Diagnostika herpesu

Diagnóza herpes viru je založena na klasické izolaci viru na citlivých buněčných kulturách, imunofluorescenčních a sérologických metodách, kolposkopickém vyšetření a použití moderních molekulárně biologických metod (PCR, dot hybridizace), které umožňují diagnostikovat celou skupinu herpes virů, včetně typů HHV-6 a HHV-7.

Laboratorní diagnostické metody pro herpetickou infekci

Hlavní metody zaměřené na izolaci HSV nebo detekci virových částic a/nebo jejich složek	Pomocné metody zaměřené na detekci protilátek proti HSV v biologických tekutinách lidského těla
Izolace HSV v citlivých buněčných a zvířecích kulturách Přímá a imunitní elektronová mikroskopie Přímé a nepřímé varianty IPA IFA Molekulárně biologické metody Latexová aglutinační reakce	Neutralizační reakce RSC Stanovení protilátek proti nestrukturálním proteinům HSV-1,2

Bylo prokázáno, že u 76 % pacientů je genitální herpes (GH) způsoben virem HSV-2 a u 24 % virem HSV-1. GH se jako monoinfekce vyskytl pouze u 22 % pacientů, přičemž v 78 % případů byly zjištěny mikrobiální asociace. U 46 % jedinců byla zjištěna parazitocenóza způsobená dvěma patogeny, včetně chlamydií zjištěných ve 40 % případů. Gardnerella, Trichomonas a gonokoky byly v nátěrech detekovány méně často.

U 27 % pacientů byla parazitocenóza zastoupena třemi patogeny, u 5,2 % čtyřmi patogeny. Nejčastěji byla zaznamenána kombinace chlamydií s gardnerellou a plísněmi Candida. Tato data potvrzují potřebu důkladného bakteriologického vyšetření pacientů s GH za účelem identifikace kombinací patogenních agens, jakož i hloubkové studie patogeneze smíšených infekcí urogenitálního traktu, což umožní diferencovanou komplexní terapii herpes infekce.

Materiály studované pro izolaci HSV v závislosti na lokalizaci herpetických lézí

Lokalizace lézí	Obsah vezikul	Seškrábání buněk				Mozkomíšní mok	Bronchiální aspirát	Biopsie	Krev
		1	2	3	4
Kůže	+								+
Oči			+						+
Pohlavní orgány				+					+
Anus	+				+				+
Ústa	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Plíce		+					+		+
Játra								+	+
Vrozený herpes	+	+	+				+		+

Metody laboratorní diagnostiky cytomegalovirové infekce

Metody	Čas potřebný k získání výsledků	Poznámky
VIROLOGICKÉ
Elektronová mikroskopie	3 hodiny	Není moc přístupné
Izolace viru v buněčné kultuře (VCI)	4–20 dní	Standardní, Pomalý
Imunofluorescenční barvení časné AG pomocí monoklonálních protilátek	6 hodin	Méně specifické
CYTOLOGICKÉ	2–3 hodiny	Méně specifické
SÉROLOGICKÉ
RSC	2 dny	Norma
RGA	1 den	Náročná práce
ÚTES	6 hodin	Jednoduché, konkrétní
NRIF	6 hodin	Obtížný
RIMP	6 hodin	Obtížný
ELISA (IgM, DO)	6 hodin	Rychlé, jednoduché
Imunoblot	6 hodin	Drahý
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGICKÉ
MG	5–7 dní	Drahé, pracné
PCR	3 hodiny	Drahý

Metody diagnostiky viru herpes zoster

Diagnostické metody	Laboratorní techniky
NEPŘÍMÝ
Výběr	Tkáňové kultury, kuřecí embrya, laboratorní zvířata, kokultivace s permisivními buňkami nebo pomocnými viry
Identifikace izolátů	Neutralizační reakce, RSC, IF, PIEF, precipitační reakce izolátů, aglutinace, IF
ŘÍDIT
Cytologie	Nátěry: barevná imunofluorescence
Histologie	Patomorfologie buňky
Struktura	Embryonální mikroskopie, imunoelektronová mikroskopie
Stanovení antigenů	IF, PIEF, RIM, IFA
Stanovení lokální produkce protilátek	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekulárně biologické přístupy	Molekulární hybridizace, PCR

Laboratorní diagnostika infekce způsobené virem herpes zoster

Diagnostické problémy	Metody	Očekávané výsledky
Akutní primární infekce	1	Detekce do 2 hodin
	2	Hladiny protilátek pomalu stoupají
	3	Projevuje se 3 dny po infekci
Akutní reaktivovaná infekce	1	Detekce UUU po 2 hodinách
	2	Hladiny protilátek pomalu stoupají
	4	Objeví se 4 dny po objevení vyrážky

1. stanovení vezikul VEGF v kapalině;
2. sérologie: CSC, ELISA, zaměřená na detekci
3. sérologie: ELISA zaměřená na detekci IgM;
4. sérologie: ELISA zaměřená na detekci IgA, IgM.

