Experimentální práce s transplantací alogenních keratinocytů na uměle vytvořené jizvy bílých potkanů

Touha využít buněčný potenciál a potřeba najít nové účinné metody ke zlepšení estetického vzhledu jizev vedla k myšlence pokusit se prostudovat možnost transplantace keratinocytů na povrch jizev.

Aby se prokázala pravděpodobnost použití kultury keratinocytů ke zlepšení vzhledu jizev, byla provedena experimentální studie na bílých laboratorních krysách, kterým byly vytvořeny jizvové povrchy. Model jizvy potkana byl získán v důsledku hojení uměle způsobených ran na zádech, podél páteře. Krysám byly vyříznuty identické kusy kůže o velikosti 2x3 cm. 2,5 měsíce po operaci „modelování jizev“ byly krysy podrobeny dermabrazi (odstranění horních vrstev jizvy pomocí termokaustiky) a byly jim transplantovány alogenní keratinocyty, izolované z kůže mláďat krys 2-4 dny po narození.

Izolace a kultivace epidermálních buněk potkanů byla provedena v laboratoři buněčných technologií Ústavu cytologie Ruské akademie věd za použití následující technologie.

Kůže byla promyta Hankovým fyziologickým roztokem s obsahem 200 U/ml gentamicinu a nakrájena na malé kousky o ploše 0,2-0,5 cm2 ^. Kousky kůže byly inkubovány v 0,5% roztoku dispázy ve vyváženém fosfátem pufrovaném roztoku soli při 37 °C po dobu 1 hodiny. Kousky byly poté přeneseny do Dulbeccova fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a epidermis byla oddělena od dermis. Epidermis byla inkubována v 0,125% roztoku trypsinu po dobu 10-15 minut za míchání při 50 ot/min, poté byl enzymový účinek zastaven přidáním 5% fetálního bovinního séra. Jedna třetina výsledné buněčné suspenze byla použita v čisté formě pro jednu z možností transplantace na jizvy, druhá třetina byla kultivována na biokompatibilních domácích filmových povlakech „Polypor“ a třetí - na Petriho miskách bez substrátu. Operace dermabraze výsledných jizev u potkanů s následnou transplantací epidermálních buněk potkanů na ně byla provedena v éterové anestezii pomocí termálního kauteru.

V první skupině krys byly po dermabrazi na vyleštěný, fyziologickým roztokem omytý a osušený povrch jizvy umístěny sterilní kousky cambricátu, na které byla aplikována protřepaná suspenze alogenních epidermocytů krys v koncentraci 1,5 milionu buněk na 1 ml (dle Ústavu cytologie). Kousky cambricátu byly umístěny na vyleštěnou jizvu tak, aby buňky ležely na povrchu jizvy. Navrch byl umístěn obvaz z několika vrstev gázy, který byl přišit k okrajům jizvy.

Část získané buněčné suspenze byla naočkována do Petriho misek na sterilní filmy Polypore vyříznuté do tvaru misek, druhá část - na Petriho misky bez filmu. Kultivace byla provedena v médiu FAD, které se skládalo ze směsi médií DMEM a F12 v poměru 3:1 s přídavkem 10% fetálního bovinního séra, 5 μg/ml inzulínu (Sigma), 0,5 μg/ml hydrokortison-hemisukcinátu (Sigma), 10 μg/ml epidermálního růstového faktoru EGF (Cytologický ústav RAS, Petrohrad). Druhá a třetí skupina krys, každá po 7 jedincích, byly operovány 6 dní po první. Do této doby se ze suspenze naočkovaných keratinocytů v Petriho miskách vytvořily vícevrstvé vrstvy, které byly transplantovány do krys. Druhé skupině byly transplantovány epidermocyty na filmu, třetí - s vícevrstvou vrstvou bez substrátu. Po 7 dnech byly získané vícevrstvé vrstvy alogenních keratinocytů (MPALK), naseté na filmy „Polypore“, transplantovány jako kultura přímo na povrch rány. Navrch byla fólie, aby se zabránilo jejímu odtržení, fixována vícevrstvým gázovým obvazem a přišita ke kůži krys.

