Úloha krystalických depozit v patogenezi osteoartrózy

Krystaly bazického fosforečnanu vápenatého (BCP) se nacházejí v synoviální tekutině u 30–60 % pacientů s osteoartrózou. Podle A. Swana a kol. (1994) se krystaly obsahující vápník nacházejí v synoviální tekutině u mnohem většího počtu pacientů s osteoartrózou; vzhledem k extrémně malé velikosti krystalů nebo jejich malému počtu však nejsou identifikovány pomocí konvenčních technik. Přítomnost krystalů BCP v synoviální tekutině koreluje s radiografickými známkami degenerace kloubní chrupavky a je spojena s větším objemem výpotku ve srovnání s výpotkem v kolenních kloubech bez krystalů. Studie faktorů ovlivňujících radiografickou progresi gonartrózy ukázala, že ukládání krystalů dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého (CPPD) je prediktorem nepříznivého klinického a radiografického výsledku. Ve studii starších pacientů byla zjištěna asociace osteoartrózy s chondrokalcinózou, zejména v laterálním tibiofemorálním kompartmentu kolena a prvních třech metakarpofalangeálních kloubech. Není neobvyklé, že se u pacientů s osteoartrózou vyskytují oba typy krystalů, OFC a PFC.

Klinicky se degenerace kloubní chrupavky způsobená ukládáním krystalů vápníku liší od degenerace pozorované u primární osteoartózy. Pokud by krystaly byly jednoduchým epifenoménem degenerace chrupavky, nacházely by se v kloubech nejčastěji postižených primární osteoartrózou, tj. v kolenou, kyčlích a malých kloubech rukou. Naproti tomu onemocnění s ukládáním krystalů nejčastěji postihují klouby, které nejsou typické pro primární osteoartrózu, jako je rameno, zápěstí a loket. Přítomnost krystalů v kloubní (výpotkové) tekutině je spojena s těžší degenerací kloubní chrupavky. Diskutuje se o tom, co je příčinou a co následkem, zda ukládání krystalů, nebo degenerace chrupavky. Mezilehlou pozici zaujímá následující předpoklad: primární anomálie v metabolismu chrupavky vede k její degeneraci a sekundární ukládání krystalů urychluje její degradaci (tzv. teorie amplifikační smyčky).

Přesný mechanismus, kterým krystaly vápníku poškozují kloubní chrupavku, není znám a je shrnut níže. Teoreticky mohou krystaly vápníku přímo poškozovat chondrocyty. Histologické vyšetření však zřídka odhalí krystaly v blízkosti chondrocytů a ještě vzácněji jsou jimi pohlceny. Nejpravděpodobnějším mechanismem je fagocytóza krystalů buňkami synoviální výstelky, následovaná uvolňováním proteolytických enzymů nebo sekrecí cytokinů, které stimulují uvolňování enzymů z chondrocytů. Tuto koncepci podporuje studie role synovitidy indukované PFKD ve vývoji rychle progresivní osteoartrózy u pyrofosfátové artropatie. V této studii byly krystaly dihydrátu pyrofosfátu vápenatého (1 nebo 10 mg) týdně injikovány do pravého kolena králíků s osteoartrózou vyvolanou parciální laterální meniscektomií. Ukázalo se, že po 8 injekcích vykazoval pravý kolenní kloub výrazně závažnější změny ve srovnání s levým. Intenzita synoviálního zánětu korelovala s intraartikulárními injekcemi krystalů dihydrátu pyrofosfátu vápenatého a jejich dávkou. Přestože dávky krystalů CPPD použité v této studii převyšují dávky in vivo, výsledky naznačují roli zánětu indukovaného CPPD v progresi osteoartrózy u pyrofosfátové artropatie.

Potenciální mechanismy indukce poškození kloubní chrupavky krystaly obsahujícími vápník jsou spojeny s jejich mitogenními vlastnostmi, schopností indukovat MMP a stimulovat syntézu prostaglandinů.

