1995) ukázali, že onkogen SV40T indukuje proliferaci myších chondrocytů, které nadále stabilně exprimují kolagen typu II, IX a XI, stejně jako artikulární agrekan a vazebný protein. Taková buněčná linie však získává schopnost syntetizovat kolagen typu I při kultivaci v monovrstvé kultuře nebo na agarózovém gelu.

W. Horton a kol. (1988) popsali linii nesmrtelných buněk s nízkou úrovní exprese mRNA kolagenu typu II. Tyto buňky byly získány jejich transformací myším retrovirem obsahujícím onkogeny I-myc- a y-ra. Tento typ buněk představuje unikátní model pro studium interakcí kloubní matrix v nepřítomnosti kolagenu typu II, jakož i regulace syntézy kolagenu typu II.

Kultura chondrocytů s mutovanými nebo deletovanými geny je vhodným modelem pro studium jejich fyziologické funkce. Tento model je obzvláště vhodný pro studium role specifických molekul v organizaci chrupavčité matrix nebo pro zkoumání vlivu různých regulačních faktorů na metabolismus chrupavky. Chondrocyty s deletovaným genem pro kolagen typu IX syntetizují kolagenní fibrily, které jsou širší než obvykle, což naznačuje, že kolagen typu IX reguluje průměr fibril. Jak je uvedeno v kapitole 1, v rodinách s primární generalizovanou osteoartritidou byla nedávno objevena mutace v genu COLAI kódujícím kolagen typu II. Pro studium vlivu mutantního kolagenu typu II na kloubní matrix R. Dharmrvaram a kol. (1997) transfekovali (infikovali cizí nukleovou kyselinou) defektní COL ₂ AI (arginin v pozici 519 je nahrazen cysteinem) do lidských fetálních chondrocytů in vitro.

Systém kokultur. V kloubu chrupavka interaguje s jinými typy buněk obsaženými v synoviální membráně, synoviální tekutině, vazech a subchondrální kosti. Metabolismus chondrocytů může být ovlivněn různými rozpustnými faktory syntetizovanými uvedenými buňkami. U artritidy je tedy kloubní chrupavka ničena proteolytickými enzymy a volnými radikály produkovanými synoviálními buňkami. Proto byly vyvinuty modely pro studium komplexních interakcí mezi chrupavkou a okolními tkáněmi, které se nazývají kokultury.

S. Lacombe-Gleise a kol. (1995) kultivovali králičí chondrocyty a osteoblasty v kokultivačním systému (COSTAR), ve kterém byly buňky odděleny mikroporézní membránou (0,4 μm), což umožňovalo výměnu mezi těmito dvěma typy buněk bez jakéhokoli přímého kontaktu. Tato studie prokázala schopnost osteoblastů stimulovat růst chondrocytů prostřednictvím rozpustných mediátorů.

AM Malfait a spoluautoři (1994) studovali vztah mezi monocyty v periferní krvi a chondrocyty. Tento model je vhodný pro studium procesů zprostředkovaných cytokiny u zánětlivých artropatií (revmatoidní artritida, seronegativní spondyloartritida atd.). Autoři modelu oddělili buňky pomocí membrány vázající proteiny s póry o průměru 0,4 μm. Studie ukázala, že monocyty stimulované lipopolysacharidem produkovaly IL-1 a TNF-a, které inhibovaly syntézu agrekanu chondrocyty a přispívaly k degradaci již syntetizovaných agregátů agrekanu.

K. Tada a kol. (1994) vytvořili model kokultury, ve kterém byly endotelové buňky v kolagenovém (typ I) gelu umístěny do vnitřní komory oddělené od vnější komory s chondrocyty umístěnými v ní filtrem s velikostí pórů 0,4 μm. Ve stavu úplné izolace od vnější komory lidské endotelové buňky tvořily trubice v kolagenovém gelu za přítomnosti EGF nebo TGF-a. Při současné kultivaci obou typů buněk byla inhibována tvorba trubic závislá na TGF-a endotelovými buňkami. Inhibice tohoto procesu chondrocyty byla částečně eliminována protilátkami proti TGF-beta. Lze předpokládat, že TGF-beta produkovaný chondrocyty inhibuje vaskularizaci samotné chrupavky.

