Použití buněčných technologií ke zlepšení vzhledu jizev

Moderní věda se vyznačuje rychlým rozvojem řady příbuzných oborů, sjednocených pod obecným názvem „biotechnologie“. Tato část vědy, založená na nejnovějších výsledcích v oblasti biologie, cytologie, molekulární genetiky, genetického inženýrství a transplantologie, si klade za cíl využít obrovský potenciál, který je vlastní rostlinným a živočišným buňkám – základním strukturním jednotkám všech živých organismů. „Živá buňka je hotový biotechnologický reaktor, ve kterém se realizují nejen procesy vedoucí k tvorbě konečného produktu, ale i řada dalších, které pomáhají udržovat katalytickou aktivitu systému na vysoké úrovni,“ – John Woodward, 1992. Počátek buněčné vědy byl položen v roce 1665, kdy anglický fyzik R. Hooke vytvořil první mikroskop a objevil buňky – celuly („buňky“) v korku. V roce 1829 M. Schleiden a T. Schwann zdůvodnili „buněčnou teorii“, která dokázala, že všechny živé organismy se skládají z buněk. V roce 1858 R. Virchow dokázal, že všechny nemoci jsou založeny na porušení strukturální organizace a metabolismu buněk. Stal se zakladatelem „buněčné patologie“. Zásadní přínos k vědě o buňce učinili v letech 1907-1911 R. Harrison a A. A. Maximov, kteří prokázali možnost kultivace buněk mimo tělo. Jejich práce ukázala, že pro kultivaci buněk je nutné mechanicky oddělit živočišné tkáně a části rostlin na malé kousky. Pro izolaci buněk se tkáně řežou ostrým nožem nebo mikrotomem na tenké řezy, přibližně 0,5-1,0 mm. Fyzikální oddělení buněk se nazývá imobilizace. Izolované buňky se získávají enzymatickou disperzí kousků rostlin nebo tkání. Po rozemletí ostrými nůžkami se kousky ošetří trypsinem nebo kolagenázou, čímž se získá suspenze - suspenze jednotlivých buněk nebo jejich mikroagregátů ve speciálním médiu. K imobilizaci rostlinných buněk se široce používají alginátové gely (alginát vápenatý). Bylo prokázáno, že imobilizované rostlinné a živočišné buňky si zachovávají schopnost biosyntézy. Produkty buněčné biosyntézy se v buňkách hromadí, k jejich expresi dochází buď spontánně, nebo za pomoci speciálních látek, které podporují zvýšenou propustnost buněčných membrán.

Kultivace živočišných buněk je mnohem složitější proces než kultivace rostlinných buněk, který vyžaduje speciální moderní vybavení, špičkové technologie, přítomnost různých médií, růstových faktorů určených k zachování životaschopnosti buněk a jejich udržení ve stavu vysoké funkční aktivity. Bylo zjištěno, že většina buněk pevných tkání, jako jsou tkáně ledvin, jater a kůže, je povrchově závislá, takže je lze kultivovat in vitro pouze ve formě tenkých vrstev nebo monovrstev přímo spojených s povrchem substrátu. Životnost, proliferace a funkční stabilita buněk získaných enzymatickou disperzí tkání do značné míry závisí na substrátu, na kterém jsou pěstovány. Je známo, že všechny buňky získané z tkání obratlovců mají negativní povrchový náboj, takže pro jejich imobilizaci jsou vhodné kladně nabité substráty. Izolované buňky získané přímo z celých tkání lze udržovat v primární kultuře v imobilizovaném stavu při zachování vysoké specificity a citlivosti po dobu 10–14 dnů. Imobilizované, povrchově závislé buňky hrají dnes v biologii významnou roli, zejména v klinickém výzkumu. Používají se ke studiu cyklů buněčného vývoje, regulace jejich růstu a diferenciace, funkčních a morfologických rozdílů mezi normálními a nádorovými buňkami. Imobilizované buněčné monovrstvy se používají v biotestech, pro kvantitativní stanovení biologicky aktivních látek a také pro studium vlivu různých léků a toxinů na ně. Lékaři všech specializací projevují velký zájem o buňku jako terapeutické činidlo již po celá desetiletí. Buněčné technologie se v současné době tímto směrem rychle rozvíjejí.