Mitogenní účinek krystalů obsahujících vápník. U artropatií spojených s krystaly je často pozorována proliferace buněk synoviální výstelky, přičemž samotné krystaly jsou za tento proces zodpovědné pouze částečně. Zvýšení počtu synoviálních buněk je doprovázeno zvýšenou sekrecí cytokinů, které podporují chondrolýzu a indukují sekreci proteolytických enzymů. Krystaly OFC v koncentracích nalezených v lidské kloubní patologii stimulují v závislosti na dávce mitogenezi klidových kultur kožních fibroblastů a synoviálních fibroblastů psů a myší. Krystaly dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého, urátu, síranu, uhličitanu a fosforečnanu vápenatého stimulují růst buněk. Nástup a vrchol inkorporace ( ^3H )-thymidinu indukované těmito krystaly jsou posunuty o 3 hodiny ve srovnání se stimulací buněk krevním sérem. Toto časové období může být nezbytné pro fagocytózu a rozpuštění krystalů. Přidání kontrolních krystalů stejné velikosti (např. diamantový prach nebo latexové částice) mitogenezi nestimulovalo. Krystaly monohydrátu urátu sodného měly slabé mitogenní vlastnosti a byly výrazně horší než vlastnosti urátu vápenatého, což naznačuje důležitost obsahu vápníku v krystalech v mitogenezi. Syntetické krystaly OFC měly stejné mitogenní vlastnosti jako krystaly získané od pacientů s chondrokalcinózou. Mitogenní účinek krystalů obsahujících vápník nebyl výsledkem zvýšení obsahu vápníku v okolním živném médiu in vitro, protože rozpuštění bazických krystalů fosforečnanu vápenatého v živném médiu nestimulovalo inkorporaci ( ^3H )-thymidinu fibroblasty.

Jeden navrhovaný mechanismus mitogeneze indukované OFC spočívá v tom, že abnormální proliferace synoviálních buněk může být alespoň zčásti způsobena endocytózou a intracelulárním rozpouštěním krystalů, což zvyšuje cytoplazmatické koncentrace Ca2 ⁺ a aktivuje dráhu závislou na vápníku vedoucí k mitogenezi. Tuto koncepci podporuje požadavek na přímý kontakt buňka-krystal pro stimulaci mitogeneze, protože vystavení buněčných kultur krystalům indukovalo růst buněk, zatímco vystavení buněk zbavených takového kontaktu nikoli. Pro studium požadavku na fagocytózu krystalů po interakci buňka-krystal byly buňky kultivovány s ^45Ca -OPC a ( ^3H )-thymidinem. Bylo zjištěno, že buňky obsahující ^45Ca -OPC inkorporovaly významně více ( ^3H )-thymidinu než buňky bez značení bazickým fosforečnanem vápenatým. V makrofágových kulturách vedla inhibice endocytózy krystalů cytochalasinem k inhibici rozpouštění krystalů, což dále zdůrazňuje nutnost fagocytózy.

Krystaly obsahující vápník jsou rozpustné v kyselině. Po fagocytóze se krystaly rozpouštějí v kyselém prostředí makrofágových fagolysozomů. Chlorochin, chlorid amonný, bafilomycin A1 a všechna lysozomotropní činidla, která zvyšují pH lysozomů, inhibují v závislosti na dávce intracelulární rozpouštění krystalů a příjem (3H)-thymidinu ^ve fibroblastech kultivovaných s krystaly bazického fosforečnanu vápenatého.

Přidání krystalů OFC do monovrstvé fibroblastové kultury způsobilo okamžitý desetinásobný nárůst intracelulárního vápníku, který se po 8 minutách vrátil k výchozí hodnotě. Zdrojem vápníku byly převážně extracelulární ionty, protože bazické krystaly fosforečnanu vápenatého byly přidány do kultivačního média bez vápníku. Další nárůst intracelulární koncentrace vápníku byl pozorován po 60 minutách a trval nejméně 3 hodiny. Zde byl zdrojem vápníku fagocytovaný krystal rozpuštěný ve fagolysozomech.