S. Groot a kol. (1994) současně kultivovali chondrocyty z hypertrofických a proliferativních zón kosti 16denního myšího plodu s kousky mozkové tkáně. Po 4 dnech kultivace byla pozorována transdiferenciace chondrocytů na osteoblasty a začátek tvorby osteoidů. Po 11 dnech kultivace byla část chrupavky nahrazena kostní tkání a kostní matrix byla částečně kalcifikována. Některé neuropeptidy a neurotransmitery produkované mozkovou tkání ovlivňují metabolismus osteoblastů nebo pro ně mají receptory. Mezi ně patří norepinefrin, vazoaktivní intestinální peptid, peptid související s genem kalcitoninu, substance P a somatostatin. Kousky mozkové tkáně kultivované společně s chondrocyty mohou produkovat některé z uvedených faktorů schopných indukovat proces transdiferenciace chondrocytů na osteoblasty.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Vliv vnějších faktorů na kulturu chondrocytů

Vliv napětí kyslíku na metabolismus chondrocytů

Ve většině případů se kultury chondrocytů vyvíjejí za podmínek atmosférického tlaku kyslíku. Je však dobře známo, že chondrocyty in vivo existují za hypoxických podmínek a tlak kyslíku se mění za různých patologických stavů. Během procesu zrání jsou pozorovány významné změny v krevním zásobení epifýz. Vzhledem k tomu, že vaskularizace se v různých zónách růstové ploténky liší, mění se i tlak kyslíku v nich. C. Brighton a R. Heppenstall (1971) prokázali, že v tibiální ploténce králíků je tlak kyslíku v hypertrofické zóně nižší než v okolní chrupavce. Měření některých metabolických parametrů ukázala, že chondrocyty jsou schopny rychle reagovat na lokální změny koncentrace kyslíku. V první řadě při nízkém tlaku kyslíku klesá jeho spotřeba chondrocyty. S poklesem tlaku kyslíku z 21 na 0,04 % se zvyšuje využití glukózy, zvyšuje se aktivita glykolytických enzymů a syntéza kyseliny mléčné. I při nízkém tlaku kyslíku zůstává absolutní množství ATP, ADP a AMP stabilní. Tato data naznačují, že metabolismus chondrocytů je zaměřen na maximální úsporu energie. Syntetická aktivita, a tedy i reparační procesy, se však za hypoxických podmínek mění.

Vysoký tlak kyslíku také ovlivňuje metabolismus chondrocytů, což způsobuje snížení syntézy proteoglykanů a DNA a degradaci chrupavčité matrix. Tyto účinky jsou obvykle doprovázeny produkcí volných kyslíkových radikálů.

Vliv koncentrace iontů a osmotického tlaku prostředí na funkci chondrocytů

V nativní chrupavce se koncentrace iontů významně liší od koncentrace v jiných tkáních: obsah sodíku v extracelulárním médiu je 250–350 mmol a jeho osmolarita je 350–450 mosmol. Když jsou chondrocyty izolovány z extracelulárního media a inkubovány ve standardním médiu (DMEM (Dulbeccovo minimální esenciální médium), osmolarita je 250–280,7 mosmol), prostředí obklopující buňky se dramaticky změní. Kromě toho je koncentrace vápníku a draslíku ve standardním médiu výrazně nižší než v nativní tkáni a koncentrace aniontů je výrazně vyšší.

