Umělé srdeční chlopně

Moderní biologické umělé srdeční chlopně dostupné pro klinické použití, s výjimkou plicního autotransplantátu, jsou neživotaschopné struktury, které postrádají potenciál pro růst a reparaci tkání. To klade značná omezení na jejich použití, zejména u dětí, pro korekci chlopňové patologie. Tkáňové inženýrství se v posledních 15 letech rozvinulo. Cílem tohoto vědeckého směru je vytvářet v umělých podmínkách struktury, jako jsou umělé srdeční chlopně s tromborezistentním povrchem a životaschopným intersticiem.

[ 1 ], [ 2 ]

Jak se vyvíjejí umělé srdeční chlopně?

Vědecký koncept tkáňového inženýrství je založen na myšlence osídlování a pěstování živých buněk (fibroblastů, kmenových buněk atd.) v syntetickém nebo přírodním vstřebatelném lešení (matrici), což je trojrozměrná chlopňová struktura, a také na využití signálů, které regulují genovou expresi, organizaci a produktivitu transplantovaných buněk během období tvorby extracelulární matrix.

Takové umělé srdeční chlopně jsou integrovány s tkání pacienta pro konečnou obnovu a další udržení jejich struktury a funkce. V tomto případě se na původní matrici v důsledku fungování buněk (fibroblastů, myofibroblastů atd.) vytvoří nová kolageno-elastinová struktura, respektive extracelulární matrix. V důsledku toho by optimální umělé srdeční chlopně vytvořené metodou tkáňového inženýrství měly být co do anatomické struktury a funkce blízké nativní chlopni a měly by mít také biomechanickou adaptabilitu, schopnost reparace a růstu.

Tkáňové inženýrství vyvíjí umělé srdeční chlopně s využitím různých zdrojů buněčného sběru. Lze tedy použít xenogenní nebo alogenní buňky, ačkoli první z nich jsou spojeny s rizikem přenosu zoonóz na člověka. Genetickou modifikací alogenních buněk je možné snížit antigenicitu a zabránit odmítacím reakcím těla. Tkáňové inženýrství vyžaduje spolehlivý zdroj buněk. Takovým zdrojem jsou autogenní buňky odebrané přímo od pacienta a během reimplantace nevyvolávají imunitní reakce. Účinné umělé srdeční chlopně se vyrábějí na základě autologních buněk získaných z cév (tepen a žil). Pro získání čistých buněčných kultur byla vyvinuta metoda založená na použití fluorescenčně aktivovaného třídění buněk - FACS. Smíšená buněčná populace získaná z cévy je značena acetylovaným markerem lipoproteinů s nízkou hustotou, který je selektivně absorbován na povrchu endoteliocytů. Endotelové buňky lze poté snadno oddělit od většiny buněk získaných z cév, což bude směs buněk hladkého svalstva, myofibroblastů a fibroblastů. Zdroj buněk, ať už tepna nebo žíla, ovlivní vlastnosti výsledného konstruktu. Umělé srdeční chlopně s matricí osetou žilními buňkami jsou tedy lepší v tvorbě kolagenu a mechanické stabilitě než konstrukce oseté arteriálními buňkami. Volba periferních žil se zdá být pohodlnějším zdrojem sběru buněk.

Myofibroblasty lze také odebrat z karotid. Buňky odvozené z cév však mají výrazně odlišné vlastnosti od přirozených intersticiálních buněk. Jako alternativní zdroj buněk lze použít autologní buňky pupeční šňůry.

Umělé srdeční chlopně na bázi kmenových buněk

V posledních letech byl pokrok v tkáňovém inženýrství usnadněn výzkumem kmenových buněk. Využití kmenových buněk červené kostní dřeně má své výhody. Zejména jednoduchost sběru biomateriálu a kultivace in vitro s následnou diferenciací na různé typy mezenchymálních buněk umožňuje vyhnout se použití intaktních cév. Kmenové buňky jsou pluripotentními zdroji buněčných linií a mají jedinečné imunologické vlastnosti, které přispívají k jejich stabilitě v alogenních podmínkách.