Metody pro indikaci imunitní odpovědi na infekci virem herpes zoster

Přístup	Metoda
Detekce zvýšení titru protilátek ve druhém séru	RSK, RTGA, RPGA, IF neutralizační reakce, RIM, ELISA
Detekce specifických protilátek třídy Ig G a Ig A v prvním vzorku séra	ELISA, IF, RIM, latexová aglutinace

Interpretace výsledků sérologického vyšetření sér pacientů na herpesvirové infekce (ELISA)

Název infekce/markeru	Průměrné prahové hodnoty pro infekce
	Výsledky analýzy	Výklad
Cytomegalie Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100–300 %)	Pozitivní 1–6 Pozitivní 6–10 Pozitivní >10 Negativní Pozitivní 100–300 Negativní	Remise Exacerbace onemocnění Akutní fáze onemocnění Bez infekce (onemocnění) Akutní fáze onemocnění Analýzu opakujte za 2–3 týdny
Herpes simplex 1, 2 sérotypy Anti-HSV 1/2 celkem (100-900 %)	Pozitivní 100–400 Pozitivní 400–800 Pozitivní >800 Negativní	Remise Exacerbace onemocnění Akutní fáze onemocnění Bez infekce (onemocnění)

Tabulka uvádí hlavní metody laboratorní diagnostiky herpesvirových infekcí a také doporučené biologické materiály, které se vyšetřují při izolaci HSV, s přihlédnutím k lokalizaci herpetických lézí.

Spolehlivá izolace virů herpes simplex a CMV infekcí citlivých buněčných kultur. Během virologického vyšetření 26 pacientů v období relapsu byl tedy HSV izolován na citlivé buněčné kultuře Vero ve 23 případech (88,4 %). Infikované kultury vykazovaly obraz cytopatického působení typického pro HSV - tvorbu mnohojaderných obrovských buněk nebo akumulaci zaoblených a zvětšených buněk ve formě shluků. V 52,1 % případů bylo možné detekovat ložiska cytopatického působení viru již 16–24 hodin po infekci. Po 48–72 hodinách inkubace infikovaných kultur se procento materiálů způsobujících specifickou destrukci buněk zvýšilo na 87 %. A pouze ve 13 % případů byly pozitivní výsledky detekovány 96 hodin po infekci nebo déle, nebo při opakovaném pasážování.

Metody laboratorní diagnostiky generalizované herpes infekce

Hlavní metody zaměřené na detekci (izolaci) herpesvirů, jejich částic a jejich složek	Pomocné metody zaměřené na detekci protilátek proti herpes virům v biologických tekutinách, detekce enzymatických posunů v krevním séru
Izolace herpesvirů na citlivých buněčných a zvířecích kulturách. Přímá a imunoelektronová mikroskopie. Přímé a nepřímé varianty imunoperoxidázové metody. Přímé a nepřímé varianty fluorescenční protilátkové metody. Varianty enzymové imunoanalýzy na pevné fázi. Varianty molekulární (DNA-DNA) hybridizační metody. Polymerázová řetězová reakce. Latexová aglutinační reakce.	Neutralizační test Test fixace komplementu Latexový aglutinační test Nepřímá verze metody s fluorescenčními protilátkami Nepřímá verze imunoperoxidázové metody Varianty enzymově-imunoanalýzy na pevné fázi Metoda imunoblotování Metoda radiální fixace komplementu Stanovení hladin alanin a aspartátaminotransferázy

K diagnostice infekční mononukleózy (infekce způsobené virem EBV) se používají sérologické metody. Používá se Paulova-Bunnelova reakce s erytrocyty berana, diagnostický titr 1:28 nebo vyšší v jednom testu krevního séra nebo 4násobné zvýšení protilátek při vyšetření párových sér. Používá se Hoffova-Bauerova reakce se 4% suspenzí formalinizovaných koňských erytrocytů. Výsledek se bere v úvahu po 2 minutách; u infekční mononukleózy je reakce vysoce specifická.

V současné době se vyvíjí metoda enzymatické imunoanalýzy (EIA) pro diagnostiku infekční mononukleózy. V tomto případě se protilátky IgG a IgM v séru pacienta stanovují inkubací s lymfoblasty infikovanými EBV a následnou léčbou fluorescenčními protilátkami. V akutním období onemocnění se protilátky proti kapsidovému antigenu viru stanovují v titru 1:160 a vyšším.

Při použití řady dovážených komerčních testovacích systémů dokáže ELISA detekovat: protilátky proti obalovým protilátkám EBV, protilátky proti časnému antigenu EBV, celkové protilátky proti časnému antigenu EBV, stanovené v akutní fázi onemocnění jak v jádře, tak v cytoplazmě buněk, a omezené protilátky proti časnému antigenu EBV, stanovené v akutní fázi onemocnění jak v jádře, tak v cytoplazmě buněk, omezené protilátky proti časnému antigenu EBV, stanovené na vrcholu onemocnění pouze v cytoplazmě buněk, a protilátky proti jadernému antigenu EBV. Použití těchto testovacích systémů umožňuje diferenciální diagnostiku řady onemocnění spojených s EBV.