Před transplantací keratinocytů třetí skupině krys pěstovaných bez substrátu byl PAC oddělen od dna Petriho misky ošetřením dispázou, která má schopnost selektivně narušovat dermálně-epidermální vazby. Při působení na vícevrstvou vrstvu dispáza narušuje spojení buněk bazální vrstvy se dnem Petriho misky a má mnohem menší vliv na mezibuněčná spojení, což umožňuje vrstvu zcela „odstranit“. Oddělení vícevrstvé buněčné vrstvy dispázou bylo provedeno následovně. Transportní médium bylo z Petriho misek vypuštěno, buněčné vrstvy byly třikrát promyty živným médiem obsahujícím antibiotika, zejména gentamicin (0,2 mg/ml). Vícevrstvé vrstvy byly naplněny 0,125% roztokem dispázy („Sigma“) a umístěny do termostatu, kde byly inkubovány při teplotě t=37 °C po dobu 20–30 minut. Vzhled bílého okraje odlupujícího se po obvodu vrstvy je indikátorem začátku procesu jejího oddělování od okrajů a dna Petriho misky. Několik minut po zahájení procesu oddělování byl roztok dispázy scezen, epitelové vrstvy byly 2–3krát promyty médiem. Na povrch epidermální vrstvy byl aplikován kousek sterilního obvazu na rány „Lita-color“ nastříhaný na velikost kalíšku, na který byla přilepena vrstva oddělená dispázou, dodatečně odloupnutá ze dna kalíšku špachtlí. Pomocí oční pinzety byla vrstva spolu s povlakem ubrousku „Lita-color“ (Rusko) odtržena od dna Petriho misky a opatrně přenesena na připravený povrch jizvy. Ubrousky „Lita-color“ obsahují gentamicin a exolin (kolagenový extrakt), které po navlhčení zbytky růstového média a následně fyziologickým roztokem nabobtnaly a staly se moderním obvazem na rány, který díky své absorpční struktuře poskytuje dobrou ochranu před vnější infekcí a rychlé hojení.

Na fólie Polypore a ubrousky Lita-color byly aplikovány vícevrstvé gázové obvazy a pro silnější fixaci byly přišity ke kůži krys. Každá krysa byla umístěna do samostatné klece, aby se vytvořily optimální podmínky pro její udržení a uchycení transplantovaných keratinocytů. Obvazy krys, kterým byla transplantována suspenze a vícevrstvá vrstva epidermocytů odstraněných dispázou, byly několikrát denně navlhčeny sterilním fyziologickým roztokem, aby se vytvořily co nejpříznivější podmínky pro uchycení buněk. Vzhledem k tomu, že fólie Polypore byla nepropustná pro vodu, obvazy krys ve druhé skupině nebyly navlhčeny, což byla jedna z výhod oproti transplantacím bez fólií. Obvazy byly odstraněny po 10 dnech. Klinický obraz jizev po transplantaci buněk se od jizev bez transplantace jen málo lišil, s výjimkou jejich růžovější barvy (v důsledku dermabraze) a většího olupování. Tato skutečnost naznačuje, že bezprostředně po odpadnutí obvazů z rány s MPC nedošlo v jizvě k žádným změnám.

Odběr bioptického materiálu od krys.

Po 1, 2, 5 a 9 měsících po transplantaci alogenních keratinocytů potkanů na leštěné jizvy bílých krys byl odebrán materiál k histologickému, cytomorfologickému a elektronově mikroskopickému vyšetření. Jako kontrola byly odebrány vzorky normální kůže potkanů a jizvy bez transplantace buněk. Anestezie potkanů byla provedena etherovou anestezií.

Po anestezii byly z označených oblastí odebrány kousky jizevnaté tkáně, do kterých byly pomocí bioptické sondy o průměru 2 mm transplantovány keratinocyty a umístěny do 2,5% roztoku glutaraldehydu pro přípravu materiálu k elektronově mikroskopickému vyšetření. Kousky tkáně odebrané k histologickému vyšetření byly umístěny do 10% neutrálního roztoku formalínu, následně prohnaty alkoholy a zalité do parafínu, následovalo nařezání ultratenkých řezů a jejich prohlížení ve světelně-optickém mikroskopu.

Kontrola I. Normální kůže potkanů.

Aby bylo možné vidět rozdíl mezi mikroskopickým obrazem normální jizvou pozměněné kůže potkanů a jizvami v určitých časech po transplantaci MPC, jsou ve všech fázích této studie uvedeny jejich fotografie a popisy.

Epidermis normální kůže se skládá ze 7-9 vrstev buněk. Stratum corneum má střední tloušťku. Na některých místech se skládá z 6-8 vrstev rohovitých šupin. Bazální vrstva je reprezentována válcovými buňkami s velkými, světlými, pravidelně tvarovanými jádry a několika jadérky. Desmosomální spojení mezi buňkami a s bazální membránou jsou jasně vyjádřena. Pod dobře definovanou bazální membránou, která má v subepidermální vrstvě malé výrůstky, se rovnoběžně s ní nacházejí jemné svazky kolagenních a elastinových vláken, mezi nimiž se nacházejí protáhlé fibroblasty a malé cévy. V hlubších vrstvách leží svazky kolagenních a elastinových vláken v různých směrech. Mezi nimi je mnoho cév s tenkými stěnami stejného kalibru, buněčné elementy (fibroblasty, žírné buňky, leukocyty). Velké množství vlasových folikulů a mazových žláz.

