Léčba exacerbací roztroušené sklerózy

Glukokortikoidy a kortikotropin v léčbě roztroušené sklerózy

V roce 1949 Philipp Hench ohlásil zlepšení stavu 14 pacientů s revmatoidní artritidou pomocí sloučeniny E (kortizonu) a kortikotropinu. Dr. Hench a dva biochemici, E. C. Kendall a T. Reichstein, získali Nobelovu cenu za medicínu a fyziologii za objev klinicky významného protizánětlivého účinku steroidů. To vedlo k širokému použití těchto léků v léčbě autoimunitních onemocnění a zánětlivých stavů. První zpráva o jejich použití u roztroušené sklerózy pochází z roku 1950, kdy byl malé skupině pacientů otevřenou metodou podán adrenokortikotropní hormon (ACTH). Ačkoli tyto studie neprokázaly účinnost ACTH, stav pacientů se s léčbou zlepšil. Jiné nekontrolované studie ACTH však ukázaly, že nemá významný vliv na chronický průběh onemocnění, i když poskytuje určitý přínos snížením závažnosti exacerbací. Podobně studie ACTH u optické neuritidy zjistily významné zlepšení rychlosti a rozsahu zotavení zraku během prvního měsíce léčby, ale po 1 roce nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi skupinami. Ačkoli několik studií s perorálním prednisolonem uvádělo podobné zlepšení funkce po exacerbaci, chronické užívání perorálních steroidů po dobu až 2 let nemělo žádný vliv na progresi neurologického deficitu.

Na začátku 80. let 20. století byly publikovány jak otevřené, tak zaslepené studie, které prokázaly, že intravenózní prednisolon zlepšil krátkodobý výsledek pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou. Randomizované studie porovnávající ACTH s intravenózním methylprednisolonem ukázaly, že druhý jmenovaný byl stejně účinný jako ACTH, ale měl méně vedlejších účinků. Počáteční dávka intravenózního methylprednisolonu se pohybovala od 20 mg/kg/den po dobu 3 dnů do 1 g po dobu 7 dnů. V důsledku těchto zpráv se obnovil zájem o léčbu glukokortikoidy, protože krátkodobá intravenózní kúra methylprednisolonu byla pro pacienta pohodlnější a měla méně vedlejších účinků než ACTH.

Doporučená dávka methylprednisolonu pro intravenózní podání se pohybuje od 500 do 1500 mg denně. Podává se denně v jedné dávce nebo v rozdělených dávkách po dobu 3 až 10 dnů. Délka léčby může být zkrácena, pokud dojde k rychlé odpovědi, nebo prodloužena, pokud nedojde ke zlepšení.

Riziko komplikací při krátkých kúrách intravenózního methylprednisolonu je minimální. Srdeční arytmie, anafylaktické reakce a epileptické záchvaty se vyskytují vzácně. Riziko těchto nežádoucích účinků lze minimalizovat infuzí léku po dobu 2–3 hodin. Je vhodné provést první kúru v nemocničním prostředí pod dohledem zkušených zdravotnických pracovníků. Dalšími komplikacemi spojenými se zavedením tohoto léku jsou drobné infekce (infekce močových cest, orální nebo vaginální kandidóza), hyperglykémie, gastrointestinální poruchy (dyspepsie, gastritida, exacerbace peptického vředu, akutní pankreatitida), duševní poruchy (deprese, euforie, emoční labilita), zarudnutí obličeje, poruchy chuti, nespavost, mírné přibývání na váze, parestézie a akné. Známý je také abstinenční syndrom po vysazení steroidů, který se objevuje při náhlém vysazení vysokých dávek hormonů a je charakterizován myalgií, artralgií, únavou a horečkou. Lze jej minimalizovat postupným vysazováním glukokortikoidů perorálním prednisonem, počínaje dávkou 1 mg/kg/den. Místo prednisonu lze také použít nesteroidní protizánětlivé léky, jako je ibuprofen.