Po pozitivním výsledku ELISA testu, který odhalí protilátky proti EBV, se provede konfirmační imunoblotovací reakce, která stanoví přítomnost protilátek proti jednotlivým markerovým proteinům EBV (p-proteinům): p23, p54, p72 (přítomnost tohoto proteinu naznačuje možnost reprodukce EBV), p 138. Výše uvedené laboratorní metody se používají také ke sledování účinnosti léčby.

Citlivost virologických metod je 85-100 %, specificita je 100 %, doba studie je 2-5 dní. V praxi se často používá metoda přímé imunofluorescence (DIF) s polyklonálními nebo monoklonálními protilátkami proti HSV-1 a HSV-2. Metoda DIF je poměrně snadno reprodukovatelná v běžné klinické laboratoři, není nákladná, citlivost je nad 80 %, specificita je 90-95 %. Imunofluorescenční mikroskopie odhalila přítomnost cytoplazmatických inkluzí, morfologické znaky, procento infikovaných buněk ve stěrech-škrábech z močové trubice, cervikálního kanálu, děložního čípku a konečníku.

Metoda PIF poskytuje představu o morfologických vlastnostech buněk a změnách v lokalizaci antigenů HSV. Kromě přímých známek poškození buněk herpes viry (detekce specifické luminiscence) existují podle dat PIF i nepřímé známky herpes infekce:

• agregace jaderné hmoty, oddělení karyolemmy;
• přítomnost tzv. „děrových“ jader, kdy z buněčného jádra zůstává pouze jedna karyolemma;
• přítomnost intranukleárních inkluzí - Cowdryho tělísek.

Při provádění PIF lékař získává nejen kvalitativní, ale i kvantitativní hodnocení stavu infikovaných buněk, které jsme použili k posouzení účinnosti antivirové terapie acyklovirem (AC). Metodou PIF bylo tedy v dynamickém režimu vyšetřeno 80 pacientů s jednoduchým genitálním herpesem (GH). Ukázalo se, že pokud před léčbou acyklovirem mělo 88 % pacientů vysoké procento infikovaných buněk (50-75 % a více) v nátěrech, pak po jedné kúře acyklovirem byly zdravé buňky detekovány v nátěrech u 44 % pacientů, v 31 % případů byly zaznamenány jednotlivé infikované buňky a u 25 % pacientů bylo infikovaných buněk až 10 %.

Obsah infikovaných buněk v nátěrech (PIF reakce) u pacientů s genitálním herpesem léčených acyklovirem

Období nemoci	Procentuální obsah v nátěrech
	Infikované buňky					Normální buňky
	Více než 75 %	50–75 %	40–50 %	10 %	Jednotlivé buňky v zorném poli
Recidiva (před léčbou)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remise (po léčbě)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Při použití PIF a metody tečkové hybridizace po mnoho let bylo zjištěno, že výsledky studie se shodují téměř ve 100 % případů. Je třeba poznamenat, že pro zvýšení spolehlivosti diagnózy herpesu, zejména v případech subklinických a málo manifestních forem herpesu, se doporučuje v práci použít 2–3 metody laboratorní diagnostiky, a to zejména při vyšetřování těhotných žen, žen s nepříznivou porodnickou anamnézou a osob s nespecifikovanou gynekologickou diagnózou.

Při PCR diagnostice virových a bakteriálních infekcí urogenitálního traktu je tedy nutné vyhodnotit získané pozitivní výsledky s ohledem na anamnézu, přítomnost (nebo absenci) specifických klinických příznaků onemocnění. Pokud jsou chlamydie detekovány pomocí PCR, pak je v tomto případě vysoká pravděpodobnost infekce a otázky terapie lze odpovídajícím způsobem řešit. V případě detekce mykoplazmat (ureaplazmat), což jsou oportunní mikroorganismy, jsou k potvrzení diagnózy nutné další kultivační vyšetření, tj. výsev materiálu od pacienta na citlivé buněčné kultury. Pouze v případě pozitivních výsledků kultivační analýzy lze hovořit o laboratorním potvrzení diagnózy mykoplazmózy. Stejná metoda umožní v případě potřeby stanovit citlivost izolovaných mykoplazmat na často používané lékové formy (antibiotika, fluorochinolony atd.).

Současná infekce několika viry z čeledi Herpesviridae je možná. Často jsme u jednoho pacienta detekovali infekci viry HSV-1, HSV-2 a CMV. Pacienti s klinickými a laboratorními projevy sekundárního IDS (onkologičtí, onkologičtí, HIV-infikovaní pacienti) byli významně častěji infikováni několika herpesviry. Ukázalo se tedy, že klinické a imunologické poruchy progredující při HIV infekci jsou doprovázeny zvýšením počtu herpesvirů detekovaných metodou molekulární hybridizace. V tomto případě lze za prognosticky nejvýznamnější považovat komplexní simultánní detekci DNA typu HSV-1, CMV a HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]