Kontrola 2. Jizva po potkanovi, 2 měsíce stará.

Klinický obraz. Jizvy jsou světle růžové, olupují se, místy zůstávají krusty. Jejich plocha se zmenšila v důsledku kontrakce kolagenových vláken a dosáhla velikosti přibližně 3,0-3,5 cm ^. Kožní výrůstky chybí.

Mikroskopický obraz. Epidermis se skládá ze 3-5 vrstev buněk, složených, reprezentovaných zaoblenými bazálními buňkami, jednou řadou subulátních, 1-2 řadami granulárních s keratohyalinovými zrny v horní vrstvě, jsou zde oblasti intracelulárního edému. Stratum corneum je nerovnoměrně změněno z velmi tenké na ztluštělou. Je patrné zvrásnění jizvy v důsledku (kontrakce) jizvové tkáně. Záhyby pronikají až k papilární vrstvě a vytvářejí dojem papil. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Bazální membrána není všude patrná. Ve spodní části subepidermální a hlubších vrstvách se nacházejí cévy se silnou, uvolněnou stěnou, mnohé jsou opuštěné, se stází. Kolem cév dochází k hromadění makrofágů, fibroblastů. Makrofágy obklopují erytrocyty uvolněné z kapilár a fagocytují je. V povrchnějších vrstvách se nacházejí drobné kapiláry. Pod epidermis jsou volně uložena kolagenová vlákna. V hlubší vrstvě jizvy se nacházejí hrubé svazky kolagenových vláken, mezi nimiž je mnoho fibroblastů.

Jizva po kryse jeden měsíc po transplantaci keratinocytů potkana.

Klinický obraz. Jizvy jsou růžové, jejich plocha se zmenšila, zejména v průměru, a je v průměru 2,5-3 cm ^2. Chybí vlasy a mazové žlázy.

Data mikroskopického vyšetření materiálu získaného od krys s transplantací MPaLK na film a MPaLK bez substrátu jsou prakticky identická. Čistě technicky je však práce s MPaLK bez substrátu mnohem složitější a pracnější než při pěstování MPaLK na substrátu, proto jsme při dalším studiu problematiky transplantace keratinocytů do jizev použili jako základ pro pěstování vícevrstvý cambric („substráty“).

Mikroskopický obraz. Je zaznamenáno ztluštění epidermis na 15-20 vrstev, téměř do středu mají keratinocyty úzký, protáhlý, vertikální tvar a kompaktní uspořádání. Bazální buňky jsou uspořádány v nerovné linii. Jejich jádra jsou světlá, velká, zaoblená s jedním nebo dvěma jadérky, což naznačuje jejich vysokou syntetickou a proliferativní aktivitu. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Trnová vrstva je dobře vyvinutá, skládá se ze 3-5 vrstev zaoblených buněk, jsou zde 2 jadérka.

Bezprostředně pod bazální membránou se nacházejí hustě umístěné tenké svazky kolagenních vláken, paralelně s nimi se nachází velké množství opuštěných cév, hlubší kolagenní vlákna jsou hrubší, shromážděná v hustých svazcích. Mnoho velkých fibroblastů, žírných buněk (2-3 v zorném poli), makrofágů, leukocytů a opuštěných cév, jejichž stěny jsou uvolněné, kolem nich jsou volně umístěná kolagenní vlákna. V některých cévách dochází ke stázi, diapedéze formovaných elementů. Kolem cév se nacházejí fibroblasty, jednotlivé lymfocyty. Kožní výrůstky chybí.

Při transplantaci suspenze keratinocytů na vyleštěnou jizvu se mikroskopický obraz liší od předchozího. U většiny zvířat je epidermis tenká a skládá se z 5-6 vrstev buněk. Spodní vrstva se skládá z buněk nepravidelného, polygonálního tvaru s jádry kulatého až nepravidelného tvaru. Stav subepidermální vrstvy je podobný jejímu stavu ve skupině zvířat bez transplantace MPALK.