Podávání vysokých dávek glukokortikoidů snižuje počet lézí zvýrazněných gadoliniem na MRI, pravděpodobně v důsledku obnovení integrity hematoencefalické bariéry. K těmto účinkům může přispívat řada farmakologických vlastností glukokortikoidů. Glukokortikoidy tedy působí proti vazodilataci inhibicí produkce jejích mediátorů, včetně oxidu dusnatého. Imunosupresivní účinek glukokortikoidů může snižovat penetraci zánětlivých buněk do perivenulárních prostorů mozku. Glukokortikoidy navíc inhibují produkci prozánětlivých cytokinů, snižují expresi aktivačních markerů na imunologických a endoteliálních buňkách a snižují produkci protilátek. Inhibují také aktivitu T-lymfocytů a makrofágů a snižují expresi IL-1, -2, -3, -4, -6, -10, TNFa a INFy. Glukokortikoidy také inhibují expresi receptorů IL-2 a v důsledku toho i přenos signálu, stejně jako expresi molekul MHC třídy II na makrofágech. Kromě toho užívání těchto látek oslabuje funkci CD4 lymfocytů ve větší míře než CD8 lymfocytů. Zároveň glukokortikoidy nemají žádný trvalý vliv na imunitní parametry u roztroušené sklerózy. U většiny pacientů se index oligoklonálních protilátek během léčby nemění a dočasný pokles syntézy IgG v mozkomíšním moku nekoreluje s klinickým zlepšením.

Je obtížné oddělit imunosupresivní účinek od přímého protizánětlivého účinku glukokortikoidů u roztroušené sklerózy. Výsledky studie Glucocorticoid Efficacy in Optic Neuritis Study jsou však pozoruhodné a ukazují, že vysoké dávky methylprednisolonu (na rozdíl od placeba nebo perorálního prednisonu) snížily riziko druhé epizody demyelinizace během 2 let.

Ve studii Becka a kol. (1992) bylo 457 pacientů randomizováno do tří skupin: jedna dostávala intravenózní methylprednisolon v dávce 1 g/den po dobu 3 dnů, následovaný přechodem na perorální prednison v dávce 1 mg/kg/den po dobu 11 dnů. Druhá skupina dostávala perorální prednison v dávce 1 mg/kg/den po dobu 14 dnů a třetí dostávala placebo po stejnou dobu. 15. den byl hodnocen stupeň obnovení zrakových funkcí; stav zorných polí a kontrastní citlivost (ale nikoli zraková ostrost) byly lepší ve skupině pacientů, kteří dostávali intravenózní methylprednisolon, než v ostatních dvou skupinách. Do 6. měsíce po léčbě bylo zachováno mírné, ale klinicky významné zlepšení sledovaných parametrů. Po 2 letech sledování byla míra relapsu optické neuritidy významně vyšší u pacientů užívajících prednison (27 %) než u pacientů užívajících methylprednisolon (13 %) nebo placebo (15 %). Z pacientů, kteří při vstupu do studie nesplňovali kritéria pro definitivní nebo pravděpodobnou roztroušenou sklerózu, mělo 13 % (50 z 389) druhou recidivu do 2 let, která by umožnila diagnostikovat onemocnění. Riziko bylo vyšší v případech, kdy magnetická rezonance při vstupu odhalila alespoň dvě léze s typickými velikostmi a lokalizacemi pro roztroušenou sklerózu. V této skupině bylo riziko relapsu významně nižší u intravenózního methylprednisolonu (16 %) než u prednisonu (32 %) nebo placeba (36 %). Účinek intravenózního methylprednisolonu na zpomalení progrese klinicky významné roztroušené sklerózy však nebyl udržen 3 a 4 roky po léčbě.

Na základě těchto výsledků lze k léčbě exacerbací optické neuritidy za přítomnosti abnormálních nálezů na MRI doporučit vysoké dávky methylprednisolonu intravenózně, pokud ne k urychlení zotavení, tak k oddálení rozvoje klinicky zjevné roztroušené sklerózy.

Následné studie porovnávající perorální glukokortikoidy (prednison a methylprednisolon) se standardními dávkami intravenózního methylprednisolonu při léčbě exacerbací však neprokázaly žádný přínos z vysokých dávek intravenózního methylprednisolonu. Výsledky této studie je však třeba vnímat s opatrností, protože byly použity neekvivalentní dávky, nebyla zde kontrolní skupina a zlepšení při intravenózní terapii, které bylo prokázáno v jiných studiích, nebylo prokázáno. Navíc k posouzení účinku nebyla použita magnetická rezonance (MRI). Proto jsou k posouzení užitečnosti intravenózních glukokortikoidů zapotřebí přesvědčivější klinické studie zahrnující posouzení hematoencefalické bariéry (včetně MRI).

