Nevirová genová terapie nabízí naději pro chronickou bolest zad

V nedávné studii publikované v časopise Biomaterials vyvinuli vědci novou nevirovou genovou terapii k léčbě diskogenní bolesti zad (DBP) dodáním transkripčního faktoru Forkhead Box F1 (FOXF1) pomocí geneticky modifikovaných extracelulárních vezikul (eEV) do degenerativních meziobratlových plotének (IVD) in vivo.

Chronická bolest dolní části zad (LBP) je rostoucím globálním problémem v důsledku stárnoucí populace a zhoršujících se problémů s opioidy. Současné léčebné postupy zahrnují krátkodobou úlevu nebo drahé chirurgické zákroky, což zdůrazňuje potřebu nenávykových a méně invazivních terapií.

Současné biologické přístupy, včetně podávání růstových faktorů, buněčné terapie a virové genové terapie, mohou snížit degeneraci u zvířecích i lidských modelů. Přímé aplikaci těchto přístupů však mohou bránit problémy, jako jsou krátkodobé účinky, nízká dlouhodobá účinnost a zbytečná imunogenicita a onkogenita.

V této studii vědci zavedli nevirovou genovou terapii pro degeneraci meziobratlové ploténky (IVD) s použitím FOXF1-eEV.

Výzkumníci transfekovali primární myší embryonální fibroblasty (PMEF) plazmidy obsahujícími FOXF1 nebo pCMV6 jako kontrolu a charakterizovali vzorky eEV pomocí testu sledování nanočástic (NTA).

Efektivní zavádění molekulárního nákladu do eEV posoudili pomocí kvantitativní reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (qRT-PCR) a konvenční PCR. Analýza Western blot identifikovala proteiny FOXF1 a specifické pro EV ve formacích eEV. Tým použil plazmidy, které zesilují horní a dolní polylinkerové oblasti, k určení přítomnosti plazmidové DNA FOXF1 v dárcovských buňkách a generoval eEV.

Zkoumali mRNA v plné délce produkovanou z plazmidové DNA v eEV a dárcovských buňkách.

Výzkumníci vytvořili extracelulární vezikuly s transkripčními faktory pro obnovení funkce tkání a změnu reakcí na bolest v zvířecím modelu DBP.

Identifikovali EV pro transport a distribuci FOXF1 do poškozených meziobratlových plotének v myším modelu diskogenní bolesti zad, aby určili inhibici degenerace meziobratlové ploténky ze strany FOXF1 eEV.

Tým kombinoval biomechanické testování meziobratlových plotének myší se zobrazováním, změnami extracelulární matrix (ECM) a reakcemi na bolest hodnocenými po 12 týdnech, aby potvrdil změny ve struktuře a funkci, stejně jako bolest, vyvolané terapeutickým zásahem.

Předoperační a pooperační hodnocení bolesti zahrnovalo mikropočítačovou tomografii (mikro-CT), magnetickou rezonanci (MRI), mechanické testování, barvení Alciánovou modří (AB) a Picrosiriusovou červení (PSR), test s dimethylmethylenovou modří a imunohistochemii (IHC).

Studie zahrnovala chirurgickou techniku, při které vědci podávali myším subkutánně buprenorfin ER ke kontrole pooperační bolesti.

Tým prováděl behaviorální vyšetření před operací a každé dva týdny od čtyř do dvanácti týdnů po operaci s využitím různých metod, včetně testu otevřeného pole, testu studené destičky, zavěšení na ocas a zavěšení na drátě.

Test otevřeného pole hodnotil spontánní aktivitu myší; testy na studené ploténce měřily tepelnou hyperalgezii; testy zavěšení na ocas měřily axiální bolest; a testy zavěšení na drát měřily sílu.

Dvanáct týdnů po operaci tým preparoval bederní páteř zvířat pomocí trasování femorálních nervů a tepen, aby identifikoval meziobratlové ploténky mezi L4 a L5, L5 a L6 a L6 a S1 IVD. Použili IVD L5/L6 k posouzení histologie a stanovení obsahu glykosaminoglykanů (GAG).

FOXF1 eEV významně snížily bolestivé reakce a zároveň obnovily strukturu a funkci meziobratlového chrupu, včetně zlepšení výšky ploténky, hydratace tkáně, obsahu proteoglykanů a mechanických vlastností.

Studie se zaměřila na uvolňování eEV s obsahem FOXF1 z primárních fibroblastů transfekovaných transkripčním faktorem FOXF1. Kvantitativní RT PCR prokázala významný nárůst hladin transkriptů mRNA FOXF1 a hladin mRNA FOXF1 v plné délce transkribované genu ve srovnání s buňkami transfekovanými pCMV6.

Terapie FOXF1 eEV může u myší v modelu punkce bederní ploténky snížit bolestivé reakce až na 12 týdnů. Samice myší vykazovaly ve skupině léčené FOXF1 delší dobu záchvatů než ve skupině s poraněním, která trvala nejméně 12 týdnů po léčbě.

Terapie FOXF1 eEV zlepšila hydrataci a výšku tkáně IVD u poraněných a degenerativních zvířat in vivo a zároveň zachovala hladinu hydratace a intenzitu T2 váženého obrazu IVD disku.

Tým však pozoroval snížení výšky disku u poraněných zvířat a zvířat léčených pCMV6 eEV. Myši léčené FOXF1 eEV nevykazovaly žádné snížení výšky disku 12 týdnů po léčbě. Pohlaví neovlivnilo funkční výsledky.

FOXF1 eEV obnovily mechanickou funkci poškozených a degenerovaných meziobratlových vazů in vivo. Při axiálním namáhání vykazovaly IVD ošetřené FOXF1 eEV vyšší normalizovanou tuhost NZ ve srovnání s poškozenými IVD.

Za podmínek tečení vykazovaly poškozené IVD zvýšené normalizované creepové posuny, což naznačuje pokles normalizované elastické tuhosti při tečení.

Výsledky ukazují, že snížení obsahu GAG v poškozených meziobratlových dlahách zvyšuje mechanickou flexibilitu, ale terapie eEV zabraňuje ztrátě glykosaminoglykanů a následným změnám mechanické funkce.

FOXF1 eEV indukovaly strukturální a funkční změny v IVD zvýšením hladin proteoglykanů a GAG.

Výsledky studie ukázaly, že eEV s vývojovými transkripčními faktory mohou léčit bolestivá onemocnění kloubů, jako je DBP, a to dodáním těchto transkripčních faktorů do degenerativních a bolestivých kloubů pomocí IVD.

Tato strategie může pomoci snížit strukturální a funkční abnormality způsobené onemocněním a regulovat bolestivé reakce genderově specifickým způsobem.

Výzkumníci také doporučili použití vývojových transkripčních faktorů, jako je FOXF1, k přesunu degenerativních NP buněk do proanabolického stavu in vivo. Pro stanovení jeho terapeutické účinnosti jsou zapotřebí další studie.