V tomto případě můžeme hovořit buď o zpoždění procesů doprovázejících transplantaci buněk, nebo o velké ztrátě buněk transplantovaných ve formě suspenze. Proto byl učiněn závěr o nevhodnosti korekce jizev transplantací keratinocytů ve formě suspenze.

Jizva po kryse 2 měsíce po transplantaci keratinocytů potkana.

Klinický obraz. Jizva vypadá tenká a jemná. Místy se objevují olupující se a šupinaté skvrny.

Mikroskopický obraz. Stratum corneum je ztluštělé, místy hyperkeratóza. Epidermis je ztluštělá, skládá se z 12-20 řad buněk. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Jemná kolagenová vlákna pod epidermis leží poměrně hustě. V hlubších vrstvách jizvy jsou shromážděna do velkých hrubých svazků. V subepidermální vrstvě se objevují nové cévní formace. Ve spodních vrstvách jizvové tkáně je mnoho opuštěných cév umístěných rovnoběžně s povrchem epidermis. Velké fibroblasty jsou rovnoměrně rozloženy v tloušťce jizvy, jsou zde obrovské, rozvětvené makrofágy, mnoho makrofágů.

Jizva po kryse 5 měsíců po transplantaci epidermálních buněk krysy.

Klinický obraz. Jizva vypadá rovnoměrně, hladce, bez olupování, jsou zde jednotlivé chloupky, jejich hustota je větší na okraji jizev, což naznačuje marginální vrůstání vlasových folikulů do jizvy a tvorbu nových vlasových folikulů. Plocha jizev se nadále zmenšuje.

Mikroskopický snímek. Epidermis je stále silná (15-20 vrstev, místy až 30), v horních vrstvách je vyplněna keratohyalinovými zrny. Bazální membrána je jasně viditelná. Pod ní volně leží kolagenní vlákna. Ve spodních vrstvách je kolagen mohutnější a hustěji uspořádaný. Mezi kolagenními svazky je mnoho kapilár. V horních vrstvách se počet opuštěných cév snížil. Spojení epidermis a dermis je mírně zvlněné. Na některých místech jsou v jizvové tkáni hluboké epidermální výrůstky. Mezi kolagenními vlákny jsou viditelné nově vytvořené cévy. Objevují se jednotlivé vlasové folikuly a mazové žlázy.

Jizva po kryse 9 měsíců po transplantaci epidermálních MPA buněk potkana.

Klinický obraz. Jizvy se ve srovnání s dřívějším obdobím výrazně zmenšily, jejich plocha je v průměru asi 1,5-2,0 cm2 ^. Jizvy jsou nerovnoměrně pokryty jemnými chloupky, zejména na periferii. Přetrvává drobné jemné olupování.

Mikroskopický obraz.

Epidermis se ztenčila, je reprezentována 6-8 řadami buněk, strukturou se podobá epidermis normální kůže krysy, pouze hustota buněk je o 1 mm vyšší a jsou menší. Bazální vrstva se skládá z malých kulato-válcových buněk. Bazální membrána je dobře vyjádřena, hemidesmosomy jsou jasně viditelné. Je zaznamenána přítomnost epidermálních výrůstků v subepidermální vrstvě. Papilární vrstva je vyjádřena po celé délce jizvy. Tato fakta naznačují, že v této době je adheze transplantovaných keratinocytů s podkladovými jizvovými tkáněmi mnohem silnější. Péče o jizvy u lidí s transplantací MPALK 9 měsíců po transplantaci MPC proto může být tradiční. Pod epidermis jsou kolagenní vlákna jemnější než v hlubokých vrstvách. Objevilo se mnoho cév, zejména povrchových. Stěny větších cév jsou ztluštělé. Vlasové folikuly a mazové žlázy jsou ve velkém množství. Mikroskopický obraz připomíná tkáň podobnou dermální.

Výsledky experimentální práce a jejich diskuse.

V průběhu této práce byly keratinocyty v různých formách transplantovány na uměle vytvořené jizvy z kůže potkanů po dermabrazi - na krytí ran, jako suspenze na cambric a jako vícevrstvá vrstva bez substrátu. Práce byla provedena s cílem získat morfologická data o vlivu transplantovaných alogenních keratinocytů na jizvy a také určit optimální možnosti transplantace.

Bylo zjištěno, že všechny tři metody transplantace jsou proveditelné, ale transplantace MPAC bez substrátu je velmi pracný zákrok, při kterém může dojít k poškození MPAC, což ovlivňuje výsledky transplantace. Tato metoda transplantace navíc vylučuje práci na velkých plochách.