Přidání sacharózy do média zvyšuje jeho osmolaritu a indukuje přechodné intracelulární zvýšení koncentrace H ⁺ a vápenatých aniontů v cytosolu. Takové intracelulární změny mohou ovlivnit procesy diferenciace chondrocytů a jejich metabolickou aktivitu. J. Urban a kol. (1993) zjistili, že inkorporace ^35-8 -sulfátu a ^3H -prolinu izolovanými chondrocyty inkubovanými ve standardním DMEM po dobu 2-4 hodin byla pouze 10 % inkorporace v nativní tkáni. Intenzita syntézy dosáhla maxima při osmolaritě extracelulárního média 350-400 mosmol jak v čerstvě izolovaných chondrocytech, tak v explantátech chrupavčité tkáně. Objem chondrocytů se navíc po umístění izolovaných buněk do standardního DMEM se specifikovanou osmolaritou zvýšil o 30-40 %. Při kultivaci chondrocytů za podmínek nefyziologické osmolarity po dobu 12–16 hodin se však buňky adaptují na nové podmínky a snižují intenzitu biosyntézy úměrně k posunu osmolarity extracelulárního prostředí.

P. Borgetti a kol. (1995) studovali vliv osmolarity extracelulárního média na růst, morfologii a biosyntézu prasečích chondrocytů. Autoři prokázali podobné biochemické a morfologické vlastnosti chondrocytů kultivovaných v médiích s osmolaritou 0,28 a 0,38 mosmol. Při osmolaritě média 0,48 mosmol byl během prvních 4-6 hodin kultivace pozorován pokles buněčné proliferace a syntézy proteinů, ale tyto parametry se následně obnovily a nakonec dosáhly kontrolních hodnot. Pokud byly chondrocyty kultivovány v médiu s osmolaritou 0,58 mosmol, buňky ztratily schopnost udržet fyziologickou intenzitu proliferačních procesů a po 6 dnech byl počet chondrocytů významně snížen. Při osmolaritě média 0,58 mosmol byla pozorována výrazná inhibice syntézy proteinů. Kromě toho si chondrocyty při kultivaci v médiu s osmolaritou 0,28-0,38 mOsm zachovávají svůj fyziologický fenotyp; při vyšší osmolaritě (0,48-0,58 mOsm) dochází k významným změnám v buněčné morfologii, což se projevuje ztrátou charakteristického fenotypu, transformací chondrocytů na buňky podobné fibroblastům a ztrátou schopnosti buněk sestavovat matrixové proteoglykany. Výsledky této studie naznačují schopnost chondrocytů reagovat na omezené výkyvy osmolarity extracelulárního prostředí.

Změny v koncentraci dalších iontů mohou také ovlivnit procesy biosyntézy v chondrocytech. Stupeň inkorporace ^35S (síranu) se tak zvyšuje na polovinu se zvýšením koncentrace draselných iontů z 5 mmol (koncentrace ve standardním médiu DM EM) na 10 mmol (koncentrace v ECM in vivo). Koncentrace vápníku pod 0,5 mmol podporovaly produkci kolagenu zralými bovinními chondrocyty, zatímco koncentrace 1-2 mmol (odpovídající koncentraci ve standardním médiu DM EM) způsobila významný pokles syntézy kolagenu. Při vysokých hladinách vápníku (2-10 mmol) byl pozorován mírný nárůst biosyntézy. Na vazbě chondrocytů na proteiny ECM se podílejí různé kationty. Ionty hořčíku a manganu tak zajišťují vazbu na fibronektin a kolagen typu II, zatímco ionty vápníku se na vazbě chondrocytů na proteiny nepodílejí. Výsledky popsaných studií tedy naznačují vliv změn extracelulárních iontů draslíku, sodíku, vápníku a osmolarity média na biosyntetickou funkci chondrocytů inkubovaných ve standardním médiu.