Bylo zjištěno, že mitogenní účinek krystalů OFC je podobný účinku PDGF jako růstového faktoru; stejně jako PDGF vykazují krystaly OFC synergismus s IGF-1 a krevní plazmou. Blokáda IGF-1 snižuje buněčnou mitogenezi v reakci na OFC. PG Mitchell a kol. (1989) ukázali, že indukce mitogeneze ve fibroblastech Balb/c- ₃ T3 _krystaly OFC vyžaduje přítomnost serin/threonin proteinkinázy C (PKC), jednoho z hlavních mediátorů signálů generovaných během vnější stimulace buněk hormony, neurotransmitery a růstovými faktory. Snížení aktivity PKC v buňkách Balb/c-3 T3 _{inhibuje indukci protoonkogenů c-fos a c-myc zprostředkovanouOFC}, ale neovlivňuje stimulaci těchto onkogenů zprostředkovanou PDGF.

Zvýšení intracelulárního vápníku po rozpuštění fagocytovaných krystalů není jedinou signální dráhou pro mitogenezi. Když se růstové faktory, jako je PDGF, vážou na svůj membránový receptor, je stimulována fosfolipáza C (fosfodiesteráza), která hydrolyzuje fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát za vzniku intracelulárních poslů inositol-3-fosfátu a diacylglycerolu. První jmenovaný uvolňuje vápník z endoplazmatického retikula modulací aktivity enzymů závislých na vápníku a enzymů závislých na vápníku/kalmodulinu, jako jsou proteinkinázy a proteázy.

R. Rothenberg a H. Cheung (1988) zaznamenali zvýšenou degradaci fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátu fosfolipázou C v synoviálních buňkách králíků v reakci na stimulaci krystaly OFC. Ty významně zvýšily obsah inositol-1-fosfátu v buňkách se značeným ( ^3H )-inositolem; vrcholu bylo dosaženo během 1 minuty a přetrvával přibližně 1 hodinu.

Diacylglycerol je potenciálním aktivátorem dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého. Vzhledem k tomu, že krystaly OFC zvyšují aktivitu fosfolipázy C, což vede k akumulaci diacylglycerolu, lze očekávat zvýšenou aktivaci PKC. PG Mitchell a kol. (1989) porovnávali účinky krystalů OFC a PDGF na syntézu DNA _{fibroblasty Balb/c-3T3}. V buněčné kultuře byl PKC inaktivován inkubací buněk s forboldiesterem (TPD) podporujícím nádor, což je analog diacylglycerolu. Dlouhodobá stimulace nízkými dávkami TPD snížila aktivitu PKC, zatímco jednorázová stimulace vysokou dávkou ji aktivovala. Stimulace syntézy DNA krystaly OFC byla po inaktivaci PKC potlačena, což naznačuje důležitost tohoto enzymu v mitogenezi indukované OFC. Dříve GM McCarthy a kol. (1987) prokázali souvislost mezi mitogenní odpovědí lidských fibroblastů na krystaly OFC a aktivací PKC. Krystaly OFC však neaktivují fosfatidylinositol-3-kinázu ani tyrosinkinázy, což potvrzuje, že mechanismus buněčné aktivace krystaly OFC je selektivní.

Proliferaci buněk řídí skupina genů zvaných protoonkogeny. Proteiny foe a mye, produkty protoonkogenů c-fos a c-myc, jsou lokalizovány v buněčném jádře a vázány na specifické sekvence DNA. Stimulace fibroblastů 3T3 krystaly OFC vede k expresi c-fos během několika minut, která dosahuje maxima 30 minut po stimulaci. Indukce transkripce c-myc krystaly OFC nebo PDGF nastává během 1 hodiny a dosahuje maxima 3 hodiny po stimulaci. Buňky si udržují zvýšenou hladinu transkripce c-fos a c-myc po dobu nejméně 5 hodin. V buňkách s inaktivovanou PCD je stimulace c-fos a c-myc krystaly OFC nebo TFD významně potlačena, zatímco indukce těchto genů PDGF se nemění.

Členové rodiny mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAP K) jsou klíčovými regulátory různých intracelulárních signálních kaskád. Jedna podtřída této rodiny, p42/p44, reguluje buněčnou proliferaci mechanismem, který zahrnuje aktivaci protoonkogenů c-fos a c-jun. Krystaly OFC a PFKD aktivují signální dráhu proteinkinázy, která zahrnuje jak p42, tak p44, což naznačuje roli této dráhy v mitogenezi indukované krystaly obsahujícími vápník.