Transplantace suspenze keratinocytů je mnohem nákladově efektivnější metoda, nevyžaduje dlouhodobou kultivaci buněk a je jednoduchá v námi navrhované verzi s použitím sterilních cambric polotovarů, jejichž velikosti odpovídají velikosti jizev. Zpoždění terapeutického účinku při transplantaci buněčné suspenze přibližně o měsíc ve srovnání s MPC na nátěr rány není významným bodem s dobou léčby mnoho měsíců. Je známo, že při transplantaci MPC pacientům s popáleninami dochází k transformaci struktury kůže postupně a v průběhu několika let. Transplantace kultury keratinocytů na nátěry rán je nejpohodlnější a nejslibnější metodou, ale také výrazně dražší. Navíc v současné době vyžaduje hledání pokročilejších možností nátěrů, které by měly být flexibilní, hygroskopické, mít bakteriostatické nebo baktericidní vlastnosti a být biologicky neutrální pro buňky. Fólie „Polypor“ – přechodná verze domácího filmového nátěru ran, nám i přes některé nedokonalosti umožnila experimentálně studovat transplantaci keratinocytů potkanů na jizvy a vyvodit závěry o účinnosti tohoto směru léčby jizev.

Autoři, kteří transplantovali MPC na popáleninové rány, zaznamenali, že během prvního týdne po transplantaci vícevrstvé vrstvy keratinocytů na dezinfikované rány došlo k ztluštění a stratifikaci epidermis. Všechny vrstvy epidermis byly jasně viditelné. Zajímavé je, že počet buněčných vrstev v transplantátech byl o 10–30 % vyšší než v kožních biopsiích. Autoři zaznamenali výskyt keratohyalinových granulí 5. den po transplantaci MPC a bazální membrány a hemidesmosomů již 3. den.

J.Rives a kol. (1994), Paramonov BA (1996); Kuzněcov NM a kol. (1998) zjistili, že v raných stádiích po transplantaci MPC pacientům s kožními defekty v plné tloušťce po popáleninách je spojení mezi dermis a epidermis velmi slabé a má lineární tvar, papilární vrstva chybí. Do konce 2. měsíce se začínají tvořit mělké papily a kožní výrůstky, spojení mezi dermis a epidermis se zesiluje. Literární údaje naznačují, že transplantace alogenních keratinocytů na rány u pacientů s popáleninami je slibnou metodou. Přestože k odmítnutí alogenních keratinocytů dochází podle různých autorů během 10 dnů až 3 měsíců, hrají stále svou roli v hojení povrchu rány, vylučování růstových faktorů a mechanickém uzavření defektu. Předpokládá se, že MPALC mají sníženou antigenní aktivitu, protože během kultivace in vitro ztrácejí Langerhansovy buňky, což jim umožňuje dlouhodobou existenci v těle příjemce. Navíc alogenní kultura získaná z kůže mladých zdravých lidí má nesrovnatelně větší biologický potenciál než autologní kultura pacientů po úrazu.

Hlavním cílem naší studie bylo zjistit, zda se alogenní keratinocyty uchytí na jizvách a jaké změny nastanou v jizvové tkáni pod vlivem takového biologicky aktivního „povlaku rány“. V případě pozitivního výsledku vyvinout nejúčinnější a nejméně pracnou technologii pro tuto oblast rehabilitační medicíny.

Získaná data se v mnoha ohledech podobala literárním údajům o morfologických změnách v lidské epidermis po transplantaci alogenních keratinocytů do popáleninových ran. Existují však i významné rozdíly, a to jak z hlediska morfologického substrátu, na který transplantace probíhá, tak i z hlediska technologie. Proces tvorby bazální membrány a dermálně-epidermálních spojení (hemidesmosomy, papily) tedy probíhá v pozdější fázi ve srovnání s transplantací keratinocytů do rány bez jizevnatých změn. Zřejmě k tomu dochází v důsledku horší výživy jizvové tkáně ve srovnání s dermis nebo svalovou fascií. Jizva, zejména stará, je hustá pojivová tkáň s velmi malým počtem cév, zatímco dno popáleninové rány tvoří granulační tkáň bohatá na cévy. Je tedy zřejmé, že podmínky, za kterých dochází k transplantaci a uchycení keratinocytů, jsou naprosto odlišné. Čím více je oblast transplantace buněk vaskularizována, tím snazší je proces jejich uchycení. Z tohoto postulátu vyplývá závěr o preferenci práce s mladými jizvami, u kterých je pojivová tkáň ještě poměrně řídká a bohatá na cévy.