Vliv mechanického namáhání na metabolismus chondrocytů

Imobilizace kloubu způsobuje reverzibilní atrofii chrupavky, což naznačuje potřebu mechanických stimulů pro normální metabolické procesy v ECM. Ve většině případů použité modely buněčných kultur existují za normálního atmosférického tlaku. M. Wright a kol. (1996) ukázali, že mechanické prostředí ovlivňuje metabolismus chondrocytů, buněčná odpověď závisí na intenzitě a frekvenci kompresního zatížení. Experimenty se zatížením explantátů intaktní kloubní chrupavky in vitro prokázaly pokles syntézy proteinů a proteoglykanů působením statického zatížení, zatímco dynamické zatížení tyto procesy stimuluje. Přesné mechanismy účinku mechanického zatížení na chrupavku jsou složité a pravděpodobně souvisejí s deformací buněk, hydrostatickým tlakem, osmotickým tlakem, elektrickým potenciálem a povrchovými buněčnými receptory pro molekuly matrice. Pro studium vlivu každého z těchto parametrů je nutné vytvořit systém, ve kterém lze jeden parametr měnit nezávisle. Například explantátová kultura není vhodná pro studium deformace buněk, ale lze ji použít ke studiu obecného vlivu tlaku na metabolickou aktivitu chondrocytů. Stlačení chrupavky vede k deformaci buněk a je také doprovázeno vznikem hydrostatického tlakového gradientu, elektrického potenciálu, proudění tekutiny a změnami fyzikálně-chemických parametrů, jako je obsah vody v matrici, hustota elektrického náboje a úroveň osmotického tlaku. Deformaci buněk lze studovat pomocí izolovaných chondrocytů ponořených do agarózového nebo kolagenového gelu.

Bylo vyvinuto několik systémů pro studium vlivu mechanické stimulace na kulturu chondrocytů. Někteří výzkumníci používají systémy, ve kterých je na buněčnou kulturu aplikován tlak prostřednictvím plynné fáze. JP Veldhuijzen a kol. (1979) tak při tlaku 13 kPa nad atmosférickým tlakem s nízkou frekvencí (0,3 Hz) po dobu 15 minut pozorovali zvýšení syntézy cAMP a proteoglykanů a snížení syntézy DNA. R. Smith a kol. (1996) ukázali, že přerušované vystavení kultury primárních bovinních chondrocytů hydrostatickému tlaku (10 MPa) s frekvencí 1 Hz po dobu 4 hodin způsobilo zvýšení syntézy agrekanu a kolagenu typu II, zatímco konstantní tlak tyto procesy neovlivnil. Wright a kol. (1996) s použitím podobného systému uvedli, že cyklický tlak na buněčnou kulturu je spojen s hyperpolarizací buněčné membrány chondrocytů a aktivací draslíkových kanálů závislých na Ca2 ⁺. Účinky cyklického tlaku jsou tedy zprostředkovány iontovými kanály aktivovanými natažením v membráně chondrocytů. Reakce chondrocytů na hydrostatický tlak závisí na podmínkách buněčné kultury a frekvenci aplikovaného zatížení. Cyklický hydrostatický tlak (5 MPa) tedy snižuje zabudování sulfátů do monovrstvy chondrocytů při frekvenci 0,05, 0,25 a 0,5 Hz, zatímco při frekvenci vyšší než 0,5 Hz se zabudování sulfátů do explantátu chrupavky zvyšuje.

M. Bushmann a kol. (1992) uvádějí, že chondrocyty v agarózových gelech mění biosyntézu v reakci na statické a dynamické mechanické zatížení stejným způsobem jako kultivovaný intaktní orgán. Autoři zjistili, že mechanické zatížení generuje hyperosmotický stimul s následným poklesem pH v chondrocytech.

Vliv mechanického natahování lze studovat na buněčné kultuře ponořené do gelu. Napínací sílu lze vytvořit pomocí počítačem řízeného vakua. Když je systém pod určitým stupněm vakua, dno Petriho misky s buněčnou kulturou se protáhne o známou hodnotu, deformace je maximální na okrajích dna misky a minimální ve středu. Natažení se přenáší také na chondrocyty kultivované v Petriho misce. Pomocí této metody K. Holm-vall a kol. (1995) ukázali, že v buňkách chondrosarkomu kultivovaných v kolagenovém (typ II) gelu je zvýšena exprese mRNA 2β-integrinu _{. 2βintegrin} se _dokáže vázat na kolagen typu II. Je považován za mechanoreceptor, protože interaguje s proteiny vázajícími aktin, a tím propojuje ECM a cytoskelet.