Počátek tkáňové a buněčné terapie je spojen se jménem slavného ruského vědce V. P. Filatova, který v roce 1913 položil základy doktríny tkáňové terapie a studoval výsledky transplantací rohovky od zdravých dárců pacientům s kataraktou. Při práci s transplantáty rohovky zjistil, že rohovka uchovávána v chladu po dobu 1-3 dnů při teplotě -2-4 stupně Celsia se lépe uchytí než čerstvá. Byla tak objevena vlastnost buněk vylučovat za nepříznivých podmínek některé látky, které stimulují životně důležité procesy v transplantovaných tkáních a regenerační v tkáních příjemce. Tkáně a buňky oddělené od těla jsou ve stavu stresu, tj. zpomalují životní aktivitu. Zastavuje se v nich krevní oběh, a tím i výživa. Dýchání tkání je extrémně obtížné, inervace a trofika jsou narušeny. Buňky, které se nacházejí v novém kvalitativním stavu a přizpůsobují se novým podmínkám existence, produkují speciální látky s léčivými vlastnostmi. Tyto látky neproteinové povahy V. P. Filatov nazval biogenními stimulanty. Spolu s V. V. Skorodinskou zjistil, že materiál ze zvířat a rostlin lze volně autoklávovat při teplotě 120 °C po dobu jedné hodiny po uchování v nepříznivých podmínkách a tyto materiály nejenže neztratily aktivitu, ale naopak ji zvýšily, což bylo vysvětleno uvolňováním biologických stimulantů z konzervovaných tkání. Kromě toho ztratily antigenní vlastnosti, což významně snížilo možnost odmítnutí. Konzervovaný sterilní materiál byl do těla zaveden implantací (plantací) pod kůži nebo formou injekcí extraktů s odpovídajícími výsledky. Bylo také zjištěno, že fetální tkáně obsahují výrazně větší množství biologicky aktivních látek než tkáně dospělých jedinců a některé faktory se nacházejí pouze v embryích. Naočkované fetální tkáně nejsou organismem příjemce vnímány jako cizí kvůli absenci proteinů zodpovědných za druhovou, tkáňovou a individuální specificitu (proteiny hlavního histokompatibilního komplexu) v cytoplazmatických membránách. V důsledku toho inokulace zvířecích fetálních tkání do lidského organismu nespustí mechanismy imunitní ochrany a reakce nekompatibility a odmítnutí. VP Filatov ve své lékařské praxi široce používal lidskou placentu a kůži. Léčebné kúry sestávaly z 30–45 injekcí tkáňových extraktů a 1–2 implantací autoklávovaných tkání.

Poté, co zahájil svůj výzkum s lidskými a zvířecími tkáněmi a buňkami, přenesl své zobecnění do rostlinného světa. Prováděl experimenty s živými částmi rostlin (aloe, jitrocel, agáve, natě řepy, třezalka tečkovaná atd.) a vytvořil pro ně nepříznivé podmínky tím, že umístil nařezané listy na tmavé místo, protože rostlina pro své životní funkce potřebuje světlo. Biogenní stimulanty také izoloval z bahna a rašeliny ústí řeky, protože bahno a rašelina se tvoří za účasti mikroflóry a mikrofauny.

Tkáňová terapie se dočkala nového vývoje koncem 70. let, kdy znalosti a zkušenosti nashromážděné v průběhu desetiletí umožnily využívat živočišné a rostlinné tkáně a buňky na kvalitativně nové úrovni k léčbě lidí a prodloužení jejich aktivního života. V některých domácích i řadě zahraničních klinikách se tak ženy ve fyziologické menopauze s klimakterickým syndromem nebo na pozadí ovariektomie začaly podrobovat tkáňové terapii fetálními tkáněmi placenty, hypotalamu, jater, vaječníků, brzlíku a štítné žlázy, aby se zpomalil proces stárnutí, rozvoj aterosklerózy, osteoporózy, dysfunkce imunitního, endokrinního a nervového systému. V jedné z nejprestižnějších gerontokosmetologických klinik v západní Evropě se pro stejné účely již několik desetiletí používají injekce extraktů získaných z fetálních tkání pohlavních žláz beranů.