V důsledku této experimentální práce bylo prokázáno, že:

1. Transplantace MPALK na jizvy je možná.
2. Optimální metodou transplantace je transplantace keratinocytů na ránu.
3. Povrch jizvy by měl být vyleštěn chirurgickou laserovou dermabrazí nebo Schumannovým frézou.
4. Pod vlivem MPALK dochází k rychlé epitelizaci leštěného povrchu jizvy.
5. Čím lépe je jizva vaskularizována, tj. čím je jizva mladší, tím lepší jsou výsledky transplantace keratinocytů.
6. Pod vlivem transplantovaných keratinocytů se jizvová tkáň postupně transformuje a mění se v dermální (volnější jizvová tkáň s kožními výběžky).
7. Postupné uvolňování jizvové tkáně, počínaje subepidermální vrstvou. Zlepšuje se její vaskularizace, svazky kolagenních vláken v horní a dolní části jizvy zaujímají volnější uspořádání než v jizvové tkáni bez transplantace buněk. Objevují se vlasové folikuly a mazové žlázy. Epidermis se svou strukturou, po projití fází hypertrofie, blíží epidermis normální kůže.
8. Pozorované změny souvisejí s růstovými faktory a cytokiny vylučovanými keratinocyty, které zlepšením trofismu jizvové tkáně podporují její transformaci z hrubé vláknité tkáně na řídčí tkáň, což vede ke zlepšení vzhledu jizvy.

Na základě této studie lze tedy konstatovat, že transplantované keratinocyty mají příznivý vliv na jizvovou tkáň, což může mít praktické důsledky pro rehabilitaci pacientů s různými typy jizev.

Tato práce na krysách nám také umožnila formulovat požadavky na krytí ran, na kterých se pěstují keratinocyty.

Krytí ran by mělo být:

• biokompatibilní s buňkami,
• prodyšný,
• mají elastickou, tvarovatelnou základnu,
• být hydrofilní,
• jako léčivé přísady obsahují antibakteriální léčiva a antioxidanty, které nejsou toxické pro kultivované buňky.

Klinické výsledky biotechnologické léčby jizev.

Dříve N. Carver a kol. (1993) zjistili, že okluzivní obvazy nejlépe podporují přichycení k ráně a přežití keratinocytů, ale neumožňují tvorbu stratifikované (zralé) epidermis. Pro tvorbu stratifikované epidermis je nezbytné vzdušné prostředí. Proto bylo po přichycení vícevrstvé vrstvy navrženo po 7–10 dnech odstranit okluzivní obvaz na rány a rány ošetřovat suchými obvazy nebo ve vodě rozpustnými mastmi. Lze říci, že kvalita a vlastnosti „substrátu“, na kterém buňky rostou, jsou velmi důležitým bodem pro účinnost transplantace buněčného materiálu, a tedy i pro výsledky práce lékařů. Ideální obvaz na rány však dnes neexistuje, a to i přes množství navrhovaných možností (umělá kůže, netkaná textilie z karboxymethylcelulózy, fibrinové povlaky, polopropustné polyuretanové filmy). Důležitým bodem v této záležitosti je cena „substrátů“ (speciálních krytí ran), protože jejich vysoká cena zvyšuje celkové náklady na biotechnologickou léčbu.

Účinnost buněčných technologií byla dosud prokázána, ale bohužel jsou tyto technologie velmi drahé, zejména v zemích, kde nebyla zavedena průmyslová výroba buněčných kompozic. Země jako Spojené státy však již dlouho vybudovaly průmysl pro výrobu buněčného materiálu pro transplantaci popálenin. Zejména společnost BioSurface Technology Inc. od roku 1989 vypěstovala 37 000 vícevrstvých keratinocytových vrstev, které byly použity k léčbě 240 pacientů v 79 zemích světa (R. Odessey, 1992), přičemž 1 cm2 buněčné kultury ^stojí asi 7-8 amerických dolarů.

Technologie léčby různých kožních onemocnění a problémů má řadu rozdílů, ale jakákoli buněčná léčba je založena na získání vysoce kvalitního buněčného materiálu a jeho transplantaci.

Tento proces se skládá z následujících kroků:

• odebírání kůže od obětí (nebo od dárců),
• transport kožních laloků do biotechnologického centra,
• izolace buněk bazální vrstvy a jejich proliferace,
• růst vícevrstvých keratinocytových vrstev (MLK).
• transplantace buněčné kultury.