Chronická imunosuprese v léčbě roztroušené sklerózy

[ 1 ], [ 2 ]

Imunosuprese cyklofosfamidem

Cytotoxické léky se používají k navození dlouhodobé remise u pacientů s rychle progredující roztroušenou sklerózou. Nejlépe studovaným lékem z hlediska jeho účinnosti u roztroušené sklerózy je cyklofosfamid, alkylační činidlo vyvinuté před více než 40 lety pro léčbu rakoviny. Cyklofosfamid má na dávce závislý cytotoxický účinek na leukocyty a další rychle se dělící buňky. Zpočátku se počet lymfocytů snižuje více než počet granulocytů, zatímco vyšší dávky ovlivňují oba typy buněk. Při dávce nižší než 600 mg/m² ^se počet B buněk snižuje ve větší míře než počet T buněk a lék ovlivňuje CD8 lymfocyty ve větší míře než CD buňky. Vyšší dávky ovlivňují oba typy T buněk stejně. Dočasné stabilizace až na 1 rok u pacientů s rychle progredujícím onemocněním se dosahuje intravenózním podáváním vysokých dávek cyklofosfamidu (400–500 mg denně po dobu 10–14 dnů), což snižuje počet bílých krvinek o 900–2000 buněk/ ^mm³. Tyto studie nedokázaly udržet zaslepení kvůli neočekávanému rozvoji alopecie u pacientů užívajících cyklofosfamid. Obnovení progrese po 1 roce bylo zaznamenáno u dvou třetin intenzivně léčených pacientů, což vyžadovalo opakovanou indukci remise vysokou dávkou cyklofosfamidu nebo jednorázovou měsíční („booster“) dávkou 1 mg. Tento léčebný režim byl účinnější u mladších jedinců s kratším trváním onemocnění. Jiná randomizovaná, placebem kontrolovaná studie nepotvrdila účinnost indukce remise cyklofosfamidem.

Jiné studie potvrdily účinnost udržovacích režimů s cyklofosfamidem podávaných primárně nebo po indukčním režimu u pacientů se sekundárně progresivním nebo remitujícím onemocněním. Měsíční „booster“ podávání cyklofosfamidu po indukčním režimu může významně (až o 2,5 roku) oddálit nástup rezistence na léčbu u pacientů mladších 40 let se sekundárně progresivní roztroušenou sklerózou. Použití léku je však významně omezeno jeho vedlejšími účinky, včetně nevolnosti, zvracení, alopecie a hemoragické cystitidy. V současné době se cyklofosfamid používá u malé části mladých pacientů schopných samostatného pohybu, jejichž onemocnění je rezistentní na jiné léčebné metody a nadále progreduje.

Imunosuprese kladribinem

Kladribin (2-chlordeoxyadenosin) je purinový analog, který je rezistentní vůči deaminaci adenosindeaminázou. Kladribin má selektivní toxický účinek na dělící se a klidové lymfocyty tím, že ovlivňuje bypassovou dráhu, kterou tyto buňky přednostně používají. Jedna léčebná kúra může vyvolat lymfopenii, která přetrvává až 1 rok. Ačkoli jedna dvojitě zaslepená zkřížená studie ukázala, že léčba vedla ke stabilizaci pacientů s rychle progredujícím onemocněním, tyto výsledky nebyly reprodukovány u pacientů s primární nebo sekundárně progresivní roztroušenou sklerózou. Kladribin může potlačit funkci kostní dřeně a ovlivnit tvorbu všech krevních elementů. Významný pokles počtu lymfocytů s markery CD3, CD4, CD8 a CD25 přetrvává jeden rok po léčbě. Kladribin v současnosti zůstává experimentální léčbou.

