Nevirová genová terapie nabízí naději na chronické bolesti dolní části zad

V nedávné studii publikované v žurnálu Biomaterials výzkumníci vyvinuli novou nevirovou genovou terapii k léčbě diskogenní bolesti zad (DBP) dodáním transkripčního faktoru Forkhead Box F1 (FOXF1) využívající upravené extracelulární vezikuly (eEV) do degenerativních meziobratlových plotének (IVD) in vivo.

Chronická bolesti v kříži (LBP) jsou rostoucím globálním problémem v důsledku stárnutí populace a zhoršujících se problémů s opioidy. Současné způsoby léčby zahrnují krátkodobou úlevu nebo drahé operace, což zdůrazňuje potřebu nenávykových a méně invazivních terapií.

Současné biologické terapie, včetně podávání růstových faktorů, buněčné terapie a virových genových terapií, mohou snížit degeneraci u zvířecích a lidských modelů. Nicméně obavy, jako jsou krátkodobé účinky, špatná dlouhodobá účinnost a zbytečná imunogenicita a tumorigenicita, mohou bránit přímé aplikaci těchto metod.

V této studii vědci zavedli nevirovou genovou terapii degenerace meziobratlové ploténky (IVD) pomocí FOXF1-eEV.

Výzkumníci transfekovali primární myší embryonální fibroblasty (PMEF) plazmidem obsahujícím FOXF1 nebo pCMV6 jako kontrolu a charakterizovali vzorky eEV pomocí testu sledování nanočástic (NTA).

Posuzovali účinné nakládání molekulárního nákladu do eEV pomocí kvantitativní reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (qRT-PCR) a konvenční PCR. Analýza Western blot identifikovala FOXF1 a specifické EV proteiny v eEV formacích. Tým použil plazmidy, které zesilují upstream a downstream polylinkerové oblasti, aby určil přítomnost FOXF1 plazmidové DNA v dárcovských buňkách a vytvořil eEV.

Zkoumali mRNA plné délky produkovanou z plazmidové DNA v eEV a dárcovských buňkách.

Výzkumníci vytvořili extracelulární vezikuly s transkripčními faktory, aby obnovili funkci tkáně a upravili reakce na bolest ve zvířecím modelu DBP.

Na myším modelu diskogenní bolesti zad identifikovali EV pro transport a distribuci FOXF1 do poškozených meziobratlových plotének, aby určili FOXF1 eEV inhibici degenerace meziobratlových plotének.

Tým kombinoval biomechanické testování myších meziobratlových plotének se zobrazením, změnami extracelulární matrice (ECM) a reakcemi na bolest hodnocenými po 12 týdnech, aby potvrdil změny ve struktuře a funkci, stejně jako bolest vyvolanou terapeutickou intervencí.

Předoperační a poléčebné hodnocení bolesti zahrnovalo mikropočítačovou tomografii (mikro-CT), magnetickou rezonanci (MRI), mechanické testy, barvení Alciánovou modří (AB) a pikrosirovou červení (PSR), test dimethylmethylenovou modří a imunohistochemii (IHC ) ).

Studie zahrnovala chirurgickou techniku, při které výzkumníci podkožně injikovali buprenorfin ER myším ke kontrole pooperační bolesti.

Tým prováděl hodnocení chování před operací a každé dva týdny od čtyř do dvanácti týdnů po operaci pomocí různých technik, jako je test na otevřeném poli, studená deska, zavěšení ocasu a zavěšení drátu.

Test v otevřeném poli hodnotil spontánní aktivitu myší; testy na studených plotnách měřily tepelnou hyperalgezii; Testy zavěšení ocasu měřily axiální bolest; a testy zavěšení drátu měřily pevnost.

Dvanáct týdnů po operaci tým zvířat pitval bederní páteře pomocí sledování stehenních nervů a tepen k identifikaci meziobratlových plotének mezi L4 a L5, L5 a L6 a L6 a S1 IVD. Použili L5/L6 IVD k vyhodnocení histologie a stanovení obsahu glykosaminoglykanu (GAG).

FOXF1 eEV významně snížily reakce na bolest a zároveň obnovily strukturu a funkci IVD, včetně zlepšení výšky ploténky, hydratace tkání, obsahu proteoglykanů a mechanických vlastností.

Studie se zaměřila na uvolňování eEV naložených FOXF1 z primárních fibroblastů transfekovaných transkripčním faktorem FOXF1. Kvantitativní RT PCR prokázala významný nárůst hladin transkriptu mRNA FOXF1 a hladin mRNA transkribované plné délky FOXF1 ve srovnání s buňkami transfekovanými pCMV6.

Terapie FOXF1 eEV může snížit reakce na bolest u modelu myši s lumbální punkcí disku po dobu až 12 týdnů. Samice myší vykazovaly delší doby akvizice ve skupině léčené FOXF1 než ve skupině s lézí, která trvala alespoň 12 týdnů po léčbě.

Terapie FOXF1 eEV zlepšila hydrataci a výšku IVD tkáně u zraněných a degenerativních zvířat in vivo při zachování úrovní hydratace a T2 vážené intenzity IVD obrazu.

Tým však pozoroval snížení výšky disku u zraněných zvířat a zvířat léčených pCMV6 eEV. U myší léčených FOXF1 eEV nedošlo 12 týdnů po léčbě ke snížení výšky disku. Pohlaví neovlivnilo funkční výsledky.

FOXF1 eEVs obnovily mechanickou funkci poškozených a degenerovaných IVD in vivo. Při axiálním namáhání vykázaly IVD ošetřené FOXF1 eEV vyšší normalizovanou tuhost NZ ve srovnání s poškozenými IVD.

Za podmínek tečení vykazovaly poškozené IVD zvýšené normalizované posuvy při tečení, což ukazuje na pokles normalizované elastické tuhosti při tečení.

Výsledky ukazují, že snížení obsahu GAG v poškozených IVD zvyšuje mechanickou flexibilitu, ale terapie eEV zabraňuje ztrátě glykosaminoglykanů a následným změnám mechanické funkce.

FOXF1 eEV způsobily strukturální a funkční změny v IVD zvýšením hladin proteoglykanů a GAG.

Výsledky studie ukázaly, že eEV nabité vývojovými transkripčními faktory mohou léčit bolestivá kloubní onemocnění, jako je DBP, tím, že dodávají tyto transkripční faktory do degenerativních a bolestivých IVD kloubů.

Tato strategie může pomoci snížit strukturální a funkční abnormality způsobené onemocněním a také regulovat reakce na bolest specifické pro pohlaví.

Výzkumníci také doporučili použití vývojových transkripčních faktorů, jako je FOXF1, k přeměně degenerativních NP buněk do proanabolického stavu in vivo. K určení jeho terapeutické účinnosti je zapotřebí další výzkum.