Vliv pH na metabolismus chondrocytů

Hodnota pH intersticiální tekutiny vnějšku chrupavčité hmoty je kyselejší než v jiných tkáních. A. Maroudas (1980) stanovil pH kloubní chrupavčité matrix na 6,9. B. Diamant a kol. (1966) zjistili za patologických podmínek pH 5,5. Je známo, že chondrocyty žijí při nízkém PO2, což naznačuje důležitou roli glykolýzy (95 % veškerého metabolismu glukózy) v metabolismu těchto buněk; glykolýza je doprovázena produkcí velkého množství kyseliny mléčné.

Kromě okyselení prostředí produkty glykolýzy mají velký význam samotné složky matrice. Velké množství fixního negativního náboje na proteoglykanech modifikuje extracelulární iontové složení: je pozorována vysoká koncentrace volných kationtů (např. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) a nízká koncentrace aniontů (např. O2, HCO3). Kromě toho je pod vlivem mechanického zatížení z extracelulárního matrixu vytlačována voda, což vede ke zvýšení koncentrace fixních negativních nábojů a přitahování dalších kationtů do matrice. To je doprovázeno snížením pH extracelulárního prostředí, což ovlivňuje intracelulární pH, a tím modifikuje metabolismus chondrocytů. R. Wilkin a A. Hall (1995) studovali vliv pH extracelulárního a intracelulárního prostředí na biosyntézu matrice izolovanými bovinními chondrocyty. Pozorovali dvojí modifikaci syntézy matrice se snížením pH. Mírný pokles pH (7,4 35SO4 a ^3H prolinu do chondrocytů, zatímco hlubší okyselení média (pH +, H ⁺ -výměníku, Ka ⁺ -dependentního transportéru Cl_ ^- НСОС3 a H ⁺ /ATPázy.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Vliv složení kultivačního média na metabolismus chondrocytů

Médium pro kultivaci chondrocytů musí odpovídat experimentálním podmínkám. V posledních letech se k optimalizaci kultivačních podmínek používá telecí sérum. Při použití séra je však třeba vzít v úvahu řadu důležitých bodů:

• vnější růst buněk z periferie tkáně v orgánových kulturách,
• variabilita složení sér různých sérií,
• přítomnost neznámých složek v nich,
• zvýšené riziko interference a artefaktů při studiu vlivu různých biologických faktorů na metabolickou aktivitu buněk.

Příkladem posledního zmíněného je studie vlivu EGF na chondrocyty chrupavky u potkanů. EGF stimuloval inkorporaci ^3H -thymidinu a zvýšení obsahu DNA v kultuře. Tento účinek byl výraznější při nízkých sérových koncentracích (7,5 %) účinek mizel.

Je dobře známo, že hladiny syntézy a degradace v DMEM doplněném telecím sérem jsou významně zvýšené ve srovnání s podmínkami in vivo. Rozdíly mezi metabolismem in vivo a in vitro mohou být způsobeny rozdíly mezi synoviální tekutinou a médiem, ve kterém jsou buňky kultivovány. Lee a kol. (1997) kultivovali mladé bovinní chondrocyty v agaróze za použití živného média obsahujícího DMEM doplněného 20 % telecího séra a velkého množství normální alogenní synoviální tekutiny. Přítomnost synoviální tekutiny v médiu indukovala zvýšení množství proteoglykanů, a to až o 80 % celkového množství synoviální tekutiny. Tyto výsledky naznačují, že synoviální tekutina v kultuře indukuje úroveň metabolismu podobnou jako in vivo, s vysokou úrovní syntézy glykosaminoglykanů a nízkou úrovní buněčného dělení.