Konečně, mitogeneze indukovaná OFC zahrnuje transkripční faktor nukleárního faktoru κB (NF-κB), který byl poprvé popsán jako gen lehkého řetězce imunoglobulinu κ (IgK). Jedná se o indukovatelný transkripční faktor důležitý v mnoha signálních drahách, protože reguluje expresi různých genů. Indukce NF-κB je obvykle spojena s uvolněním inhibičních proteinů zvaných IκB z cytoplazmy. Po indukci NF-κB následuje translokace aktivního transkripčního faktoru do jádra. Krystaly OFC indukují NF-κB ve fibroblastech Balb/c- _3T3 a fibroblastech lidské kůže.

Do signální transdukce po aktivaci NF-κB může být zapojeno několik drah, ale všechny zahrnují proteinkinázy, které fosforylují (a tím degradují) IκB. Na základě studií in vitro se dříve předpokládalo, že IκB slouží jako substrát pro kinázy (např. PKC a proteinkinázu A). Nedávno však byl identifikován komplex kinázy IκB s velkou molekulovou hmotností. Tyto kinázy specificky fosforylují serinové zbytky IκB. Aktivace NF-κB pomocí TNF-α a IL-1 vyžaduje účinné působení kinázy indukující NF-κB (NIK) a kinázy IκB. Molekulární mechanismus aktivace NIK není v současné době znám. Ačkoli krystaly OFC aktivují jak PKC, tak NF-κB, není známo, do jaké míry mohou být tyto dva procesy propojeny. Vzhledem k tomu, že modifikace kinázy GκB probíhá prostřednictvím fosforylace, nelze vyloučit roli PKC v indukci NF-κB krystaly OFC prostřednictvím fosforylace a aktivace kinázy GκB. Tuto koncepci podporuje inhibice mitogeneze indukované krystaly OFC a exprese NF-κB inhibitorem PKC staurosporinem. Podobně může staurosporin inhibovat kinázu GκB, a tím inhibovat proteinkinázu A a další proteinkinázy.

Mechanismus mitogeneze indukované krystaly OFC ve fibroblastech tedy zahrnuje alespoň dva různé procesy:

• rychlá membránově vázaná událost, která vede k aktivaci PKC a MAP K, indukci NF-κB a protoonkogenů,
• pomalejší intracelulární rozpouštění krystalů, což vede ke zvýšení intracelulárního obsahu Ca2 ⁺ a následně k aktivaci řady procesů závislých na vápníku, které stimulují mitogenezi.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukce krystaly obsahujícími vápník a MMP

Mediátory poškození tkání krystaly obsahujícími vápník jsou MMP - kolagenáza-1, stromelysin, 92 kD želatináza a kolagenáza-3.

Vzhledem k vztahu mezi obsahem krystalů OFC a destrukcí kloubní tkáně byla předložena hypotéza, že krystaly OFC a pravděpodobně i některé kolageny jsou fagocytovány synoviálními buňkami. Stimulované synovocyty proliferují a vylučují proteázy. Tato hypotéza byla testována in vitro přidáním přírodních nebo syntetických OFC, PFCD a dalších krystalů do kultivovaných lidských nebo psích synovocytů. Aktivita neutrálních proteáz a kolagenáz se zvyšovala v závislosti na dávce a byla přibližně 5–8krát vyšší než u kontrolní buněčné kultury pěstované bez krystalů.

V buňkách kultivovaných v médiu obsahujícím krystaly byla detekována koindukce mRNA kolagenázy-1, stromelysinu a želatinázy-92 kDa, následovaná sekrecí enzymů do média.

Krystaly OFC také indukovaly akumulaci mRNA kolagenázy-1 a kolagenázy-2 ve zralých prasečích chondrocytech, následovanou sekrecí enzymů do média.

GM McCarty a kol. (1998) studovali roli intracelulárního rozpouštění krystalů v krystaly indukované produkci MMP. Zvýšení pH lysozomů pomocí bafilomycinu A inhibovalo intracelulární rozpouštění krystalů a také zmírnilo proliferativní reakci lidských fibroblastů na krystaly OFC, ale neinhibovalo syntézu a sekreci MMP.