Imunosuprese migoxantronem

Mitoxantron je anthracendionové protinádorové léčivo, které inhibuje syntézu DNA a RNA. Účinnost léčiva byla studována u pacientů s relabující-remitující i sekundárně progresivní roztroušenou sklerózou, přičemž dávky 12 mg/m2 ^a 5 mg/ ^m2 byly podávány intravenózně každé 3 měsíce po dobu 2 let. Výsledky ukazují, že ve srovnání s placebem vede vyšší dávka mitoxantronu k významnému snížení frekvence exacerbací a počtu nových aktivních lézí na MRI a také snižuje rychlost akumulace neurologického defektu. Mitoxantron je obecně dobře snášen. Jeho schopnost způsobovat kardiotoxicitu je však obzvláště znepokojivá, a proto se doporučuje omezit celkovou dávku mitoxantronu užívanou během života. V tomto ohledu ^může kontinuální čtvrtletní podávání léčiva v dávce 12 mg/m2 pokračovat maximálně po dobu 2–3 let. V současné době je lék schválen pro použití u pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou (s tendencí k progresi a neúčinností jiných léků) a sekundárně progresivní roztroušenou sklerózou.

Jiné imunosupresivní látky

Potřeba dlouhodobé léčby roztroušené sklerózy si vynutila studium a použití jiných imunosupresivních látek, které by byly bezpečnější pro dlouhodobé podávání. Vzhledem k tomu, že studie ukázaly, že některé z těchto látek mají částečný účinek a poněkud zpomalují progresi onemocnění, stále se používají u určité části pacientů.

Azathioprin

Azathioprin je antagonista purinových receptorů, který se ve střevní stěně, játrech a červených krvinkách přeměňuje na svůj aktivní metabolit 6-merkaptopurin. Léčivo se primárně používá k prevenci odmítnutí alograftu, k potlačení reakce roubované tkáně proti hostiteli a k léčbě revmatoidní artritidy rezistentní na jiné druhy léčby. 6-merkaptopurin inhibuje aktivitu enzymů, které zajišťují produkci purinů, což vede k vyčerpání buněčných rezerv purinů a potlačení syntézy DNA a RNA. V důsledku toho má léčivo opožděný toxický účinek na leukocyty, které jsou relativně selektivní pro replikující se buňky reagující na antigeny. U neurologických onemocnění se azathioprin obzvláště široce používá u myasthenia gravis a roztroušené sklerózy v dávkách 2,0 až 3,0 mg/kg/den. U pacientů s roztroušenou sklerózou však byl prokázán pouze omezený terapeutický účinek léčiva. Tříletá, dvojitě zaslepená, randomizovaná studie provedená britsko-nizozemskou skupinou pro studium azathioprinu u pacientů s roztroušenou sklerózou (1988), do které bylo zařazeno 354 pacientů, ukázala, že průměrné skóre EEDS se během léčby snížilo o 0,62 bodu, zatímco během placeba se snížilo o 0,8 bodu. Mírný pokles průměrné frekvence exacerbací z 2,5 na 2,2 nebyl statisticky významný. Jiná studie prokázala mírný pokles frekvence exacerbací, který byl výraznější ve druhém roce léčby. Rozsáhlá metaanalýza zaslepených studií azathioprinu potvrdila malé rozdíly ve prospěch pacientů léčených azathioprinem, které se projevily až ve druhém a třetím roce léčby.

S léčbou azathioprinem je spojeno minimální dlouhodobé riziko, spojené s mírným zvýšením pravděpodobnosti vzniku rakoviny, ale to se zjistí až tehdy, když doba léčby přesáhne 5 let. Nežádoucí účinky na gastrointestinální trakt mohou vést k mukozitidě, jejíž projevy (pokud jsou mírné) lze zmírnit snížením dávky nebo užíváním léku s jídlem.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ]