G. Verbruggen a kol. (1995) prokázali, že syntéza ^35S -arrpeKaHa lidskými chondrocyty kultivovanými v agaróze v bezsérovém DMEM představovala 20–30 % úrovně syntézy pozorované v DMEM doplněném 10 % telecího séra. Autoři stanovili, do jaké míry IGF-1, IGF-2, TGF-R nebo inzulin obnovily produkci agrekanů v bezsérovém médiu. Autoři dospěli k závěru, že 100 ng/ml inzulinu, IGF-1 nebo IGF-2 částečně obnovilo syntézu agrekanů na 39–53 % kontrolní úrovně. Při kombinaci uvedených faktorů nebyl pozorován žádný synergismus ani kumulace. Zároveň 10 ng/ml TGF-R v přítomnosti 100 ng/ml inzulinu stimulovalo syntézu agrekanů na 90 % nebo více referenční úrovně. A konečně, lidský sérový transferin, samotný nebo v kombinaci s inzulinem, syntézu agrekanů neovlivnil. Po nahrazení telecího séra bovinním sérovým albuminem se obsah agregátů agrekanů významně snížil. Obohacení kultivačního média inzulinem, IGF nebo TGF-R částečně obnovilo schopnost buněk produkovat agregáty agrekanů. IGF-1 a inzulin jsou navíc schopny udržovat homeostázu v buněčných kulturách. Po 40 dnech kultivace v médiu obohaceném o 10-20 ng/ml IGF-1 byla syntéza proteoglykanů udržována na stejné nebo dokonce vyšší úrovni ve srovnání s médiem obsahujícím 20 % telecího séra. Katabolické procesy probíhaly v médiu obohaceném o IGF-1 pomaleji než v médiu obohaceném o 0,1% roztok albuminu, ale poněkud rychleji v médiu obohaceném o 20 % séra. V dlouhověkých kulturách udržuje 20 ng/ml IGF-1 stabilní stav buněk.

D. Lee a kol. (1993) porovnávali vliv složení kultivačního média (DMEM, DMEM+20% telecího séra, DMEM+20 ng/ml IGF-1) na syntézu DNA v kultuře explantátu chrupavčité tkáně, monovrstvé kultuře a v agarózové suspenzi. Při kultivaci v agaróze v přítomnosti séra autoři pozorovali tendenci chondrocytů seskupovat se do velkých shluků. Buňky kultivované bez séra nebo s IGF-1 si v agaróze zachovaly kulatý tvar, shromáždily se do malých skupin, ale netvořily velké agregáty. V monovrstvě byla syntéza DNA významně vyšší v médiu obsahujícím sérum než v médiu obohaceném o IGF-1; syntéza DNA v druhém případě byla významně vyšší než v neobohaceném médiu. Nebyly zjištěny žádné rozdíly v syntéze DNA, když byly chondrocyty kultivovány v agarózové suspenzi v neobohaceném médiu a v médiu s IGF-1. Zároveň byla kultivace suspenzí chondrocytů v agaróze v médiu obohaceném sérem doprovázena zvýšenou inkorporací radionukleotidu ^3H -thymidinu ve srovnání s jinými médii.

Vitamin C je nezbytný pro aktivaci enzymů zapojených do tvorby stabilní helikální struktury kolagenních fibril. Chondrocyty s nedostatkem kyseliny askorbové syntetizují nedostatečně hydroxylované nehelikální prekurzory kolagenu, které jsou vylučovány pomalu. Podávání kyseliny askorbové (50 μg/ml) způsobuje hydroxylaci kolagenu typu II a IX a jejich sekreci v normálním množství. Přidání vitaminu C neovlivnilo úroveň syntézy proteoglykanů. Sekrece kolagenu je proto regulována nezávisle na sekreci proteoglykanů.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]