Hlavním problémem při provádění léčby transplantací vícevrstvých keratinocytových plátů je potřeba životaschopných buněk ve všech fázích transplantace buněk. Kousky kůže pro izolaci autologních nebo alogenních buněk by měly být co nejtenčí, protože v tomto případě se snáze oddělují mechanickými a enzymatickými metodami a získává se suspenze živých buněk pro kultivaci. Lze je získat řezáním dermatomem nebo použitím kůže očních víček, předkožky a vnitřního povrchu ramene. Vzhledem k tomu, že buňky jsou citlivé na halogeny (chlor, jód) a peroxid vodíku, nelze je použít při zpracování kůže během odběru materiálu.

Kvantitativní a kvalitativní výtěžek buněk z kožních štěpů a účinnost jejich kultivace závisí také na zdravotním stavu a věku dárce. Kromě toho musí být kožní biopsie doručeny co nejrychleji a za vhodných podmínek (prostředí, teplota) do laboratoře certifikované a akreditované pro tyto účely.

Pro skladování a transport kožních laloků lze použít Eaglovo médium nebo médium 199 s přídavkem 10% bovinního séra, médium DMEM s přídavkem 5% fetálního bovinního séra a antibiotik.

V cytologické laboratoři se kožní biopsie nejprve mechanicky rozdělí na malé kousky, které se poté zpracují pomocí enzymů: trypsinu, kolagenázy, dispázy atd.

Působením enzymů jsou desmosomy ničeny a keratinocyty se uvolňují do média ve formě jednotlivých buněk nebo agregátů sestávajících z různého počtu buněk. Pro kultivaci se používají pouze bazální keratinocyty, které se pěstují na speciálních médiích v termostatech obsahujících 5 % CO2, v Petriho miskách nebo v baňkách při t = 37 °C. Již po 48 hodinách je pozorována tvorba kolonií keratinocytů, které se postupně slévají a přeměňují se v monovrstvu. Po získání dostatečného počtu buněk se výsledná suspenze vyseje na připravené obvazy na rány a umístí se do Petriho misek. Ze suspenze se nejprve vytvoří monovrstva a poté vícevrstvá vrstva keratinocytů. Fáze procesu kultivace keratinocytů jsou schematicky znázorněny na obr. 12 (33,43,54,65).

Vznik vícevrstvé vrstvy keratinocytů vhodné k transplantaci obvykle trvá 7–10 dní. Někdy je tato doba delší, což závisí na kvalitě zdrojového materiálu (věk, zdravotní stav dárce, správnost odběru materiálu, kvalita použitého média atd.). Pokud vícevrstvá vrstva přeroste, mohou se na jejím povrchu objevit buňky s jevy apoptózy nevhodné k transplantaci. Petriho misky s vícevrstvými vrstvami keratinocytů (MLK) pěstovanými v nich na krytí ran se na kliniku dodávají ve speciálních nádobách při teplotě nejméně +15 °C.

Modifikovaná Greenova metoda pro pěstování MPC

V naší práci jsme jako krytí ran použili vícevrstvý cambric a opustili jsme fólie „Polypor“, se kterými jsme začínali v experimentu s krysami. Proto jsme na předem odtučněném a sterilním cambric vypěstovali vícevrstvé vrstvy keratinocytů, ačkoli ani to není optimální krytí ran.

Klinické studie byly provedeny na dobrovolnících v souladu s nezbytnými etickými standardy: podpis dohody a informovaného souhlasu.

1. Byla použita kultura vlastních (autologních) a bankovaných (alogenních) keratinocytů pacienta.
2. Vlastní keratinocyty pacientů byly získány z kousku kůže vyříznutého z vnitřní strany jejich paží.
3. Operace dermabraze jizev byla provedena pomocí termokauterizace, rotačních disků a erbiového laseru.
4. Byly odebrány skupiny pacientů s normotrofickými, hypotrofickými a hypertrofickými jizvami.

Technologický proces aplikace buněčné technologie pro zlepšení vzhledu kožních jizev sestával z následujících fází:

1. Výběr pacienta.
2. Vysvětlení podstaty léčby, časového rámce pro dosažení očekávaných výsledků, podpisu smlouvy a informovaného souhlasu.
3. Pacientům předepsat 2-3 týdny před operací Selmevit 1 tabletu 3krát denně, Zinctheral 1 tabletu 3krát denně.
4. Odebrání kousku kůže o délce 2,0 cm a šířce 0,7-1,0 cm z vnitřního povrchu ramene, vysoko, téměř v dolní části axilární oblasti, za účelem získání autologních keratinocytů.
5. V případech, kdy pacienti odmítli izolaci vlastních keratinocytů z důvodu možnosti vzniku lineární jizvy na vnitřním povrchu ramene, byl buněčný materiál odebrán z buněčné banky (alogenní keratinocyty).
6. Keratinocyty byly izolovány a pěstovány v laboratoři certifikované pro tento typ práce.
7. Po získání dostatečného množství MPC pro transplantaci na jizvy byl stanoven den operace na klinice, kam byl materiál přivezen ve speciálních nádobách v Petriho miskách.
8. Byla provedena operace dermabraze jizev, hemostáza, leštěný povrch byl omyt sterilním fyziologickým roztokem, vysušen a poté byly na něj na sterilní cambric transplantovány MPC „buňkami dolů“. To znamená, že buňky, které byly v MPC nahoře, se ukázaly být níže, přiléhající k leštěnému povrchu.
9. Navrch byla aplikována sterilní fólie, která byla fixována na kůži elastickým obvazem nebo elastickou náplastí Omnifix. Místo fólie lze použít indiferentní krytí ran obsahující silikon, například Mepitel, Mepiform, silikonové gelové desky.

Po 5-7 dnech se film nebo silikonový povlak odstraní. Do této doby by se všechny keratinocyty měly dostat na vyleštěnou jizvu a přichytit se k jejímu povrchu.

10. Vlhké prostředí vytvořené pod filmem a silikonovým povlakem k tomu aktivně přispívá. Zbývající cambric na jizvě od tohoto okamžiku lze namočit kuriosinem nebo chitosanovým gelem. Výsledkem je, že se druhý den vytvoří hustá krusta, kterou je pro pohodlí pacienta nejlépe fixovat elastickou, prodyšnou náplastí, například Omnifixem. Prodyšná krusta umožňuje vytvořené epidermis diferenciaci a přeměnu na zralou.

V závislosti na typu jizvy a hloubce broušení se obvaz po 8–10 dnech odmítá. V této době má epidermis o 30–40 % více buněčných vrstev než normální kůže. Bazální membrána se netvoří. Keratinocyty ztluštělé epidermis vylučují do jizvové tkáně mnoho biologicky aktivních molekul.

Úspěch biotechnologické léčby jizev do značné míry závisí na způsobu péče v pooperačním období. Buněčné kultury jsou „šetrným“ typem krytí ran a v raných stádiích po transplantaci lze IPC snadno odloupnout od podkladových tkání. Proto se pacientům doporučuje, aby po operaci s jizvou zacházeli opatrně. Po dobu 8–9 měsíců ji netřete a jemně ošetřujte studenou převařenou vodou, aby nedošlo k odtržení tenké, nově vytvořené epidermis, která nemá pevnou vazbu s podkladovými tkáněmi.

Poznámka.

Před operací a během dermabraze je použití halogenovaných antiseptik a oxidačních činidel (jodopyron, suliodopyron, jodinol, jodinát, chlorhexidin, peroxid vodíku) přípustné, před transplantací buněk je přísně kontraindikováno kvůli jejich cytotoxickému účinku. Methylenová modř a brilantní zeleň jsou také toxické pro buňky.

Aby se zabránilo infekci, zejména při práci s hypertrofickými jizvami, lze operační pole ošetřit neomycin sulfátem, polymyxinem nebo gentamicinem. Tyto přípravky nemají cytotoxický účinek na keratinocyty.

V důsledku takové léčby se dosáhne trojitého účinku.

1. Vyrovnání povrchu jizvy.
2. Vytvoření vrstvy nové epidermis normální tloušťky nad ní.
3. Transformace jizvové tkáně do tkáně podobné dermální v důsledku působení cytokinů, růstových faktorů a dalších biologicky aktivních molekul vylučovaných transplantovanými buňkami a stimulovaných jimi keratinocyty, fibroblasty a makrofágy.

Jizva se stává méně znatelnou, pružnější, objevují se v ní póry a jemné chloupky a pigmentaci lze obnovit díky přítomnosti melanocytů v IPC.

Všechny tyto pozitivní aspekty jizvy se však neprojevují okamžitě. V tomto ohledu je nutné pacienty varovat, že proces transformace jizvové tkáně na dermální tkáň probíhá pomalu a optimální výsledek takové léčby lze očekávat nejdříve za 10–14 měsíců. Bezprostředně po odmítnutí obvazů mají leštěné povrchy výraznou polychromii, čím jasnější, tím hlouběji bylo leštění provedeno. Nejmenší poškození kůže je zaznamenáno při leštění normotrofických jizev erbiovým laserem. Barva jizev a okolní kůže se obnovila během 3 až 8 týdnů. Navzdory těmto opatřením se někdy vyskytuje pooperační hyperpigmentace, která může sama odeznít během několika měsíců.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]