Lidské kmenové buňky červené kostní dřeně se získávají sternální punkcí nebo punkcí hřebene kyčelní kosti. Izolují se z 10–15 ml aspirátu sterna, oddělí se od ostatních buněk a kultivují se. Po dosažení požadovaného počtu buněk (obvykle do 21–28 dnů) se vysejí (kolonizují) na matrice a kultivují se v živném médiu ve statické poloze (po dobu 7 dnů ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C za přítomnosti 5 % CO2). Následně se růst buněk stimuluje kupturálním médiem (biologické podněty) nebo vytvořením fyziologických podmínek pro růst tkáně během její izometrické deformace v reprodukčním zařízení s pulzujícím prouděním – bioreaktoru (mechanické podněty). Fibroblasty jsou citlivé na mechanické podněty, které podporují jejich růst a funkční aktivitu. Pulzující proudění způsobuje zvýšení radiálních i obvodových deformací, což vede k orientaci (prodloužení) osídlovaných buněk ve směru těchto napětí. To následně vede k tvorbě orientovaných vláknitých struktur chlopní. Konstantní proudění způsobuje pouze tangenciální napětí na stěnách. Pulzující proudění má příznivý vliv na buněčnou morfologii, proliferaci a složení extracelulární matrix. Povaha proudění živného média, fyzikálně-chemické podmínky (pH, pO2 a pCO2) v bioreaktoru také významně ovlivňují produkci kolagenu. Laminární proudění a cyklické vířivé proudy tak zvyšují produkci kolagenu, což vede ke zlepšení mechanických vlastností.

Dalším přístupem k pěstování tkáňových struktur je vytvoření embryonálních podmínek v bioreaktoru namísto simulace fyziologických podmínek lidského těla. Tkáňové biochlopně pěstované na bázi kmenových buněk mají mobilní a flexibilní laloky, funkčně schopné pod vlivem vysokého tlaku a průtoku přesahujícího fyziologickou úroveň. Histologické a histochemické studie laloků těchto struktur prokázaly přítomnost aktivních procesů biodestrukce matrix a její nahrazení životaschopnou tkání. Tkáň je organizována vrstevnatě s charakteristikami proteinů extracelulárního matrixu podobnými vlastnostem nativní tkáně, přítomností kolagenu typu I a III a glykosaminoglykanů. Typická třívrstvá struktura laloků - ventrikulární, houbovité a vláknité vrstvy - však nebyla získána. ASMA-pozitivní buňky exprimující vimentin nalezené ve všech fragmentech měly charakteristiky podobné vlastnostem myofibroblastů. Elektronová mikroskopie odhalila buněčné elementy s rysy charakteristickými pro životaschopné, sekrečně aktivní myofibroblasty (aktinová/myozinová filamenta, kolagenní vlákna, elastin) a endotelové buňky na povrchu tkáně.

Na cípcích byl detekován kolagen typu I, III, ASMA a vimentin. Mechanické vlastnosti cípků tkáňových a nativních struktur byly srovnatelné. Tkáňové umělé srdeční chlopně vykazovaly po dobu 20 týdnů vynikající výkon a svou mikrostrukturou, biochemickým profilem a tvorbou proteinové matrice se podobaly přirozeným anatomickým strukturám.

Všechny umělé srdeční chlopně získané tkáňovým inženýrstvím byly implantovány zvířatům v plicní poloze, protože jejich mechanické vlastnosti neodpovídají zatížení v aortální poloze. Tkáňové chlopně explantované ze zvířat se svou strukturou blíží nativním, což naznačuje jejich další vývoj a restrukturalizaci in vivo. Zda bude proces restrukturalizace a zrání tkáně pokračovat za fyziologických podmínek i po implantaci umělých srdečních chlopní, jak bylo pozorováno v experimentech na zvířatech, ukážou další studie.

Ideální umělé srdeční chlopně by měly mít poréznost alespoň 90 %, protože to je nezbytné pro růst buněk, přísun živin a odstraňování produktů buněčného metabolismu. Kromě biokompatibility a biologické odbouratelnosti by měly mít umělé srdeční chlopně chemicky příznivý povrch pro očkování buněk a měly by odpovídat mechanickým vlastnostem přirozené tkáně. Úroveň biodegradace matrice by měla být kontrolovatelná a úměrná úrovni tvorby nové tkáně, aby byla zajištěna mechanická stabilita v průběhu času.