I v naší zemi našla široké uplatnění biostimulační léčba. Donedávna byly pacientům s různými onemocněními aktivně předepisovány injekce extraktů z placenty, aloe, kalanchoe, rozchodníku velkého (biosed), FiBS, peloidního destilátu, peloidinu, rašeliny, humisolu připraveného podle metody V. P. Filatova. V současné době je téměř nemožné tyto vysoce účinné a levné domácí tkáňové přípravky živočišného, rostlinného a minerálního původu koupit v lékárnách.

Základem pro získávání různých biogenních přípravků z lidských tkání a orgánů dovážené produkce, jako je rumalon (z chrupavčité tkáně a kostní dřeně), aktovegin (z telecí krve), solcoseryl (extrakt z dobytka), ale i domácí přípravky - sklivec (ze sklivce skotu), kerakol (z rohovky skotu), splenin (ze sleziny skotu), epithalamin (z epithalamo-epifyzeální oblasti), je také výzkum V. P. Filatova. Sjednocující vlastností všech tkáňových přípravků je celkový účinek na celé tělo jako celek. „Tkáňová terapie“ akademika V. P. Filatova tak tvořila základ pro většinu moderních vývojů a směrů v chirurgii, imunologii, porodnictví a gynekologii, gerontologii, kombustiologii, dermatologii a kosmetologii, které se týkají buňky a produktů její biosyntézy.

Problém transplantace tkání se lidstva týká již od starověku. Tak v Ebersově papyru, datovaném 8 000 lety př. n. l., se již zmiňuje o použití transplantace tkání k vyrovnání defektů v jednotlivých oblastech těla. V „Knize života“ indického vědce Sushruty, který žil 1 000 let př. n. l., je podrobný popis obnovy nosu z kůže tváří a čela.

Potřeba dárcovské kůže rostla úměrně s nárůstem počtu plastických a rekonstrukčních operací. V tomto ohledu se začala využívat kůže z kadaverů a plodů. Vznikla potřeba zachovat dárcovské zdroje a najít způsoby, jak nahradit lidskou kůži zvířecími tkáněmi, a různé možnosti modelování kůže. A právě tímto směrem vědci pracovali, když v roce 1941 P. Medovar poprvé prokázal zásadní možnost růstu keratinocytů in vitro. Další důležitou etapou ve vývoji buněčných technologií byla práce Karaseka M. a Charltona M., kteří v roce 1971 provedli první úspěšnou transplantaci autologních keratinocytů z primární kultury na králičí rány s použitím kolagenového gelu jako substrátu pro kultivaci CC, což zlepšilo proliferaci buněk v kultuře. J. Rheinvvald, H. Green vyvinuli technologii pro sériovou kultivaci velkého množství lidských keratinocytů. V roce 1979 Green a jeho spoluautoři objevili možnosti terapeutického využití buněčné kultury keratinocytů při obnově kůže v případech rozsáhlých popálenin, načež tuto neustále zdokonalovanou techniku začali používat chirurgové v popáleninových centrech v zahraničí i u nás.