Ani bazický fosforečnan vápenatý, ani krystaly PFCD neindukovaly produkci IL-1 in vitro, ale krystaly urátu sodného ano.

Současná data jasně naznačují přímou stimulaci produkce MMP fibroblasty a chondrocyty po kontaktu s krystaly obsahujícími vápník.

Příznaky osteoartrózy naznačují významnou roli MMP v progresi onemocnění. Přítomnost krystalů obsahujících vápník zvyšuje degeneraci tkání postižených kloubů.

Stimulace syntézy prostaglandinů

Spolu se stimulací buněčného růstu a sekrece enzymů způsobují krystaly obsahující vápník uvolňování prostaglandinů, zejména PGE2, z buněčných kultur savců _. K uvolňování PGE2 _ve všech případech dochází během první hodiny po vystavení buněk krystalům. R. Rothenberg (1987) zjistil, že hlavními zdroji kyseliny arachidonové pro syntézu PGE2 _{jsou fosfatidylcholin a fosfatidylethanolamin, a také potvrdil, že dominantními drahami proprodukci} PGE2 jsou fosfolipáza A2 _a NOX.

PGE1 se může uvolňovat také v reakci na krystaly OFA. GM McCarty a kol. (1993, 1994) studovali účinky PGE2 _, PGE a jeho analogu misoprostolu na mitogenní reakci lidských fibroblastů na krystaly OFA. Všechny tři látky inhibovaly mitogenní reakci v závislosti na dávce, přičemž PGE a misoprostol vykazovaly výraznější inhibiční aktivitu. PGE2 a misoprostol, ale nikoli PGE2 _, inhibovaly akumulaci mRNA kolagenázy v reakci na krystaly OFA.

MG McCarty a H. Cheung (1994) zkoumali mechanismus aktivace buněk zprostředkované OFC pomocí PGE. Autoři prokázali, že PGE, silnější induktor intracelulárního cAMP než PGE2 _a PGE, inhibuje OFC-indukovanou mitogenezi a produkci MMP prostřednictvím cAMP-dependentní signální transdukční dráhy. Je možné, že zvýšení produkce PGE indukované krystaly OFC oslabuje jejich další biologické účinky (mitogenezi a produkci MMP) prostřednictvím mechanismu zpětné vazby.

Krystaly vyvolaný zánět

Krystaly obsahující vápník se často nacházejí v synoviální tekutině pacientů s osteoartrózou, nicméně epizody akutního zánětu s leukocytózou jsou vzácné jak u osteoartózy, tak u artropatií asociovaných s krystaly (například syndrom ramene Milwaukee). Flogistický potenciál krystalů může být modifikován řadou inhibičních faktorů. R. Terkeltaub a kol. (1988) prokázali schopnost krevního séra a plazmy významně inhibovat reakci neutrofilních granulocytů na bazické krystaly fosforečnanu vápenatého. Faktory, které způsobují tuto inhibici, jsou proteiny vázající krystaly. Studie jednoho z těchto proteinů, ₂ -HS glykoproteinu (AHSr), ukázala, že AHSr je nejúčinnějším a nejspecifičtějším inhibitorem reakce neutrofilních granulocytů na krystaly OFC. AHSr je sérový protein jaterního původu; Je známo, že ve srovnání s jinými sérovými proteiny se nachází v relativně vysokých koncentracích v kostní a mineralizující tkáni. Kromě toho je AHSr přítomen v „nezánětlivé“ synoviální tekutině a byl také detekován na bazických krystalech fosforečnanu vápenatého v nativní synoviální tekutině. Nelze tedy vyloučit možnost, že AHSr moduluje flogogenní potenciál bazických krystalů fosforečnanu vápenatého in vivo.

Abychom shrnuli vše výše uvedené, uvádíme dvě schémata patogeneze osteoartrózy navržená WB van den Bergem a kol. (1999) a M. Carrabba a kol. (1996), které kombinují mechanické, genetické a biochemické faktory.