V současné době se vyvíjejí syntetické a biologické matrice. Nejběžnějšími biologickými materiály pro tvorbu matric jsou dárcovské anatomické struktury, kolagen a fibrin. Polymerní umělé srdeční chlopně jsou navrhovány tak, aby se po implantaci biologicky rozložily, jakmile implantované buňky začnou produkovat a organizovat si vlastní síť extracelulární matrix. Tvorbu nové matrixové tkáně lze regulovat nebo stimulovat růstovými faktory, cytokiny nebo hormony.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Umělé srdeční chlopně dárce

Jako matrice lze použít umělé srdeční chlopně od dárců získané od lidí nebo zvířat a zbavené buněčných antigenů decellularizací za účelem snížení jejich imunogenicity. Konzervované proteiny extracelulární matrix jsou základem pro následnou adhezi naočkovaných buněk. Existují následující metody odstraňování buněčných elementů (acellularizace): zmrazení, ošetření trypsinem/EDTA, detergenty - dodecylsulfát sodný, deoxykolát sodný, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, a také vícestupňové enzymatické metody ošetření. V tomto případě se odstraňují buněčné membrány, nukleové kyseliny, lipidy, cytoplazmatické struktury a molekuly rozpustné matrix, přičemž se zachovává kolagen a elastin. Ideální metoda však dosud nebyla nalezena. Pouze dodecylsulfát sodný (0,03-1 %) nebo deoxykolát sodný (0,5-2 %) vedly k úplnému odstranění buněk po 24 hodinách ošetření.

Histologické vyšetření odstraněných decelularizovaných biologických chlopní (alograftu a xenograftu) v experimentu na zvířatech (pes a prase) prokázalo částečnou endotelizaci a vrůstání myofibroblastů příjemce do báze bez známek kalcifikace. Byla zaznamenána mírná zánětlivá infiltrace. Během klinických studií decelularizované chlopně SynerGraft™ však došlo k časnému selhání. V matrici bioprotézy byla zjištěna výrazná zánětlivá reakce, která byla zpočátku nespecifická a doprovázena lymfocytární reakcí. Během jednoho roku se vyvinula dysfunkce a degenerace bioprotézy. Nebyla zaznamenána žádná buněčná kolonizace matrix, ale byla zjištěna kalcifikace chlopní a zbytky preimplantačních buněk.

Bezbuněčné matrice naočkované endotelovými buňkami a kultivované in vitro a in vivo vytvořily na povrchu chlopní soudržnou vrstvu a naočkované intersticiální buňky nativní struktury prokázaly svou schopnost diferenciace. Za dynamických podmínek bioreaktoru však nebylo možné dosáhnout požadované fyziologické úrovně kolonizace buněk na matrici a implantované umělé srdeční chlopně byly doprovázeny poměrně rychlým (tříměsíčním) ztluštěním v důsledku zrychlené proliferace buněk a tvorby extracelulární matrix. V této fázi má tedy použití bezbuněčných matric od dárců pro jejich kolonizaci buňkami řadu nevyřešených problémů, včetně imunologických a infekčních; práce na decelularizovaných bioprotézách pokračují.

Je třeba poznamenat, že kolagen je také jedním z potenciálních biologických materiálů pro výrobu matric schopných biodegradace. Může být použit ve formě pěny, gelu nebo desek, houbiček a jako polotovar na bázi vláken. Použití kolagenu je však spojeno s řadou technologických obtíží. Zejména je obtížné jej získat od pacienta. Proto je v současné době většina kolagenových matric živočišného původu. Pomalá biodegradace zvířecího kolagenu může nést zvýšené riziko infekce zoonózami, způsobovat imunologické a zánětlivé reakce.

Fibrin je další biologický materiál s řízenými biodegradačními vlastnostmi. Vzhledem k tomu, že fibrinové gely lze vyrobit z krve pacienta pro následnou výrobu autologní matrice, implantace takové struktury nezpůsobí její toxickou degradaci a zánětlivou reakci. Fibrin má však nevýhody, jako je difúze a vyplavování do prostředí a nízké mechanické vlastnosti.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Umělé srdeční chlopně vyrobené ze syntetických materiálů

Umělé srdeční chlopně se také vyrábějí ze syntetických materiálů. Několik pokusů o výrobu matric chlopní bylo založeno na použití polyglaktinu, kyseliny polyglykolové (PGA), kyseliny polymléčné (PLA), kopolymeru PGA a PLA (PLGA) a polyhydroxyalkanoátů (PHA). Vysoce porézní syntetický materiál lze získat z opletených nebo neopletených vláken a pomocí technologie loužení solí. Slibný kompozitní materiál (PGA/P4HB) pro výrobu matric se získává z neopletených smyček kyseliny polyglykolové (PGA) potažených poly-4-hydroxybutyrátem (P4HB). Umělé srdeční chlopně vyrobené z tohoto materiálu se sterilizují ethylenoxidem. Významná počáteční tuhost a tloušťka smyček těchto polymerů, jejich rychlá a nekontrolovaná degradace, doprovázená uvolňováním kyselých cytotoxických produktů, však vyžaduje další výzkum a hledání dalších materiálů.

