Karyotypizace

Ke studiu chromozomů se nejčastěji používají krátkodobé hemokultury, buňky kostní dřeně a fibroblastové kultury. Krev s antikoagulantem dodaná do laboratoře se centrifuguje, aby se erytrocyty sedimentovaly, a leukocyty se inkubují v kultivačním médiu po dobu 2–3 dnů. Do vzorku krve se přidává fytohemaglutinin, protože urychluje aglutinaci erytrocytů a stimuluje dělení lymfocytů. Nejvhodnější fází pro studium chromozomů je metafáze mitózy, proto se v této fázi používá kolchicin k zastavení dělení lymfocytů. Přidání tohoto léku do kultury vede ke zvýšení podílu buněk v metafázi, tj. ve fázi buněčného cyklu, kdy jsou chromozomy nejviditelnější. Každý chromozom se replikuje (produkuje svou vlastní kopii) a po vhodném barvení je viditelný jako dvě chromatidy připojené k centromeře neboli centrální konstrikci. Buňky se poté ošetří hypotonickým roztokem chloridu sodného, fixují a barví.

Pro barvení chromozomů se nejčastěji používá barvivo Romanovského-Giemsy, 2% acetkarmín nebo 2% acetarsein. Barví chromozomy celé, rovnoměrně (rutinní metoda) a lze je použít k detekci numerických anomálií lidských chromozomů.

Pro získání detailního obrazu struktury chromozomů, identifikaci (definování) jednotlivých chromozomů nebo jejich segmentů se používají různé metody diferenciálního barvení. Nejčastěji používanými metodami jsou Giemsova metoda, dále G- a Q-pruhování. Při zkoumání preparátu mikroskopií podél délky chromozomu se odhalí řada obarvených (heterochromatin) a neobarvených (euchromatinový) pruhů. Povaha takto získaného příčného pruhování umožňuje identifikaci každého chromozomu v sadě, protože střídání pruhů a jejich velikosti jsou pro každý pár přísně individuální a konstantní.

Metafázové destičky jednotlivých buněk se vyfotografují. Jednotlivé chromozomy se z fotografií vystřihnou a nalepí se v pořadí na list papíru; tento obrázek chromozomů se nazývá karyotyp.

Použití dodatečného barvení, stejně jako nové metody pro získávání chromozomálních preparátů, které umožňují natažení chromozomů na délku, významně zvyšují přesnost cytogenetické diagnostiky.

Pro popis lidského karyotypu byla vyvinuta speciální nomenklatura. Normální karyotyp muže a ženy je označen jako 46, XY a 46, XX. U Downova syndromu, charakterizovaného přítomností dalšího chromozomu 21 (trisomie 21), je karyotyp ženy popsán jako 47, XX 21+ a u muže 47, XY, 21+. V případě strukturální anomálie chromozomu je nutné označit změněné dlouhé nebo krátké raménko: písmeno p označuje krátké raménko, q označuje dlouhé raménko a t označuje translokaci. V případě delece krátkého raménka chromozomu 5 (syndrom cri du chat) je tedy ženský karyotyp popsán jako 46, XX, 5p-. Matka dítěte s translokačním Downovým syndromem, nositelka balancované translokace 14/21, má karyotyp 45, XX, t(14q; 21q). Translokační chromozom vzniká fúzí dlouhých ramen chromozomů 14 a 21 a krátká ramena se ztrácejí.

Každé rameno je rozděleno na oblasti, které jsou dále rozděleny na segmenty, které jsou označeny arabskými číslicemi. Centromera chromozomu je výchozím bodem pro počítání oblastí a segmentů.

Pro topografii chromozomů se tedy používají čtyři označení: číslo chromozomu, symbol raménka, číslo oblasti a číslo segmentu v oblasti. Například položka 6p21.3 znamená, že mluvíme o chromozomu 6 6. páru, jeho krátkém raménku, oblasti 21, segmentu 3. Existují také další symboly, zejména pter - konec krátkého raménka, qter - konec dlouhého raménka.

Cytogenetická metoda výzkumu umožňuje detekci delecí a dalších změn v chromozomech o velikosti pouze přibližně 1 milionu bází (nukleotidů).

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]