V procesu studia živých buněk bylo zjištěno, že buňky produkují nejen biogenní stimulátory neproteinového původu, ale také řadu cytokinů, mediátorů, růstových faktorů a polypeptidů, které hrají důležitou roli v regulaci homeostázy celého organismu. Bylo zjištěno, že různé buňky a tkáně obsahují peptidové bioregulátory, které mají široké spektrum biologického účinku a koordinují procesy vývoje a fungování mnohobuněčných systémů. Začala éra používání buněčných kultur jako terapeutického činidla. V naší zemi se v kombustiologii v posledních desetiletích uplatňuje transplantace suspenze fibroblastů a vícevrstvých keratinocytových buněčných vrstev. Takový aktivní zájem o transplantaci kožních buněk pacientům s popáleninami je vysvětlen potřebou rychlého uzavření velkých popáleninových povrchů a nedostatkem dárcovské kůže. Možnost izolace buněk z malého kousku kůže schopného pokrýt povrch rány 1000 nebo dokonce 10 000krát větší než plocha dárcovské kůže se ukázala jako velmi atraktivní a důležitá pro kombustiologii a pacienty s popáleninami. Procento uchycení keratinocytové vrstvy se liší v závislosti na oblasti popáleniny, věku a zdravotním stavu pacienta od 71,5 do 93,6 %. Zájem o transplantaci keratinocytů a fibroblastů je spojen nejen s možností rychlého uzavření kožního defektu, ale také s tím, že tyto transplantáty mají silný biologicky aktivní potenciál pro zlepšení vzhledu tkání získaných v důsledku transplantace. Tvorba nových cév, úleva od hypoxie, zlepšená trofika, urychlené zrání nezralé tkáně - to je morfofunkční základ těchto pozitivních změn, ke kterým dochází v důsledku uvolňování růstových faktorů a cytokinů transplantovanými buňkami. Díky zavedení progresivních buněčných technologií pro transplantaci mnohobuněčných vrstev autologních a alogenních keratinocytů a fibroblastů na velké povrchy ran do lékařské praxe byli kombustiologové schopni nejen snížit úmrtnost obětí popálenin s vysokým procentem kožních lézí, ale také kvalitativně zlepšit jizvovou tkáň, která nevyhnutelně vzniká v místě popálenin stupně IIb, IIIa a b. Zkušenosti kombustiologů získané při ošetřování ran u pacientů s popáleninami naznačily myšlenku využití již modifikované Greenovy metody v dermatochirurgické praxi pro různé kožní a kosmetické patologie (trofické vředy, vitiligo, névy, bulózní epidermolýza, odstraňování tetování, kožní změny související s věkem a ke zlepšení vzhledu jizev).

Použití alogenních keratinocytů v chirurgii, kombustiologii a dermatokosmetologii má oproti použití autologních keratinocytů řadu výhod, protože buněčný materiál lze předem připravit v neomezeném množství, konzervovat a v případě potřeby použít. Je také známo, že alogenní keratinocyty (KK) mají sníženou antigenní aktivitu, protože při kultivaci in vitro ztrácejí Langerhansovy buňky, které jsou nositeli antigenů HLA komplexu. Použití alogenních KK je podpořeno i skutečností, že po transplantaci jsou podle různých autorů nahrazeny autologními do 10 dnů až 3 měsíců. V tomto ohledu byly dnes v mnoha zemích vytvořeny buněčné banky, díky nimž je možné získat buněčné transplantáty v požadovaném množství a ve správný čas. Takové banky existují v Německu, USA a Japonsku.

Zájem o využití buněčných technologií v dermatokosmetologii je dán skutečností, že „buněčné kompozice“ nesou silný bioenergetický a informační potenciál, díky kterému je možné dosáhnout kvalitativně nových výsledků léčby. Autokiny vylučované transplantovanými buňkami (růstové faktory, cytokiny, oxid dusnatý atd.) působí primárně na vlastní fibroblasty těla a zvyšují jejich syntetickou a proliferativní aktivitu. Tato skutečnost je pro výzkumníky obzvláště atraktivní, protože fibroblast je klíčovou buňkou dermis, jejíž funkční aktivita určuje stav všech vrstev kůže. Je také známo, že po poranění kůže kauterizací, laserem, jehlou a dalšími nástroji je kůže doplněna čerstvými kmenovými prekurzory fibroblastů z kostní dřeně, tukové tkáně a kapilárních pericytů, což přispívá k „omlazení“ zásoby tělesných buněk. Aktivně začínají syntetizovat kolagen, elastin, enzymy, glykosaminoglykany, růstové faktory a další biologicky aktivní molekuly, což vede ke zvýšené hydrataci a vaskularizaci dermis, zlepšení její pevnosti,