Použití autologních destiček pro kultivaci tkání myofibroblastů kultivovaných na scaffoldu za účelem vytvoření podpůrných matric stimulací produkce těchto buněk umožnilo získat vzorky chlopní s aktivními životaschopnými buňkami obklopenými extracelulární matricí. Mechanické vlastnosti tkání těchto chlopní jsou však stále nedostatečné pro jejich implantaci.

Požadované úrovně proliferace a regenerace tkáně vytvářené chlopně nemusí být dosaženo pouze kombinací buněk a matrix. Expresi buněčných genů a tvorbu tkání lze regulovat nebo stimulovat přidáním růstových faktorů, cytokinů nebo hormonů, mitogenních faktorů nebo adhezních faktorů do matric a scaffoldů. Možnost zavedení těchto regulátorů do matrixových biomateriálů se studuje. Celkově existuje značný nedostatek výzkumu regulace tvorby tkáňových chlopní biochemickými stimuly.

Acelulární xenogenní bioprotéza plic prasat Matrix P se skládá z decelularizované tkáně zpracované speciálním patentovaným postupem společnosti AutoTissue GmbH, včetně ošetření antibiotiky, deoxycholátem sodným a alkoholem. Tato metoda zpracování, schválená Mezinárodní organizací pro normalizaci, eliminuje všechny živé buňky a postcelulární struktury (fibroblasty, endotelové buňky, bakterie, viry, houby, mykoplazmata), zachovává architekturu extracelulární matrix, snižuje hladinu DNA a RNA v tkáních na minimum, což snižuje na nulu pravděpodobnost přenosu endogenního retroviru prasat (PERV) na člověka. Bioprotéza Matrix P se skládá výhradně z kolagenu a elastinu se zachovanou strukturální integrací.

V experimentech na ovcích byla 11 měsíců po implantaci bioprotézy Matrix P zaznamenána minimální reakce okolních tkání s dobrou mírou přežití, což bylo patrné zejména na lesklém vnitřním povrchu jejího endokardu. Zánětlivé reakce, ztluštění a zkrácení chlopňových chlopní prakticky chyběly. V bioprotéze Matrix P byly také zaznamenány nízké hladiny vápníku v tkáních, přičemž rozdíl byl statisticky významný ve srovnání s protézami léčenými glutaraldehydem.

Umělá srdeční chlopeň Matrix P se přizpůsobí individuálnímu stavu pacienta během několika měsíců po implantaci. Vyšetření na konci kontrolního období odhalilo intaktní extracelulární matrix a konfluentní endotel. Xenograft Matrix R implantovaný 50 pacientům s vrozenými vadami během Rossovy operace v letech 2002 až 2004 prokázal vynikající výkon a nižší transvalvulární tlakové gradienty ve srovnání s kryokonzervovanými a decelularizovanými alografty SynerGraftMT a glutaraldehydem ošetřenými bioprotézami bez scaffoldu. Umělé srdeční chlopně Matrix P jsou určeny k náhradě plicní chlopně během rekonstrukce výtokového traktu pravé komory v chirurgii vrozených a získaných vad a během náhrady plicní chlopně během Rossovy operace. Jsou k dispozici ve 4 velikostech (podle vnitřního průměru): pro novorozence (15-17 mm), pro děti (18-21 mm), střední (22-24 mm) a dospělé (25-28 mm).

Pokrok ve vývoji tkáňově inženýrských chlopní bude záviset na pokroku v biologii buněk chlopní (včetně problematiky genové exprese a regulace), studiu embryogenního a s věkem podmíněného vývoje chlopní (včetně angiogenních a neurogenních faktorů), přesné znalosti biomechaniky každé chlopně, identifikaci vhodných buněk pro očkování a vývoji optimálních matric. Další vývoj pokročilejších tkáňových chlopní bude vyžadovat důkladné pochopení vztahu mezi mechanickými a strukturálními vlastnostmi nativních chlopní a podněty (biologickými a mechanickými) pro obnovení těchto vlastností in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]