Cyklosporin

Cyklosporin A je izolován z půdní houby Tolypocladium inflatum. Blokuje proliferaci autoreaktivních T-lymfocytů inhibicí signálních transdukčních drah, je účinný v prevenci odmítnutí štěpu při transplantaci orgánů a zlepšuje výsledky alogenní transplantace kostní dřeně. Cyklosporin se váže na intracelulární imunofilinové receptory a působí na kalneurin a serin-threonin fosfatázu. Podávání cyklosporinu pacientům s rychle progredující roztroušenou sklerózou v dávkách dostatečných k udržení jeho koncentrace v krvi na 310-430 ng/ml po dobu 2 let vedlo ke statisticky významnému, ale mírnému snížení závažnosti funkční poruchy a oddálilo dobu, kdy se pacient stal upoután na invalidní vozík. V průběhu studie však významný počet pacientů vypadl ze skupiny s cyklosporinem (44 %) i ze skupiny s placebem (33 %). Počáteční dávka byla 6 mg/kg/den, následně upravena tak, aby se hladina kreatininu v séru nezvýšila více než 1,5krát oproti počáteční hladině. Nefrotoxicita a arteriální hypertenze byly dvě nejčastější komplikace, které vyžadovaly vysazení léku. Další dvouletá randomizovaná dvojitě zaslepená studie prokázala příznivý vliv léku na rychlost progrese roztroušené sklerózy, frekvenci jejích exacerbací a závažnost funkční poruchy. Obecně je použití cyklosporinu u roztroušené sklerózy omezeno kvůli nízké účinnosti, nefrotoxicitě a možnosti dalších nežádoucích účinků spojených s dlouhodobým užíváním léku.

[ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Methotrexát

Perorální podávání malých dávek methotrexátu se ukázalo jako účinná, relativně netoxická metoda léčby různých zánětlivých onemocnění, především revmatoidní artritidy a psoriázy. Methotrexát, antagonista kyseliny listové, inhibuje různé biochemické reakce a ovlivňuje syntézu proteinů, DNA a RNA. Mechanismus účinku methotrexátu u roztroušené sklerózy zůstává neznámý, ale bylo zjištěno, že lék inhibuje aktivitu IL-6, snižuje hladinu receptorů IL-2 a TNFα a má antiproliferativní účinek na mononukleární buňky. U relabující-remitující roztroušené sklerózy užívání methotrexátu významně snižuje frekvenci exacerbací. 18měsíční studie však neprokázala účinnost léku v sekundárně progresivním průběhu. Ve velké, randomizované, dvojitě zaslepené studii s 60 pacienty se sekundárně progresivním onemocněním nízká dávka methotrexátu (7,5 mg týdně) nezabránila zhoršení chůze, ale zachovala funkci horních končetin. Methotrexát je tedy relativně bezpečnou léčbou pro pacienty s progresivní roztroušenou sklerózou, kteří si zachovávají samostatnou chůzi.

Další metody nespecifické imunoterapie

Totální ozáření lymfatických uzlin

Totální ozáření lymfatických uzlin se používá k léčbě malignit i autoimunitních onemocnění, včetně Hodgkinovy choroby a revmatoidní artritidy, rezistentních na jiné druhy léčby. Tato metoda navíc prodlužuje přežití štěpu u transplantovaných orgánů a způsobuje dlouhodobou imunosupresi s absolutním poklesem počtu lymfocytů. Ve dvou dvojitě zaslepených, placebem kontrolovaných studiích (kontrolní skupina dostávala simulované ozáření) totální ozáření lymfatických uzlin v dávce 1980 c1p po dobu 2 týdnů zpomalilo progresi onemocnění. Účinek koreloval se stupněm lymfopenie a byl prodloužen podáváním nízkých dávek glukokortikoidů.

Plazmaferéza

Existují zprávy o schopnosti plazmaferézy stabilizovat stav pacientů s fulminantními formami demyelinizace CNS, včetně akutní diseminované encefalomyelitidy. U pacientů s roztroušenou sklerózou plazmaferéza v kombinaci s ACTH a cyklofosfamidem urychlila zotavení pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou, ale po roce nebyl pozorován žádný významný klinický účinek. V malé randomizované, jednoduše zaslepené zkřížené studii u pacientů se sekundárně progresivním onemocněním srovnání plazmaferézy a azathioprinu neodhalilo významné rozdíly v počtu aktivních lézí podle MRI dat.

Intravenózní imunoglobulin

Dvojitě zaslepená, randomizovaná studie ukázala, že intravenózní imunoglobulin, podávaný měsíčně v dávce 0,2 g/kg po dobu 2 let, může snížit frekvenci exacerbací a závažnost neurologického postižení u pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou. Tyto výsledky však vyžadují potvrzení. Stejně jako plazmaferéza se imunoglobulin používá ke stabilizaci pacientů s ADEM a fulminantními formami roztroušené sklerózy. Léčivo je v současné době testováno v léčbě rezistentních forem optické neuritidy a sekundárně progresivní roztroušené sklerózy. Obecně platí, že místo intravenózního imunoglobulinu v léčbě roztroušené sklerózy, stejně jako optimální schéma jeho použití, zůstávají nejasné.

Glatiramer acetát

Glatiramer-acetát, dříve nazývaný kopolymer, byl schválen pro použití u pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou v roce 1996. Léčivo se podává subkutánně denně v dávce 20 mg. Hladiny léčiva v krvi jsou nedetekovatelné. Léčivo je směsí syntetických polypeptidů sestávajících z acetátových solí čtyř L-aminokyselin - glutaminu, alaninu, tyrosinu a lysinu. Po injekci se glatiramer-acetát rychle rozkládá na menší fragmenty. Léčivo se používá ke snížení frekvence exacerbací u pacientů s relaps-remitující roztroušenou sklerózou. V hlavní klinické studii fáze III glatiramer-acetát snížil frekvenci exacerbací o třetinu. Výraznější snížení frekvence exacerbací bylo zaznamenáno u pacientů s minimální nebo mírnou funkční poruchou. V místě injekce se mohou vyskytnout mírné kožní reakce, včetně erytému nebo edému. Ačkoli léčivo zřídka způsobuje systémové nežádoucí účinky, jeho použití může být omezeno u pacientů, u kterých se bezprostředně po podání objeví „vazogenní“ reakce. Z hlediska bezpečnosti během březosti je lék klasifikován jako kategorie C, což naznačuje absenci komplikací při podávání březím zvířatům, zatímco interferony jsou klasifikovány jako kategorie B. Proto by v případě březosti měla být mezi imunomodulačními látkami dána přednost glatiramer-acetátu.

Glatiramer-acetát je jedním z řady léků vyvinutých ve Weizmannově institutu na začátku 70. let 20. století ke studiu experimentální alergické encefalomyelitidy. Obsahuje aminokyseliny, které jsou hojně obsaženy v myelinovém bazickém proteinu. Léčivo však u řady laboratorních zvířat, kterým byl injekčně podán extrakt z bílé hmoty nebo myelinový bazický protein s kompletním Freundovým adjuvans, nezpůsobilo EAE, ale naopak zabránilo jeho rozvoji. Ačkoli mechanismus účinku není znám, předpokládá se, že se váže přímo na molekuly MHC třídy II za vzniku komplexu nebo že brání jejich vazbě na myelinový bazický protein. Možná je také indukce supresorových buněk specifických pro myelinový bazický protein.

Výsledky hlavní studie replikovaly výsledky dřívější placebem kontrolované studie, která zjistila významné snížení míry relapsů a zvýšení podílu pacientů bez relapsu. Dvoucentrická studie však neprokázala významné zpomalení progrese funkční poruchy u sekundárně progresivní roztroušené sklerózy, ačkoli jedno centrum prokázalo mírný, ale statisticky významný účinek.

Hlavní studie fáze III byla provedena u 251 pacientů v 11 centrech a odhalila, že zavedení glatiramer-acetátu významně snížilo frekvenci exacerbací, zvýšilo podíl pacientů bez exacerbací a prodloužilo dobu do první exacerbace u pacientů. Schopnost léku zpomalit progresi neurologického defektu byla nepřímo doložena skutečností, že u většího podílu pacientů léčených placebem došlo ke zhoršení EDSS o 1 bod nebo více a že u většího podílu pacientů léčených aktivním lékem došlo ke zlepšení skóre EDSS o 1 bod nebo více. Procento pacientů, jejichž stav se nezhoršil, však bylo v obou skupinách přibližně stejné. Nežádoucí účinky během léčby glatiramer-acetátem byly obecně minimální ve srovnání s účinky během léčby interferony. U 15 % pacientů se však vyskytla přechodná reakce charakterizovaná návaly horka, pocitem svírání hrudníku, palpitacemi, úzkostí a dušností. Podobné pocity se vyskytly pouze u 3,2 % pacientů léčených placebem. Tato reakce, jejíž příčina není známa, trvá 30 sekund až 30 minut a není doprovázena změnami na EKG.